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Articolo metodologico

Sintesi di vescicole unilamellari giganti composte: un modello biomimetico di cellule nucleate

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DOI:

10.3791/68274

⸱

3 luglio 2025

 ,  , 
1Centre for Research in Nanotechnology & Science, Indian Institute of Technology Bombay, 2Department of Chemistry, Indian Institute of Technology Bombay, 3Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Technology Bombay

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta un metodo per la preparazione di vescicole unilamellari giganti composte (cGUV) con una struttura vescicola nella vescicola, con conducibilità elettrica personalizzata nelle regioni interne, anulari ed esterne. L'elettroformazione sintetizza semplici GUV, che vengono trasformati in stomatociti e cGUV tramite shock osmotico, fornendo un modello prezioso per lo studio della biofisica delle cellule nucleate.

Abstract

Una semplice vescicola unilamellare gigante (sGUV) è una vescicola sferica di dimensioni micron, che è composta da un doppio strato lipidico che racchiude una soluzione acquosa al suo interno ed è sospesa in un altro mezzo acquoso. Come modelli biomimetici di cellule biologiche, gli sGUV sono sistemi consolidati per studi biofisici. Tuttavia, gli sGUV imitano principalmente le cellule anucleate, limitando la loro applicazione come modelli per le cellule non nucleate. Proponiamo vescicole unilamellari giganti composte (cGUV) come modello biomimetico più appropriato per le cellule nucleate. I cGUV sono strutture vescicola nella vescicola, in cui si può presumere che i doppi strati della vescicola esterna e interna rappresentino rispettivamente la cellula e la membrana nucleare di una cellula.

In questo studio, descriviamo un metodo semplice per la sintesi di cGUV. In breve, gli sGUV sono stati generati utilizzando la composizione lipidica di DMPC e colesterolo nell'intervallo del 37-43 mol% in un mezzo di saccarosio tramite il metodo dell'elettroformazione. Questi sGUV sono stati poi sottoposti a shock osmotico introducendo una soluzione ipertonica di glucosio, innescando un'immediata transizione verso una forma somatocitica. Questo processo ha portato alla formazione di uno stato intermedio in cui le vescicole esterne e interne sono rimaste collegate attraverso un collo, determinando infine lo sviluppo della struttura vescicola-in-vescicola, nota come cGUV.

Inoltre, è noto che i GUV preparati con livelli di colesterolo più elevati nel doppio strato mostrano una ridotta permeabilità agli ioni. Questa caratteristica consente la regolazione della conducibilità nella soluzione anulare di un cGUV regolando le conducibilità del mezzo idratante, della soluzione interna attraverso il glucosio ipertonico e della soluzione esterna regolando la diluizione o l'aggiunta di mezzi conduttivi, rendendo i cGUV risultanti con conduttività controllate nelle regioni esterna, anulare e interna, rilevante per gli studi sul campo elettrico. Proponiamo questo approccio efficiente e diretto per la sintesi di vescicole composte che possono essere utilizzate come modello biomimetico per cellule nucleate eucariotiche, avanzando la loro applicazione nella ricerca biofisica.

Introduzione

I modelli biomimetici sono stati ampiamente impiegati per studiare i complessi fenomeni biofisici delle membrane cellulari. Questi modelli biomimetici più semplici forniscono informazioni preziose riducendo al minimo l'interferenza della miriade di variabili presenti nelle cellule biologiche. Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono un sistema biomimetico fondamentale utilizzato per studiare la biofisica delle membrane 1,2. I GUV sono ben consolidati come modello rappresentativo della membrana cellulare. Comprendono un singolo doppio strato lipidico sferico di dimensioni 10-30 μm di diametro e sono incapsulati e sospesi in una soluzione acquosa. In questo articolo, chiamiamo questi sGUV. Questi sistemi sono costruiti utilizzando un approccio bottom-up, in cui i componenti cellulari essenziali - lipidi, proteine e catalizzatori - sono assemblati per imitare la struttura e la funzione delle membrane biologiche 3,4.

Sebbene siano comunemente utilizzati semplici sGUV, con solo il nucleo acquoso all'interno, sono stati sviluppati modelli più avanzati per replicare caratteristiche specifiche delle cellule biologiche. Ad esempio, i GUV con strutture supportate da actina emulano il citoscheletro 5,6,7, mentre gli ambienti ad alto contenuto di sale vengono utilizzati per imitare le condizioni fisiologiche. Gli ambienti ad alto contenuto salino imitano le condizioni fisiologiche, ma è difficile ottenerli nei GUV poiché i metodi tradizionali, come l'elettroformazione 8,9, sono spesso inadatti per sintetizzare GUV di dimensioni micron in tali condizioni. I metodi più recenti, come il metodo assistito da gel, che utilizza gel polimerici o di amido per favorire il gonfiore del doppio strato durante l'idratazione, affrontano queste limitazioni10,11. Allo stesso modo, sono stati studiati i cambiamenti morfologici dei sGUV12. L'aggiunta di filamenti chiusi e aperti, come actina incapsulata, microtubuli e altri componenti del citoscheletro, di rigidità variabile, e la condizione di stress osmotico al loro interno influenza la transizione morfologica di queste vescicole osmoticamente sgonfie ma inizialmente quasi sferiche. L'analisi teorica rivela diverse trasformazioni morfologiche, tra cui strutture tubolari, sferiche, a racchetta, a ciliegia e a goccioline, allineandosi bene con le osservazioni sperimentali12. Questi risultati hanno implicazioni significative per la comprensione dell'organizzazione di filamenti, microtubuli e nanoanelli all'interno di cellule e vescicole. Altri studi esaminano i metodi per l'incapsulamento delle proteine ed esplorano come l'actina incapsulata, i microtubuli e i componenti del citoscheletro regolano la forma delle vescicole sgonfie osmotiche12,13.

Inoltre, ispirati dall'architettura delle cellule eucariotiche, vengono sviluppati modelli complessi basati su GUV per lo sviluppo di modelli artificiali che assomigliano alla fissione e alla divisione cellulare, alla riproduzione e alle caratteristiche multicompartimentali delle cellule eucariotiche, delle cellule autoriproducenti 14,15,16,17 e delle cellule multicompartimentali. Oltre all'applicazione strutturale, i GUV sono anche i modelli scelti per comprendere l'elettroporazione cellulare, un processo in cui un campo elettrico applicato induce la formazione di pori nella membrana lipidica a causa dello stress di Maxwell. I GUV, con dimensioni paragonabili alle celle biologiche, mostrano elettrodeformazione ed elettroporazione sotto campi elettrici. Tali studi sui GUV forniscono informazioni sulle proprietà elettromeccaniche come la capacità della membrana e la rigidità alla flessione18 e sui meccanismi di elettroporazione 2,19,20. Tuttavia, in pratica, questi studi sono i più rappresentativi delle cellule anucleate, come i globuli rossi (RBC).

Per colmare questa lacuna, proponiamo vescicole unilamellari giganti composte (cGUV) come nuovo modello biomimetico per cellule eucariotiche nucleate21,22. Queste vescicole possiedono una struttura vescicola nella vescicola, in cui il doppio strato interno imita la membrana nucleare e il doppio strato esterno rappresenta la membrana plasmatica. Inoltre, dimostriamo come la conducibilità elettrica delle regioni interna, anulare ed esterna possa essere modulata senza richiedere strumentazione avanzata, come micromanipolatori o microsiringhe. Questo approccio semplificato alla sintesi dei cGUV offre una piattaforma promettente per far progredire la ricerca biofisica sulle cellule nucleate.

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Protocollo

1. Preparazione di soluzioni di miscele lipidiche

  1. Preparare 1 mL di soluzione di DMPC e colesterolo in un rapporto molare 63:37 a una concentrazione finale di 5 mg/mL. Per questo, aggiungere 149 μL di DMPC (25 mg/mL di stock come ricevuto disciolto nel cloroformio), 252 μL di colesterolo (5 mg/mL di colesterolo disciolto nel cloroformio) e 599 μL di cloroformio.
  2. Preparare un'altra soluzione da 1 mL di DMPC: colesterolo in un rapporto molare 57:43 a 5 mg/mL, miscelare 139,8 μL di DMPC (25 mg/mL di stock come ricevuto disciolto in cloroformio), 301 μL di colesterolo (5 mg/mL, preparato da polvere disciolta in cloroformio) e 559,2 μL di cloroformio.
  3. Per colorare il doppio strato lipidico, aggiungere 100 μL di Rosso del Nilo (da una soluzione madre da 5 mM) a 1 mL della miscela lipidica contenente DMPC e colesterolo in un rapporto molare 63:37 (descritto nei passaggi 1.1 e 1.2). In alternativa, aggiungere 30 μL di Liss Rhod-PE (1 mg/mL di Liss Rhod-PE) a 1 mL di miscela lipidica preparata (descritta nei passaggi 1.1 e 1.2).
    NOTA: Poiché il solvente (cloroformio) è altamente volatile, dopo aver ripetuto l'apertura del flaconcino per l'uso della soluzione madre (25 mg/mL di DMPC), può diventare concentrato, il che può modificare la composizione.

2. Protocollo di elettroformazione per la sintesi di semplici Vescicole Unilamellari Giganti (sGUV)

  1. Pulire accuratamente i vetrini rivestiti di ossido di indio e stagno (ITO) con una soluzione di detersivo per piatti e risciacquare con acqua deionizzata (0,055 μS/cm). Pulire i vetrini con una soluzione di etanolo al 100%, sciacquare con acqua deionizzata e asciugare in forno a 85 °C.
  2. Identificare il lato conduttivo dei vetrini rivestiti in ITO utilizzando una pinza amperometrica. Fissare il vetrino rivestito in ITO pulito sul tavolino di centrifuga utilizzando un aspirapolvere con il lato conduttivo rivolto verso l'alto.
  3. Applicare 25 μl delle soluzioni lipidiche (preparate al punto 1.1) colando quattro goccioline della soluzione sul lato conduttivo del vetrino ITO. Quindi, prelevare un altro vetrino ITO e applicare 25 μl delle soluzioni lipidiche (preparate al punto 1.2) colando quattro goccioline della soluzione sul lato conduttivo del vetrino ITO.
  4. Asciugare sottovuoto entrambi i vetrini rivestiti di lipidi in un essiccatore tenuto al buio per almeno 2 ore.
    NOTA: La protezione dalla luce protegge i lipidi da possibili cambiamenti chimici.
  5. Disporre un vetrino ITO rivestito di lipidi (rivestito con lipidi preparati al punto 1.1) in parallelo con altri vetrini ITO puliti, con i lati conduttivi uno di fronte all'altro, con un distanziatore in gomma siliconica di 3 mm di spessore tra di loro. Sigillare il gruppo con un morsetto per creare una camera di elettroformazione sicura.
  6. Seguire la stessa procedura descritta al punto 2.5 per il vetrino rivestito di ITO con soluzione lipidica preparata al punto 1.2 per formare una camera di elettroformazione.
  7. Posizionare entrambe le camere in un incubatore mantenuto a 38-40 °C e riempire la camera con 100 mM di soluzione di saccarosio con l'aiuto di una siringa da 2 mL. Applicare un campo elettrico CA di 5 Vpp a una frequenza di 10 Hz utilizzando un generatore di funzioni a doppio canale per 4 ore.
    NOTA: Assicurarsi che il lato conduttivo della guida ITO sia correttamente clamped alle clip a coccodrillo che si collegano al generatore di funzioni.
  8. Scollegare la camera di elettroformazione dal generatore di funzioni. Togliete la camera dall'incubatrice e lasciatela raffreddare a temperatura ambiente. Raccogliere gli sGUV sintetizzati da entrambe le camere utilizzando una siringa e trasferirli in una provetta da microcentrifuga da 2 ml e incubare a temperatura ambiente (25-27 °C) per 1 ora prima di sottoporli a shock osmotico.

3. Transizione di forma nello shock osmotico (sGUV-to-Stomatocyte-to-cGUV)

  1. Trasferire 200 μL di sGUV sospesi in un terreno idratante contenente 100 mM di soluzione di saccarosio in una camera di osservazione.
  2. Introdurre 125 μL di soluzione di glucosio (300 mM) in questa sospensione sGUV contenente 200 μL di saccarosio 100 mM all'interno della camera di osservazione per indurre uno shock osmotico che avvia la transizione di forma degli sGUV.
    NOTA: Seguire la stessa procedura (indicata al punto 3) per la sintesi di sGUV dalla composizione lipidica indicata nei passaggi 1.1 e 1.2 per la transizione di forma guidata da shock osmotico.
  3. Lasciare riposare gli sGUV indotti da shock osmotico per 1 ora nella camera di osservazione posta sul tavolino di microscopia.
  4. Per condurre e osservare la transizione di forma dei sGUVS, posizionare la camera di osservazione (camera di elettrofusione, una capsula di Petri, un vetrino di concavità o qualsiasi altra camera che può essere utilizzata per l'osservazione al microscopio) sul tavolino di un microscopio invertito e lasciare che le vescicole si depositino.
  5. Monitora le transizioni di forma che si verificano all'interno della camera. Utilizzare la microscopia a contrasto interferenziale differenziale (DIC) e la microscopia a epifluorescenza con lenti per obiettivi Plan fluor, ELWD 20x/0,45 e Plan fluor, ELWD 40x/0,60 per osservare le transizioni di forma degli sGUV.
  6. Osservare la formazione di vescicole stomatocitiche durante la transizione. Monitorare la camera nel tempo man mano che le vescicole più grandi si depositano sul fondo, seguite da un aumento del numero di vescicole più piccole.

4. Modifica della conducibilità nelle regioni interna, anulare ed esterna dei cGUV

  1. Regolare la conducibilità delle soluzioni in diverse regioni di cGUV (interna, anulare ed esterna) aggiungendo quantità appropriate (μL) di una soluzione salina madre da 7,5 mM prima di somministrare uno shock osmotico agli sGUV.
    1. Ad esempio, per creare una maggiore conduttività nelle regioni esterne e interne rispetto alla regione anulare, trasferire 200 μL di soluzione di saccarosio nella camera di elettrofusione. Aggiungere 20 μl di soluzione salina da 7,5 mM nella camera. Indurre lo shock osmotico aggiungendo 125 μL di soluzione di glucosio 300 mM.
    2. Lasciare riposare gli sGUV osmotici per 3-4 ore. In questo caso, i cGUV si ottengono con una conducibilità più elevata nelle regioni esterne e interne rispetto alla regione anulare all'estremità.
  2. Eseguire l'elettrodeformazione dei cGUV applicando un potenziale elettrico CA di 7,5 Vpp a 100 kHz utilizzando un generatore di funzioni in una camera di elettrofusione che contiene elettrodi a filo distanziati di 500 μm l'uno dall'altro.
  3. Dopo aver applicato un campo elettrico CA, acquisire un video a 10 fotogrammi/s e osservare la deformazione di forma oblata delle vescicole esterne e la deformazione di forma prolata delle vescicole interne, confermando una maggiore conduttività nelle regioni esterne e interne rispetto alla regione anulare nei domini cGUV.

5. Analisi al microscopio di cGUV

  1. Imaging al microscopio invertito: Eseguire la microscopia a contrasto interferenziale differenziale (DIC) e a epifluorescenza utilizzando un microscopio invertito e accoppiato con una fotocamera monocromatica. Utilizzare la microscopia DIC e a epifluorescenza con le lenti dell'obiettivo Plan fluor, ELWD 20x/0.45 e Plan fluor, ELWD 40x/0.60 per osservare le transizioni di forma degli sGUV. Utilizzare un filtro verde (EX 510-560, DM 575, BA 590) per il doppio strato di colorazione rosso Nilo per lo studio dell'epifluorescenza.
    NOTA: Le immagini DIC forniscono preziose informazioni sullo stato del collo collegato, confermando se rimane intatto o subisce fusione per formare cGUV.
  2. Utilizzare il software ImageJ per inserire una barra della scala e ritagliare le immagini al microscopio. Per aggiungere una barra di scala, vai su Analizza | Imposta Scala per calibrare l'immagine, quindi vai su Analizza | Strumenti | Barra della scala per inserire la barra della scala.
  3. Microscopia confocale per la morfologia: per ottenere una comprensione più chiara della morfologia del cGUV, viene utilizzato un microscopio confocale a scansione laser per la scansione dell'asse z con una dimensione del passo di 1 μm. Imaging con microscopio confocale: utilizzare un microscopio confocale a scansione laser con un obiettivo Plan-Apochromat 40x/1.3 oil DIC per visualizzare i cGUV. Immagine di cGUV colorati con rosso Nilo o rodamina-PE utilizzando una modalità a canale singolo rosso, con una lunghezza d'onda di eccitazione di 561 nm e un intervallo di emissione di 561-695 nm.
  4. Per modificare ed estrarre il file .czi dell'immagine nel software collegato al microscopio, inserire elementi grafici come una barra di scala e abilitare la visualizzazione 2D, 3D, quindi andare su Elaborazione | Metodo | Parametri e fare clic su Applica per ottenere un'immagine in formato JPG.
  5. Preparazione per la microscopia confocale: riempire una soluzione acquosa contenente cGUV in una camera personalizzata modificata (vetro inferiore sostituito con vetro Coverslip) per l'imaging confocale. Lasciare il campione indisturbato per 10-15 minuti per consentire ai cGUV di stabilizzarsi per l'imaging confocale; caricare la miscela di cGUVs nel vetrino della cavità e sigillare con un vetrino coprioggetti per arrestare i movimenti dei cGUV. Successivamente, analizzare i cGUV attraverso la microscopia confocale e la scansione z con intervalli di 1 μm.

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Risultati

Gli sGUV sono stati sintetizzati utilizzando il metodo dell'elettroformazione (come mostrato nella Figura 1) e raccolti dalla camera utilizzando una siringa. Gli sGUV raccolti sono stati inizialmente visualizzati al microscopio invertito e sottoposti a uno shock osmotico per indurre la loro trasformazione in una forma di stomatocita. Dopo un ulteriore rimodellamento della membrana, questo stomatocita viene trasformato in una struttura vescicola-in-vescicola ...

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Discussione

La composizione e i tipi di lipidi determinano in gran parte le proprietà meccaniche del doppio strato che costituisce un GUV. Un doppio strato composto da DMPC/Chol mostra transizioni di forma uniche quando viene sottoposto a shock osmotico. Sotto un forte shock osmotico ipertonico, il fluido acquoso all'interno del sGUV viene espulso, portando alla deformazione del doppio strato GUV. Le transizioni di forma osservate sono influenzate principalmente dal flusso d'acqua verso l'esterno e ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Rupesh Kumar ringrazia il Ministero dello Sviluppo delle Risorse Umane (MHRD), Governo dell'India, per la borsa di studio PMRF e la sovvenzione di emergenza. Ringraziamo il microscopio a scansione laser confocale della Central Facility, IRCC, IIT Bombay.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cholesterol (Sigma grade, 99%)Avanti Polar Lipids, Inc.C8667Per sintesi sGUV
CholoroformMerck Life Science Pvt. Ltd.DA2P711602Usato come solvente per la preparazione della soluzione di lipidi stock
DMPCAvanti Polar Lipids, Inc.850345CPer sintesi sGUV
EthanolHaymanF204325Per la pulizia delle diapositive ITO
FITC-DEXTRAN (4 Kda-MW)Sigma-Aldrich466994Per l'incapsulamento all'interno delle vescicole interne di cGUV
GlucoseSigma-AldrichG-7021Per la preparazione della soluzione di glucosio, usata per lo shock osmotico agli sGUV sospesi nella soluzione di saccarosio
Liss Rhod PESigma-Aldrich810150C-1MGPer colorare le molecole lipidiche
Nile redSigma-Aldrich72485Per la colorazione di cGUV e sGUV membrane
Sodium chloride (NaCl)Sigma-Aldrich1936060521Per la preparazione della soluzione di sale stock, per modificare la conducibilità  dei compartimenti cGUV
SucroseSigma-AldrichS9378Per la soluzione di saccarosio come mezzo idratante della camera di elettroformazione
Attrezzature
Diapositive CavitlyBlue starSospensione cGUV posizionata per l'osservazione al microscopio
Fotocamera cMOS pco.edge 4.2Excelitas61009524Per immagini monocromatiche fluorescenti  e immagina DIC
Vetrino di copertura (22 x 60 mm)Blue starPer la copertura delle diapositive a cavità
Camera di elettrofusione EppendorfSigma-AldrichSospensione sGUV posizionata nella camera per l'osmosi e l'osservazione al microscopio, qualsiasi altra camera semplice può essere utilizzata
Generatore di funzioni (Dual channel)TektronixAFG3022CGeneratore di funzioni utilizzato per fornire un campo elettrico AC alla camera di elettroformazione 
IncubatorePersonalizzato localecamera di elettroformazione posizionata a 40°
Diapositive ITOSigma-Aldrich576352-10PAKDiapositive ITO utilizzate nel metodo di elettroformazione
Microscopio invertito Nikon EclipseNikonTE2000-UPer la visualizzazione di sGUV e cGUV
Foglio di silicone (3 mm  di spessore)Sigma-AldrichGF49463141Per il distanziamento nella camera di elettroformazione
Siringa (2 mL)Becton Dickinson India Pvt Ltd.300844Usata per iniettare un mezzo idratante e raccogliere gli sGUV dalla camera di elettroformazione
Setup di microscopia confocale ZeissCentro di assistenza IIT Bombay

Riferimenti

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