Articolo metodologico

Sviluppo di un nuovo crioprotettore a basso contenuto di DMSO per la conservazione delle cellule staminali del sangue periferico

DOI:

10.3791/68275

⸱

20 giugno 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Affiliated Nanshan Hospital of Shenzhen University, 2Institute of Infection, Immunology and Tumor Microenvironment, Hubei Province Key Laboratory of Occupational Hazard Identification and Control, School of Medicine, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Hematology & Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital & Shenzhen Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Medicine, South University of Science and Technology, 5Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Il protocollo utilizza un crioprotettore di cellule staminali ematopoietiche contenente una concentrazione molto bassa di dimetilsolfossido e ne dimostra la sicurezza clinica e l'efficacia nella protezione delle cellule staminali ematopoietiche, fornendo una nuova strategia per la crioconservazione delle cellule staminali ematopoietiche nel trapianto clinico di cellule staminali autologhe.

Abstract

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La crioconservazione delle cellule staminali ematopoietiche del sangue periferico (PBHSC) è fondamentale per il trapianto autologo di cellule staminali (ASCT), ma i tradizionali agenti crioprotettivi (TCPA) contenenti il 10% di dimetilsolfossido (DMSO) sollevano problemi di sicurezza a causa del rischio di tossicità. Questo studio mirava a convalidare un nuovo agente crioprotettivo a basso contenuto di DMSO (CPA, 2% DMSO) per la conservazione del PBHSC a -80 °C, eliminando la necessità di stoccaggio di azoto liquido. I PBHSC di sei donatori sono stati divisi in gruppi CPA e TCPA. Il CPA è stato miscelato con PBHSC (1:1 vol/vol) e conservato direttamente a -80 °C. Il TCPA (10% DMSO + 5% albumina umana) è stato sottoposto a raffreddamento graduale (1 °C/min) e allo stoccaggio di azoto liquido. Dopo 1 mese, entrambi i gruppi sono stati scongelati in un bagno d'acqua a 37 °C. Sono stati confrontati la vitalità cellulare, l'integrità del citoscheletro (microfilamenti/microtubuli), l'attività mitocondriale e la capacità di formazione di colonie. Dopo lo scongelamento, la sopravvivenza del PBHSC è stata paragonabile tra CPA (91,29%) e TCPA (90,07%). Tuttavia, il CPA ha superato il TCPA nei saggi di vitalità cellulare (CPA: 89,38% rispetto a TCPA: 79,55%; p < 0,05). L'analisi del citoscheletro ha rivelato microfilamenti e microtubuli intatti nelle cellule conservate con CPA, con una chiarezza strutturale superiore al TCPA. L'attività mitocondriale nelle cellule trattate con CPA rispecchiava le PBHSC fresche, mostrando un'attività superiore dell'8,5% rispetto al TCPA (p < 0,05) e un aumento del numero di complessi mitocondriali. I saggi di formazione di colonie hanno ulteriormente confermato la superiorità della CPA, con un numero più elevato di colonie dopo l'induzione. La CPA consente una crioconservazione PBHSC sicura e conveniente a -80 °C utilizzando un DMSO ultrabasso (2%), eliminando la dipendenza dall'azoto liquido. La sua maggiore vitalità cellulare e la conservazione mitocondriale suggeriscono vantaggi clinici riducendo i rischi di tossicità per infusione. Questo protocollo offre una strategia di trasformazione per l'ASCT, ottimizzando la sicurezza e l'efficienza operativa.

Introduzione

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Il trapianto autologo di cellule staminali ematopoietiche (ASCT) è un'opzione terapeutica consolidata per varie neoplasie ematologiche, tra cui leucemia, linfoma e mieloma multiplo, dove funge da terapia di prima o seconda linea per ricostituire l'emopoiesi e ripristinare la competenza immunitaria dopo chemioterapia intensiva o radioterapia 1,2,3,4,5,6,7 . Gli esiti positivi dell'ASCT dipendono in modo critico dalla vitalità delle cellule staminali ematopoietiche del sangue periferico (PBHSC) crioconservate, che devono mantenere la capacità funzionale per la ricostituzione ematopoietica e immunitaria 8,9,10,11,12. La conservazione delle cellule staminali ematopoietiche è un passaggio fondamentale nell'ASCT perché dopo il prelievo autologo di cellule staminali ematopoietiche, i pazienti in genere vengono sottoposti a radiazioni, chemioterapia e altre terapie per eliminare le cellule tumorali. La qualità della conservazione delle cellule staminali ematopoietiche è direttamente correlata al successo o al fallimento della ricostituzione ematopoietica e immunitaria 13,14,15,16,17,18. Per garantire la vitalità delle cellule staminali ematopoietiche dopo la crioconservazione, le pratiche cliniche spesso comportano l'aggiunta di albumina nel sangue umano e dimetilsolfossido (DMSO) come CPA. Questi agenti sono fondamentali per mantenere l'attività cellulare durante e dopo il processo di crioconservazione. Tipicamente, la concentrazione di DMSO utilizzata varia dal 5% al 10% (v/v). Gli studi hanno indicato che il mantenimento di una concentrazione di DMSO di almeno il 3,5-10% (v/v) può migliorare l'efficacia della crioconservazione delle cellule staminali ematopoietiche19,20. Tuttavia, l'applicazione clinica del DMSO rimane problematica a causa della tossicità dose-dipendente, con il 30%-60% dei trapiantati che riportano effetti avversi come nausea, vomito e ipotensione21,22. Per affrontare i limiti degli agenti crioprotettivi convenzionali (CPA) contenenti il 5%-10% di dimetilsolfossido (DMSO), questo studio mira a sviluppare un nuovo CPA che consenta la crioconservazione sicura ed efficiente del PBHSC a -80 °C utilizzando concentrazioni ultrabasse di DMSO (2% v/v), eliminando così la necessità di complessi protocolli di azoto liquido e mitigando la tossicità associata al DMSO.

Le alternative emergenti, come i CPA a base di trealosio o potenziati con polimeri, mostrano risultati preclinici, ma incontrano ostacoli nella traduzione clinica a causa di ostacoli normativi o incompatibilità con i protocolli standard di scongelamento23. Al contrario, il nostro CPA si basa sul profilo di sicurezza stabilito dei sistemi HSA-DMSO, introducendo al contempo rapporti di additivi ottimizzati che migliorano la citoprotezione. Questo metodo è particolarmente adatto per i centri clinici che non dispongono di infrastrutture per l'azoto liquido o che richiedono flussi di lavoro rapidi. Tuttavia, per lo stoccaggio a lungo termine (>2 anni), l'azoto liquido rimane preferibile24. I medici devono bilanciare la semplicità del protocollo con la tolleranza individuale del paziente al DMSO, garantendo un'applicazione su misura di questa strategia per massimizzare la sicurezza e l'efficienza operativa nel trapianto di cellule staminali ematopoietiche.

In questo studio, l'impiego di crioprotettori con contenuto ridotto di DMSO rappresenta una strategia cruciale per preservare contemporaneamente l'efficacia della crioconservazione delle cellule staminali ematopoietiche riducendo al minimo la tossicità associata. L'efficacia, la sicurezza e la convenienza di una CPA di cellule staminali ematopoietiche di nuova concezione sono state valutate per la conservazione delle cellule staminali ematopoietiche del sangue periferico (PBHSC). È stato implementato un metodo di congelamento semplice e diretto che utilizza il nuovo CPA, evitando i protocolli convenzionali di crioconservazione. I risultati dimostrano che la crioconservazione in un'unica fase di sospensioni cellulari a -80 °C utilizzando DMSO CPA a bassa concentrazione consente di ottenere effetti di conservazione superiori rispetto al CPA tradizionale (TCPA). Questo approccio può offrire nuove strategie per semplificare il processo clinico del trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT).

Protocollo

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I pazienti oncologici ematologici sottoposti a ASCT sono stati reclutati da giugno 2020 a giugno 2022 nel reparto di ematologia dello Shenzhen Cancer Hospital. I campioni di cellule del sangue sono stati prelevati prima e dopo la mobilizzazione del trapianto per HSCT, inclusi due casi di leucemia mieloide acuta (AML), due casi di linfoma di Hodgkin (HL), un caso di linfoma cutaneo genuinamente istiocitico (CGHL) e un caso di linfoma primario a cellule B del mediastino (PMBL), con un'età media di 53 anni e un intervallo da 35 a 61 anni. Lo studio ha ricevuto il consenso informato dai pazienti e l'approvazione dal comitato di revisione etica dello Shenzhen Cancer Hospital, con il documento di approvazione etica numero AF-SC-07-2.0. Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state approvate dal Comitato Etico per gli Animali Sperimentali, dall'Ospedale per il Cancro, dall'Accademia Cinese delle Scienze Mediche (Approvazione n. NCC2018A073) e rispettato le linee guida internazionali per la ricerca sugli animali.

1. Subconfezionamento e crioconservazione di campioni di cellule staminali ematopoietiche

  1. Preparazione di una postazione di lavoro asettica
    1. Lavarsi accuratamente le mani e indossare maschere e guanti sterili. Disinfettare mani, polsi e gomiti utilizzando etanolo al 75%.
    2. Sterilizzare tutti gli strumenti di ricambio (pipette, emostatici) con autoclave o irradiazione UV. Disporre i seguenti materiali sulla cappa di biosicurezza: puntali per pipette sterili apirogeni da 1 ml (2 scatole), pipetta da 1000 μl, provette sterili per crioconservazione da 1,8 ml, provette per centrifuga da 50 ml e una scatola per la conservazione delle provette per crioconservazione (scatola di congelamento programmabile).
  2. Etichettatura e miscelazione cellula-CPA
    1. Etichettare le provette per crioconservazione con l'ID del campione, la data, la conta cellulare e il nome del donatore.
    2. Collegare la sacca di cellule staminali ematopoietiche contenente 180-200 mL di cellule staminali ematopoietiche alla sacca contenente CPA contenente 100 mL di nuovo crioprotettore a basso contenuto di DMSO utilizzando una provetta per infusione sterile.
    3. Clamp il punto medio del tubo con un emostatico sterile. Collegare un'estremità alla sacca di miscela cellule-CPA e l'altra a una provetta da centrifuga da 50 mL.
  3. Otturazione e crioconservazione
    1. Rilasciare l'emostatico per consentire un flusso controllato della miscela cellula-CPA nella provetta da centrifuga.
    2. Aspirare 1 mL di aliquote dalla provetta da centrifuga utilizzando una pipetta. Trasferire le aliquote in provette criogeniche pre-marcate (30 provette/campione). Serrare i tappi e posizionare i tubi nella scatola di conservazione.
  4. Stoccaggio e trasporto
    1. Trasferire immediatamente la scatola di conservazione in un frigorifero a -80 °C. Per il trasporto, imballare le crioprovette in ghiaccio secco (-78,5 °C) con monitoraggio della temperatura.

2. Crioconservazione e recupero delle PBHSC

  1. Preparazione e miscelazione CPA e TCPA
    1. Pre-raffreddare una piattaforma di ghiaccio a 2-8 °C. Scongelare le cellule staminali ematopoietiche CPA e TCPA secondo le linee guida del produttore (vedere la Tabella 1 per le composizioni CPA/TCPA).
    2. Mescolare CPA e TCPA con sei campioni di PBHSC con un rapporto di volume 1:1 sulla piattaforma di ghiaccio. Trasferire la sospensione cellulare in crioviali sterili.
  2. Crioconservazione CPA
    1. Mettere direttamente i crioviali in un congelatore a -80 °C. Assicurarsi che la concentrazione finale di DMSO nella sospensione sia del 2% (v/v). Conservare i campioni per 1 mese.
  3. Crioconservazione TCPA (controllo comparativo)
    1. Preparare il TCPA contenente il 5% di albumina nel sangue umano e il 10% di DMSO (v/v). Caricare le sospensioni di PBHSC nei crioviali e raffreddarle a -80 °C a 1°C/min utilizzando un congelatore programmabile.
    2. Trasferire i crioviali in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Conservare i campioni per 1 mese.
  4. Rianimazione cellulare
    1. Recupera i crioviali dopo 1 mese. Scongelare le cellule in un bagno d'acqua a 37 °C con agitazione delicata (≤ 5 min).
    2. Centrifugare a 300 x g per 10 minuti per rimuovere i residui di CPA/TCPA. Risospendere 1 mL di cellule in terreno di coltura RPMI 1640 preriscaldato per saggi a valle.

3. Saggio di vitalità cellulare

  1. Conteggio delle cellule basato su immagini
    1. Preparare una soluzione colorante mista contenente 10 μg/mL di arancio acridina (AO) e 10 μg/mL di ioduro di propidio (PI).
    2. Miscelare 100 μl di sospensione cellulare con 100 μl di soluzione colorante (rapporto 1:1) in una provetta sterile per microcentrifuga.
    3. Caricare 10 μl del campione colorato nel contatore automatico di cellule. Analizza la vitalità cellulare utilizzando il software integrato:
      Vitalità = Cellule vive / Cellule totali x 100%
  2. Convalida della citometria a flusso
    1. Preparare la soluzione di colorazione dell'annessina V-FITC/PI mescolando l'annessina V-FITC (5 μL) e il PI (5 μL) in 100 μl di tampone legante.
    2. Aggiungere 300 μl di sospensione cellulare alla soluzione colorante e incubare a 25 °C per 15 minuti al buio.
    3. Centrifugare la miscela a 300 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 500 μL di PBS e analizzarne la vitalità utilizzando un citometro a flusso25.

4. Saggio di formazione di colonie

  1. Preparazione della sospensione cellulare
    1. Miscelare la sospensione cellulare con una soluzione di blu di tripano allo 0,4% in rapporto 1:1 e incubare per 3 minuti per distinguere le cellule vitali da quelle morte. Esecuzione di conteggi di duplicati utilizzando un contatore di cellule automatizzato per determinare la densità cellulare vitale (garantire la vitalità >90%). Regolare il volume della sospensione cellulare alla concentrazione target (1 x 10,6 cellule/mL) e filtrare attraverso un filtro da 40 μm per garantire la dispersione di una singola cellula. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare sterile da 40 μm per rimuovere gli aggregati.
  2. Miscelazione media
    1. Combinare 1 mL di sospensione cellulare con 9 mL di terreno formante unità di colonia di topi in commercio in una provetta conica da 15 mL (1:10 v/v).
    2. Agitare la miscela a 1.500 giri/min per 30 s per garantire l'omogeneità. Centrifugare a 100 x g per 10 s per eliminare le bolle d'aria.
  3. Semina cellulare e impostazione dell'umidità
    1. Erogare 1,5 mL di miscela priva di bolle in una piastra di Petri sterile da 35 mm. Aggiungere 3 ml di acqua distillata sterile in una scanalatura periferica della piastra (o posizionare un contenitore sterile separato all'interno del coperchio della capsula) per mantenere l'umidità.
    2. Sigillare la capsula in una camera umidificata (≥ 95% di umidità).
      1. Per preparare la camera, posizionare due strati di carta assorbente sterile in un contenitore di plastica con coperchio (ad esempio, una capsula di Petri da 15 cm). Aggiungere 10 ml di acqua deionizzata sterile per saturare la carta. Posizionare la piastra di coltura colorata al centro della camera, assicurandosi che non vi sia alcun contatto diretto tra la piastra e la carta bagnata. Avvolgere la pellicola trasparente attorno alla giunzione coperchio-contenitore 3 volte per una chiusura ermetica. In alternativa, fissare i bordi del coperchio con del nastro da laboratorio. Incubare la camera sigillata a 37 °C per 30 minuti per bilanciare l'umidità ≥ 95%.
  4. Coltivazione e censimento delle colonie
    1. Incubare le cellule a 37 °C sotto il 5% di CO2 per 16 giorni. Contare le colonie ematopoietiche (≥ 50 cellule per cluster) utilizzando un microscopio invertito con ingrandimento 40x. Calcolare le unità formanti colonie (CFU) per 1 x 104 cellule seminate.

5. Rilevamento dell'attività mitocondriale

  1. Colorazione cellulare con rodamina 123
    1. Risospendere le PBHSC a 1 x 106 cellule/mL in 1 mL di RPMI1640 terreno. Aggiungere il colorante Rodamina 123 a una concentrazione finale di 5-10 μM. Incubare le cellule in CO2 al 5% a 37 °C per 10 minuti.
    2. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di RPMI1640 fresco. Ripetere la centrifugazione e risospendere in 1 mL di PBS.
  2. Analisi al microscopio confocale
    1. Pulisci un vetrino pulito con carta priva di lanugine per rimuovere polvere o contaminanti.
    2. Risospendere le PBHSC colorate in PBS a una densità appropriata per evitare la sovrapposizione dei segnali. Pipettare 10-20 μL di sospensione cellulare ed erogarla lentamente al centro del vetrino.
    3. Inclinare il vetrino coprioggetti con un angolo di 45°, toccare delicatamente un bordo della gocciolina e abbassarlo gradualmente per ridurre al minimo le bolle d'aria. Premere leggermente per assicurarsi che le celle siano distribuite uniformemente in un monostrato.
    4. Posizionare il vetrino orizzontalmente al buio per 5 minuti per consentire alle celle di stabilizzarsi. Procedere immediatamente all'analisi al microscopio confocale.
    5. Montare le celle colorate su un vetrino. Osservare la distribuzione mitocondriale utilizzando un microscopio confocale (es/em: 488/525 nm).
  3. Quantificazione della citometria a flusso
    1. Analizzare l'intensità di fluorescenza della rodamina 123 utilizzando un citometro a flusso (canale FL1). Utilizzare PBHSC trattati con perossido di idrogeno (1 mM, 1 h) come controlli positivi26.

6. Colorazione del citoscheletro delle PBHSC

  1. Colorazione di microfilamenti (Actin Tracker Green-488)
    1. Preparare una sonda fluorescente di falloidina coniugata AF488 disciolta in PBS a una concentrazione finale di 5 U/mL. Diluire la soluzione madre (200 U/mL in metanolo) mescolando 5 μL di stock con 195 μL di PBS (diluizione 1:40). Agitare accuratamente per 10 s per garantire l'omogeneità.
    2. Aggiungere 200 μl della soluzione di lavoro preparata Actin Tracker Green-488 (5 U/mL) alle PBHSC. Incubare le cellule a 25 °C per 30 minuti al buio.
    3. Lavare le celle 2 volte con 1 mL di tampone di lavaggio immunocolorante (0,1% Triton X-100 in PBS). Controcolorare i nuclei con 200 μL di DAPI (1 μg/mL) per 5 minuti a 25 °C al buio.
  2. Colorazione dei microtubuli (Tubulin Tracker Red)
    1. Preparare una sonda fluorescente di paclitaxel coniugata a infrarossi disciolta in PBS a una concentrazione finale di 1 μM. Diluire la soluzione madre (100 μM in DMSO) aggiungendo 10 μL di stock a 990 μL di PBS (rapporto di diluizione 1:100). Agitare la miscela per 10 s per garantire omogeneità e proteggere dalla luce.
    2. Preparare la soluzione di lavoro Tubulin Tracker Red ad una concentrazione finale di 250 nM in terreno completo. Diluire la soluzione madre (1 mM in DMSO) aggiungendo 2,5 μL di stock a 997,5 μL di terreno (rapporto di diluizione 1:400). Agitare la miscela per 10 s e aggiungere 200 μl ai PBHSC. Incubare a 25 °C per 30 minuti al buio.
    3. Lavare le celle 2 volte con 1 mL di tampone di lavaggio immunocolorante. Controcolorare i nuclei con 200 μL di DAPI (1 μg/mL) per 5 minuti a 25 °C al buio.
  3. Montaggio e microscopia
    1. Lavare le cellule colorate 2 volte con PBS. Mescolare le cellule colorate con una soluzione di glicerolo-PBS al 90% (90% glicerolo e 10% PBS, v/v) con un rapporto in volume 1:1. Pipettare 10 μl della miscela su un vetrino. Inclinare il vetrino coprioggetti di 45° e abbassarlo gradualmente per evitare bolle d'aria.
    2. Analizzare la morfologia dell'actina/microtubuli utilizzando un microscopio a fluorescenza (eccitazione di 488 nm per il verde di actina; 561 nm per il rosso di tubulina). Includere controlli positivi: PBHSC trattati con citocalasina B (5 μM, 2 h) per la disgregazione dell'actina e PBHSC trattati con colchicina (10 μM, 3 h) per la depolimerizzazione dei microtubuli.

7. Valutazioni di sicurezza CPA

  1. Test di emolisi
    1. Preparare una sospensione di globuli rossi di coniglio al 2% utilizzando sangue fresco anticoagulato con EDTA.
    2. Aggiungere CPA (0,1-0,5 mL) e soluzione fisiologica (2,0-2,4 mL) a 2,5 mL di sospensione cellulare in provette di vetro.
    3. Utilizzare soluzione salina come controllo negativo e acqua sterilizzata come controllo positivo. Incubare a 37 °C per 3 ore e osservare l'emolisi/coagulazione al microscopio.
  2. Test allergologico sistemico
    1. Preparazione degli animali
      1. Utilizzare 36 porcellini d'india SPF Hartley (50% maschi, 271-307 g; 50% femmine, 270-301 g) di 4-5 settimane. Mantenere le seguenti condizioni dell'alloggiamento: Temperatura: 16-26 °C (± 4 °C di fluttuazione giornaliera), Umidità: 40%-70%, Ventilazione: 8-10 ricambi d'aria/h, Ciclo di luce: 12 h luce/buio
    2. Fase di sensibilizzazione
      1. Iniettare CPA nel quadrante inferiore sinistro della cavità peritoneale a 2 mL/kg (basso) o 6 mL/kg (alto) nei giorni 1, 3 e 5. La dose bassa (2 ml/kg) simula i livelli di esposizione clinica, mentre la dose alta (6 ml/kg) rappresenta il margine di sicurezza 3 volte superiore per valutare l'ipersensibilità dose-dipendente, seguendo la linea guida OCSE 406 per i test allergologici sistemici27,28.
      2. Utilizzare albumina sierica umana (controllo positivo) e soluzione salina (controllo negativo).
    3. Fase di sfida
      1. Somministrare CPA per via endovenosa attraverso la vena dell'orecchio marginale a 4 ml/kg (bassa) o 12 ml/kg (alta) nei giorni 19 e 26. Le dosi di provocazione (2 dosi di sensibilizzazione) si allineano con i protocolli stabiliti per provocare anafilassi nelle cavie presensibilizzate, come convalidato in precedenti studi sulla biocompatibilità dei crioprotettori29.
      2. Monitorare i sintomi dell'anafilassi (distress respiratorio, convulsioni) per 1 ora dopo l'iniezione.
    4. Manipolazione post-sperimentale
      1. Riportare i porcellini d'India alle cure veterinarie per 72 ore di osservazione. Eutanasia mediante dissanguamento dell'aorta addominale in anestesia con isoflurano.
  3. Test di tossicità sistemica acuta
    1. Iniezione di topo
      1. Iniettare 50 ml/kg di CPA nella vena caudale di 10 topi maschi ICR (32,0-37,1 g, 6 settimane di età). Utilizzare topi iniettati con soluzione salina come controlli negativi (n = 10).
    2. Protocollo di osservazione
      1. Monitorare la sopravvivenza, i segni di tossicità e il peso a 4, 24, 48 e 72 ore dopo l'iniezione. Mantenere le condizioni dell'alloggiamento: Temperatura: 20-25 °C (± 3 °C al giorno), Umidità: 40%-70%, Ventilazione: 10-20 ricambi d'aria/h.
    3. Eutanasia
      1. Anestetizzare i topi con isoflurano al 3%. Eutanasia mediante dissanguamento dell'aorta addominale.
  4. Test di irritazione vascolare
    1. Somministrazione di conigli
      1. Utilizzare 6 conigli neozelandesi maschi (3,65-4,36 kg, 7-8 mesi). Iniettare 5 ml/kg di CPA nella vena dell'orecchio destro settimanalmente (totale 3 dosi). Iniettare soluzione salina nell'orecchio sinistro come controllo negativo.
    2. Valutazione tissutale
      1. Esaminare i siti di iniezione per eritema, edema o necrosi nei giorni 18-19. Valutare l'irritazione del sito di iniezione in base alla gravità dell'eritema, dell'edema e della necrosi. Applicare il sistema di punteggio ISO 10993-12 con gradi che vanno da 0 (nessuna reazione) a 4 (necrosi grave)30,31.
    3. Manipolazione post-sperimentale
      1. Anestetizzare i conigli con tiletamina-zolazepam (5 mg/kg, IM). Eutanasia mediante salasso rapido dell'arteria carotide.

8. Trapianto di PBHSC

  1. Arruolamento e mobilizzazione dei pazienti
    1. Arruolare sei pazienti che soddisfano i criteri di trapianto: Cellule mononucleate ≥ 5 x 108 cellule/kg
      Le cellule CD34+ ≥ 2 x 106 cellule/kg23. Escludere i pazienti di età compresa tra <18 e >65 anni, quelli con infezioni attive, grave disfunzione d'organo, gravidanza/allattamento, terapia immunosoppressiva recente (entro 4 settimane) o disturbi psichiatrici non controllati.
    2. Mobilizzare le cellule staminali ematopoietiche dal midollo osseo al sangue periferico utilizzando il fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF). Mobilizzare le cellule staminali ematopoietiche dal midollo osseo al sangue periferico somministrando quotidianamente per via sottocutanea il fattore stimolante le colonie di granulociti alla dose di 10 μg/kg (la dose esatta varia da persona a persona) per 5 giorni consecutivi.
  2. Raccolta e crioconservazione dei PBHSC
    1. Raccogli le PBHSC mobilizzate utilizzando un dispositivo per aferesi con una velocità del flusso sanguigno impostata a 40 ml/min e un rapporto anticoagulante/sangue intero di 1:12. Processare 15-16 L di sangue intero per sessione per ottenere 180-200 mL di concentrato di PBHSC. Dividere il campione in due aliquote e ogni bustina ha una capacità di 90-100 ml.
    2. Risospendere la prima aliquota in dimetilsolfossido al 10% (DMSO) e albumina sierica umana al 5% per trasfusione clinica. Trasferire l'aliquota risoluta in un contenitore di congelamento programmabile con una velocità di raffreddamento compresa tra -1 °C/min e -80 °C. Etichettare la cryobag con l'ID del paziente e i parametri di congelamento (ad esempio, numero di lotto, data). Preparare la seconda aliquota in 5% di DMSO e 10% di siero fetale bovino per il test di vitalità.
  3. Scongelamento e reinfusione
    1. Scongelare le PBHSC crioconservate in un bagno d'acqua a 37 °C (≤ 2 min). Somministrare le cellule scongelate per via endovenosa dopo il condizionamento della chemioterapia/radioterapia. Somministrare le cellule per via endovenosa tramite catetere venoso centrale entro 30 minuti dopo lo scongelamento utilizzando una pompa a siringa a 3-5 ml/min.
  4. Monitoraggio post-trapianto
    1. Monitorare il recupero ematopoietico mediante emocromo giornaliero: Soglia di successo dei neutrofili: ≥ 0,5 x 109 cellule/L; soglia di successo piastrinica: ≥ 20 x 109 cellule/L32.
    2. Monitorare la ricostituzione immunitaria attraverso l'analisi del sottogruppo di linfociti. Raccogliere 5 mL di campioni di sangue periferico in provette EDTA. Colorare le cellule con anticorpi fluorescenti contro CD3, CD4, CD8, CD19 e CD56 per 15 minuti al buio. Analizza sottogruppi di linfociti utilizzando un citometro a flusso e una strategia di gating standardizzata. Confrontare la conta assoluta (cellule/μL) con intervalli di riferimento sani abbinati all'età per l'interpretazione.

9. Analisi della sottopopolazione dei PBHSC

  1. Colorazione degli anticorpi
    1. Preparare i PBHSC congelati (gruppi CPA/TCPA) e scongelarli a bagnomaria a 37 °C.
    2. Marcare le cellule con anticorpi fluorescenti: CLP: CD45-CD34+CD10+ (cloni HI30+4H11+HI10a); MEP: CD45-CD38+CD135-CD45RA- (cloni HIT2+4G8+5F3+HI100); GMP: CD45-CD38+CD135+CD45RA+ (Figura 1). Centrifugare le PBHSC scongelate a 300 x g per 5 minuti per rimuovere gli agenti di crioconservazione. Regolare la concentrazione cellulare a 1 x 106 cellule/mL in PBS contenente il 2% di siero fetale bovino.
    3. Preparare cocktail di anticorpi utilizzando i cloni HI30/4H11/HI10a per CLP e HIT2/4G8/5F3/HI100 per MEP/GMP ai titoli raccomandati dal produttore. Incubare le cellule con miscele di anticorpi per 30 minuti al buio a 4°C con un leggero vortice ogni 10 minuti. Lavare le cellule colorate 2 volte con PBS freddo+0,1% di sodio azide mediante centrifugazione a 200 x g per 3 minuti. Risospendere le cellule in 500 μL di PBS con 1 μg/mL di DAPI per il gating di vitalità prima dell'analisi di citometria a flusso.
    4. Incubare a 4 °C per 30 minuti al buio. Lavare 2 volte con PBS contenente l'1% di BSA.
  2. Configurazione della citometria a flusso
    1. Risospendere le cellule colorate in 500 μL di PBS. Analizza le sottopopolazioni utilizzando un citometro a flusso: configura i laser (488 nm, 640 nm) e i filtri (FITC, PE, APC). Raccogli ≥ 10.000 eventi per campione.
    2. Popolazioni di gate in base alla dispersione frontale/laterale e all'intensità della fluorescenza (Figura 1).
  3. Confronto dei dati
    1. Calcola le percentuali CLP/MEP/GMP utilizzando il software FlowJo v10.8. Confronta i gruppi CPA con TCPA utilizzando il test t di Student (α = 0,05). Visualizza le differenze utilizzando Prism 9.0 (grafici a barre con SEM)33.

10. Analisi statistica

  1. Eseguire un confronto delle medie di variabili numeriche continue conformi a una distribuzione normale con varianza del chi quadrato, utilizzando il test t, e per variabili numeriche continue che non sono conformi a una distribuzione normale, testarle in modo non parametrico.
  2. Riportare i dati per variabili continue come la media ± la deviazione standard o la mediana e i quartili superiore e inferiore. Usa il test esatto di Fisher per confrontare i tassi tra i due gruppi.
  3. Analizza i dati e traccia utilizzando il software SPSS 26.0 e GraphPad Prism 9. Considera tutte le differenze nei test a due code statisticamente significative se p < 0,05. Alcuni dei dati sono presentati sotto forma di descrizioni statistiche.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Confronto tra i metodi di crioconservazione in un'unica fase e la crioconservazione con azoto liquido
La vitalità delle PBHSC crioconservate dopo il recupero è stata valutata utilizzando saggi AO/PI. Come mostrato nella Figura 2A, la vitalità delle PBHSC crioconservate a -80 °C utilizzando CPA è risultata essere del 91,29% (n = 3, SD = 1,86), mentre per quelle conservate in azoto liquido, la vitalità era del 90,07% (n = 3, SD = 1,64). L'analisi statistica non ha indicato differenze significative tra i due metodi (p > 0,05). Tuttavia, il metodo di crioconservazione in un'unica fase si è rivelato più veloce e conveniente. Questi risultati suggeriscono che il metodo di crioconservazione in un'unica fase è un'alternativa superiore per la conservazione delle cellule.

L'effetto di crioconservazione della CPA sulle PBHSC supera il metodo di crioconservazione convenzionale
Le vitalità cellulari delle PBHSC crioconservate dopo il recupero sono state rilevate mediante saggi AO/PI e Annexin V/PI. Come mostrato nella Figura 2, la vitalità cellulare di sei campioni di PBHSC recuperati conservati con CPA ha raggiunto rispettivamente l'89,38% (n = 6, SD = 1,87, Figura 2B) e l'88,20% (n = 6, SD = 2,72, Figura 2C). Tuttavia, quelli conservati dal TCPA erano il 79,55% (n = 6, SD = 3,16, Figura 2B) e il 73,05% (n = 6, SD = 7,47, Figura 2C). Questi risultati suggeriscono che il CPA è un crioprotettore più efficace per le PBHSC rispetto al TCPA, portando a una migliore conservazione della vitalità cellulare e dei tassi di recupero.

Le PBHSC conservate con CPA mantengono la struttura completa dello scheletro citogenicoe l'attività mitocondriale
La definizione ristretta di citoscheletro si riferisce alla rete di fibre proteiche, microtubuli (MT), microfilamenti (MF) e filamenti intermedi (IF) nelle cellule eucariotiche34. In questo studio, abbiamo studiato principalmente l'integrità strutturale di MT e MF dopo crioconservazione di PBHSC per dimostrare che le PBHSC potrebbero mantenere l'integrità del citoscheletro dopo la crioconservazione di CPA. Per marcare le strutture dei microfilamenti e dei microtubuli delle cellule viventi, sono stati utilizzati come sonde fluorescenti come sonde fluorescenti come sonde fluorescenti rispettivamente il peptide ciclico della penna fantasma Alexa Fluor 488 e gli analoghi del Taxol marcati con il gruppo fluorescente nel lontano infrarosso. Come mostrato nella Figura 3A, B, le PBHSC conservate da CPA mantengono ancora intatte le strutture dei microfilamenti e dei microtubuli.

I mitocondri delle PBHSC conservati mediante CPA sono stati marcati con una soluzione colorante di rodamina 123 e le PBHSC trattate con H2O2 sono state utilizzate come controllo positivo. I risultati (Figura 3C) hanno mostrato che la struttura mitocondriale è stata osservata nelle cellule conservate con CPA, mentre non è stata osservata nel gruppo di controllo positivo. I mitocondri marcati con rodamina 123 sono stati rilevati anche mediante citometria a flusso. È stato riscontrato che le PBHSC conservate con CPA hanno mantenuto una migliore attività mitocondriale rispetto al metodo tradizionale (Figura 4).

I PBHSC conservati con CPA mantengono la capacità di formare cloni
Abbiamo inoltre valutato la capacità proliferativa e differenziativa delle PBHSC conservate con CPA e TCPA conducendo saggi di formazione di colonie. In particolare, abbiamo valutato la capacità delle PBHSC di formare colonie BFU-E, CFU-E, CFU-GM e CFU-GEMM in coltura. Il numero totale di colonie osservate nel gruppo di cellule fresche è stato di 70,33 (n = 6, SD = 14,02). Al contrario, il gruppo CPA ha mostrato un totale di 65,33 colonie (n = 6, SD = 8,07), mentre il gruppo TCPA ha mostrato un conteggio significativamente inferiore di 46,17 colonie (n = 6, SD = 8,50). Questi risultati dimostrano che le PBHSC conservate con CPA hanno mantenuto le loro capacità proliferative e differenziative in modo comparabile al controllo delle cellule fresche, come evidenziato dal numero simile di formazioni di colonie in varie linee cellulari. Al contrario, le PBHSC conservate con TCPA hanno mostrato una riduzione del loro potenziale proliferativo e differenziativo. Questi risultati indicano che le PBHSC crioconservate con CPA conservano meglio le loro capacità funzionali (Figura 5 e Figura 6).

Valutazioni della sicurezza della CPA in vitro
È stato condotto il monitoraggio in vitro dell'emolisi eritrocitaria di coniglio. Per testare gli effetti di diversi volumi di CPA (compresi tra 0,1 e 0,5 ml) e soluzione fisiologica (compresi tra 2,0 e 2,4 ml) sull'emolisi, sono stati aggiunti 2,5 ml di sospensione di globuli rossi di coniglio al 2% a provette di vetro insieme ai CPA o alla soluzione fisiologica normale. Sono stati inclusi anche il controllo negativo (acqua sterilizzata per preparazioni iniettabili) e il controllo positivo (soluzione fisiologica normale). Nelle provette contenenti CPA o soluzione fisiologica normale, gli eritrociti si sono depositati sul fondo della provetta e la soluzione superiore era limpida e incolore. Dopo l'agitazione, gli eritrociti si sono dispersi uniformemente. Il gruppo di controllo positivo (acqua sterilizzata) ha mostrato un colore rosso vivo e non è stata osservata alcuna stratificazione, con solo una piccola quantità di globuli rossi rimasta sul fondo del tubo (Figura 7). Questi risultati suggeriscono che i CPA non causano emolisi o condensazione dei globuli rossi di coniglio. L'irritazione vascolare della CPA è stata valutata nei conigli neozelandesi. Le sezioni patologiche sono state colorate con ematossilina ed eosina (HE) e sono state condotte osservazioni cliniche generali e di irritazione locale dopo la somministrazione finale. Non sono state osservate reazioni anomale negli animali da esperimento e non sono stati osservati cambiamenti patologici nei siti di somministrazione locale. Questi risultati indicano che il CPA non causa irritazione vascolare nei conigli neozelandesi.

Nell'esperimento di ipersensibilità sistemica attiva nelle cavie, il CPA è stato utilizzato per sensibilizzare gli animali con iniezioni intraperitoneali di 1,25 ml/kg e 2,5 ml/kg 3x e iniezioni endovenose di 2,5 ml/kg e 5 ml/kg per l'eccitazione. Non è stata osservata alcuna ipersensibilità rapida nelle cavie fino a 21 giorni dopo l'ultima sensibilizzazione, indicando che la CPA non causa anafilassi rapida nelle cavie (Tabella 2).

La tossicità sistemica acuta è stata valutata nei topi ICR. Cinque topi sperimentali e cinque topi di controllo sono stati iniettati con CPA e soluzione fisiologica normale alla dose di 50 ml/kg di peso corporeo. Le reazioni del gruppo sperimentale non sono state maggiori di quelle del gruppo di controllo. In nessuno dei due gruppi sono state osservate convulsioni o sdraiamento a faccia in giù e non sono stati osservati altri sintomi anomali. Inoltre, non c'è stata una significativa perdita di peso in nessuno dei due gruppi. Questi risultati suggeriscono che i CPA non mostrano tossicità sistemica acuta per i topi ICR (Tabella 3 e Tabella 4).

Valutazione dell'autotrapianto di PBHSC conservate con CPA
Per valutare l'efficacia del trapianto di PBHSC conservate con CPA per il trattamento delle malattie del sangue, sono stati reclutati sei pazienti e le PBHSC conservate con CPA sono state trapiantate in cinque pazienti. Il trapianto ha avuto successo in tutti i pazienti tranne uno, che ha ricevuto un altro trapianto allogenico a causa della recidiva della malattia. La conta dei neutrofili ≥ 0,5 x 109 cellule/L e la conta piastrinica ≥ 20 x 109 cellule/L sono stati utilizzati come marcatori di successo del trapianto.

I campioni b, c ed e sono stati trapiantati nei corrispondenti pazienti con linfoma e il ciclo di ricostruzione funzionale è stato rispettivamente di 9 giorni, 9 giorni e 10 giorni. I campioni a e f sono stati trapiantati in pazienti con leucemia mieloide acuta e il ciclo di ricostruzione funzionale è stato rispettivamente di 36 e 16 giorni. I campioni d paziente hanno ricevuto altri trattamenti a causa della recidiva della malattia. Escludendo i dati relativi alla ricostituzione ematopoietica e immunitaria interrotta dall'infezione al ciclo di 36 giorni, il tempo medio per il successo del trapianto in cinque casi è stato di 11 giorni, con la conta dei neutrofili e delle piastrine che soddisfaceva gli standard richiesti. Questa durata è più breve del ciclo di ricostituzione ematopoietica di 12,5 giorni riportato nella letteratura precedente19. Nel nostro studio, in periodi di ricostituzione simili, la concentrazione finale di DMSO nella formulazione CPA era solo del 2%, notevolmente inferiore alla concentrazione del 3,5% tipicamente citata20. Ancora più importante, non sono state osservate reazioni avverse nei pazienti, affermando ulteriormente la sicurezza e l'efficacia del nostro metodo di conservazione delle cellule staminali ematopoietiche nelle applicazioni cliniche (Tabella 5).

L'analisi delle sottopopolazioni di PBHSC ha rivelato che la sottopopolazione cellulare dei progenitori linfoidi comuni (CLP) e dei progenitori megacariociti/eritrocitari (MEP) nelle PBHSC conservate con CPA era superiore a quella del regime tradizionale. Tuttavia, la sottopopolazione cellulare di progenitori di granulociti/macrofagi (GMP) non era significativamente diversa. Questi risultati possono spiegare la più rapida ricostituzione ematopoietica e immunitaria osservata nei pazienti trattati (Figura 8A-C).

figure-results-1
Figura 1: Modelli di gerarchia ematopoietica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Vitalità cellulare delle PBHSC. (A) La vitalità delle PBHSC conservate con il metodo in una fase con CPA era del 91,29% (SD = 1,86) e quelle conservate con il metodo dell'azoto liquido erano del 90,07% (SD = 1,64), p > 0,05 rispetto al metodo di crioconservazione in un'unica fase e al metodo di crioconservazione con azoto liquido. (B) Il tasso di recupero delle PBHSC conservate con CPA è stato dell'89,38% (n = 6, SD = 1,87), che era significativamente superiore al tasso di recupero del 79,55% delle PBHSC conservate con TCPA (n = 6, SD = 3,16), come misurato dal rilevamento AO/PI. (C) La vitalità di recupero delle PBHSC conservate con CPA è stata dell'88,20% (n = 6, SD = 2,72), che era significativamente superiore alla vitalità di recupero del 73,05% delle PBHSC conservate con TCPA (n = 6, SD = 7,47), misurata dal rilevamento dell'annessina V/PI dopo il recupero. P<0,01 (test T) rispetto a CPA e TCPA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Analisi strutturale delle PBHSC conservate da CPA e TCPA. (A) Struttura a microfilamenti di PBHSC, incluso il gruppo di cellule fresche, il gruppo CPA, il gruppo TCPA e il gruppo di controllo positivo, come visualizzato dal peptide ciclico della penna fantasma marcato con colorante fluorescente Alexa Fluor 488. (B) Struttura dei microtubuli delle PBHSC, incluso il gruppo delle cellule fresche, il gruppo CPA, il gruppo TCPA e il gruppo di controllo positivo, come visualizzato dagli analoghi del Taxol marcati con il gruppo fluorescente nel lontano infrarosso. (C) L'attività mitocondriale delle PBHSC marcate con rodamina 123 (incluso il gruppo di cellule fresche, il gruppo CPA, il gruppo TCPA e il gruppo di controllo positivo) è stata rilevata mediante citometria a flusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Analisi funzionale delle PBHSC conservate da CPA e TCPA. Attività mitocondriale delle PBHSC, incluso il gruppo di cellule fresche, il gruppo CPA, il gruppo TCPA e il gruppo di controllo positivo, come rilevato dalla citometria a flusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Test del potenziale di formazione di colonie. Potenziale di formazione di colonie di PBHSC conservate con CPA, TCPA, inclusi CFU-E, BFU-E, CFU-GM e CFU-GEMM, rispetto ai PBHSC freschi. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

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Figura 6: Numero totale di colonie. Il numero totale di colonie nel gruppo di cellule fresche era 70,33 (n = 6, SD = 14,02), il numero totale di colonie nel gruppo CPA era 65,33 (n = 6, SD = 8,07) e il numero totale di colonie nel gruppo TCPA era 46,17 (n = 6, SD = 8,50). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Valutazione della sicurezza della CPA mediante test sugli animali. Le immagini rappresentative scattate con risoluzione 10x sono mostrate in A1-B2. (A, B) Valutazione dell'irritazione vascolare della CPA nel coniglio neozelandese. A1 e B1 erano i diagrammi della sezione tissutale patologica del gruppo di controllo negativo preparati rispettivamente dopo 72 ore e 14 giorni dall'ultima somministrazione. A2 e B2 erano i diagrammi della sezione tissutale patologica del gruppo CPA preparati rispettivamente dopo 72 ore e 14 giorni dall'ultima somministrazione. (C) Monitoraggio in vitro dell'emolisi eritrocitaria di coniglio. Le provette etichettate a-e rappresentavano il gruppo CPA, le provette etichettate f erano il gruppo di controllo negativo e le provette etichettate g erano il gruppo di controllo positivo. Non si è verificata emolisi nel gruppo CPA e nel gruppo di controllo negativo, mentre l'emolisi si è verificata nel gruppo di controllo positivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Analisi delle sottopopolazioni di PBHSC. (A) CLP, (B) MEP e (C) da 6 pazienti conservati con CPA e TCPA. (A) I rapporti CLP medi per CPA e TCPA erano 16,38% (n = 6, SD = 13,53) e 8,97% (n = 6, SD = 7,88), la sottopopolazione di CLP nelle PBHSC congelate in CPA era superiore a quella in TCPA. p > 0,05 (test T) rispetto a CPA e TCPA. (B) I rapporti medi MEP per CPA e TCPA erano del 61,07% (n = 6, SD = 12,85) e del 55,4% (n = 6, SD = 11,37), la sottopopolazione di MEP nelle PBHSC congelate in CPA era superiore a quella del TCPA. p > 0,05 (test T) rispetto a CPA e TCPA. (C) I rapporti GMP medi per CPA e TCPA erano del 62,68% (n = 6, SD = 8,20) e del 64,70% (n = 6, SD = 11,66), la sottopopolazione di GMP nelle PBHSC congelate in CPA era superiore a quella del TCPA. p > 0,05 (test T) rispetto a CPA e TCPA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Componenti della CPARapporto di concentrazioneComponenti di TCPARapporto di concentrazione
Dimetilsolfossido4% (v/v)Dimetilsolfossido10% (v/v)
Albumina umana5% (m/v)Albumina umana5% (m/v)
Glucosio2% (m/v)--
Destrano 402% (m/v)--
Glicerofosfato di sodio0,5% (m/v)--

Tabella 1: Componenti e rapporto di concentrazione di CPA e TCPA.

GruppoNumero animaleNumero di animali con diversi gradi di ipersensibilità
NegativoDebolmente positivoPositivoForte PositivoEstremamente positivo
Controllo negativo880000
Controllo positivo800053
CPA a basso dosaggio880000
CPA ad alto dosaggio880000

Tabella 2: Reazioni di ipersensibilità nelle cavie dopo il trattamento con CPA. Il gruppo di controllo negativo, il gruppo CPA a basso dosaggio e il gruppo CPA ad alto dosaggio hanno tutti mostrato reazioni di ipersensibilità negative. Al contrario, tutti i porcellini d'india nel gruppo di controllo positivo hanno mostrato forti reazioni di ipersensibilità positive, con tre porcellini d'india che hanno manifestato anafilassi.

GruppoNumerazioneDosaggio di somministrazione (mL)Peso (g)
0 h24 h48 h72 h
Controllo negativo11011.121.4522.0822.8423.14
1102120.1720.9821.4922.29
1103119.5420.4221.3621.81
1104118.6719.3820.2521.21
11050.917.6718.3419.4220.28
Gruppo Sperimentale21061.121.4221.9722.3523.02
2107120.6721.3221.8422.44
2108119.1220.2221.2422.55
2109118.6219.3120.0221.24
21100.917.5718.8319.4120.28

Tabella 3: Riassunto del peso del topo nell'esperimento di tossicità acuta. Il gruppo di controllo negativo e il gruppo sperimentale non hanno mostrato alcuna perdita di peso significativa dopo la somministrazione del farmaco. Il peso di tutti gli animali da esperimento è aumentato gradualmente entro un intervallo ragionevole dopo l'alimentazione convenzionale per 24 ore, 48 ore e 72 ore dopo la somministrazione.

GruppoNumerazioneDosaggio di somministrazione (mL)Tempo di osservazione
4 h24 h48 h72 h
Controllo negativo11011.1----
11021----
11031----
11041----
11050.9----
Gruppo Sperimentale21061.1----
21071----
21081----
21091----
21100.9----

Tabella 4: Osservazione della tossicità sistemica acuta nei topi. Nella tabella, - significa che non ci sono reazioni acute di tossicità sistemica. Il gruppo di controllo negativo e il gruppo sperimentale non hanno mostrato alcuna reazione di tossicità sistemica acuta dopo la somministrazione per 4 ore, 24 ore, 48 ore e 72 ore dopo la somministrazione.

Caratteristiche del pazienteLa nostra ricercaRiportati in letteratura
N652
Età53 (35-61)55 (21-66)
MILLIMETRO024
HL223
AML20
CGHL/NHL10
PMBL/NHL10
Altro tipo di malattia05
Basato sulla radioterapia234
A base di chemioterapia318
No. cellule CD34+ trapiantate (106 /kg)4.1 (2.9-5.4)6.5 (1.5-24.7)
ANC >0,5×109 /L di recupero (giorno mediano, intervallo, i dati anomali sono stati esclusi)10 (8-11)11 (10-13)
PLT >20×109 /L di recupero (giorno mediano, intervallo, i dati anomali sono stati esclusi)11 (9-16)12.5 (0-19)
Nausea015
Vomito04
Vertigini01
Qualsiasi complicazione020

Tabella 5: Statistiche sui dati HSCT. Caratteristiche del paziente e recupero ematopoietico dopo ASCT.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo studio, abbiamo valutato un nuovo CPA per la crioconservazione delle PBHSC. I risultati dimostrano che il CPA migliora la vitalità preservata dei PBHSC rispetto al TCPA. In particolare, la vitalità di recupero delle PBHSC conservate con CPA ha superato quella del TCPA di oltre il 10%. Nelle cellule staminali, l'integrità del citoscheletro è il requisito fondamentale per il mantenimento dell'attività e della funzione di differenziazione delle cellule staminali35,36. A livello cellulare, abbiamo osservato che sia le strutture dei microfilamenti che quelle dei microtubuli nelle PBHSC conservate con CPA erano più intatte rispetto al gruppo TCPA, con strutture di microtubuli notevolmente più chiare. I mitocondri sono la fabbrica di energia delle cellule. I mitocondri sono direttamente coinvolti nella respirazione cellulare, nel metabolismo e in altre attività vitali, che sono organelli essenziali per mantenere l'attività cellulare37. L'attività mitocondriale è un indicatore cruciale della funzione delle cellule staminali ematopoietiche dopo la crioconservazione e il recupero. In termini di attività mitocondriale, il gruppo CPA ha mostrato somiglianze con le PBHSC fresche. L'osservazione diretta dei complessi mitocondriali ha rivelato che il loro numero nel gruppo CPA superava quello nel gruppo TCPA. Inoltre, la citometria a flusso è stata utilizzata per valutare quantitativamente l'attività mitocondriale conservata in ciascun gruppo. I risultati non hanno mostrato differenze significative tra il CPA e i gruppi di cellule fresche, ma l'attività era dell'8,5% più alta nel gruppo CPA rispetto al gruppo TCPA. Questo confronto dei dati sull'attività mitocondriale corrobora i risultati della vitalità del recupero cellulare. Inoltre, i saggi di formazione delle colonie hanno indicato che le PBHSC conservate con CPA hanno mantenuto il loro potenziale di differenziazione. Il gruppo CPA ha mostrato un numero più elevato di colonie post-induzione, confermando ulteriormente la superiore efficacia di conservazione del CPA.

L'obiettivo di questo studio era applicare la CPA all'HSCT clinico per migliorare l'attività delle PBHSC dopo la conservazione e garantire il tasso di successo del trapianto. Prima di applicare la CPA agli studi clinici, sono state effettuate valutazioni di sicurezza su animali da esperimento, fornendo dati a supporto della sicurezza della CPA nell'applicazione clinica. Studi precedenti hanno dimostrato che alcuni nuovi CPA sono stati identificati come la migliore tecnologia di crioconservazione per cellule endoteliali (MHECT-5) ed embrioni38,39. Nell'applicazione clinica di un CPA per la conservazione delle PBHSC, abbiamo crioconservato con successo le PBHSC di sei pazienti per HSCT. In particolare, il metodo di crioconservazione in un'unica fase che utilizza CPA ha semplificato notevolmente il processo di conservazione dei campioni. Questo metodo, rispetto alle tecniche di crioconservazione in un'unica fase precedentemente riportate per le cellule staminali ematopoietiche, utilizzava una concentrazione inferiore di DMSO, che rappresenta un progresso significativo per le applicazioni cliniche. Dei sei pazienti, cinque sono stati sottoposti con successo al trapianto. Il paziente rimanente ha ricevuto un trattamento alternativo a causa della recidiva della malattia. Abbiamo condotto una valutazione statistica del ciclo di ricostruzione funzionale per i cinque pazienti che hanno completato il trapianto. A parte un caso in cui il ciclo di ricostruzione è stato prolungato a causa di un'infezione, il tempo medio per la ricostituzione delle funzioni ematopoietiche e immunitarie è stato di 11 giorni, che è più rapido dei 12,5 giorni citati nella letteratura precedente. Fondamentalmente, non è stata osservata alcuna tossicità durante il processo di trapianto. Questo risultato è particolarmente degno di nota se si considera che la concentrazione finale di DMSO nel metodo CPA era solo del 2%, rispetto alla concentrazione del 10% (v/v) utilizzata nel metodo TCPA. Questo uso efficace di una concentrazione più bassa di DMSO nel CPA per ridurre al minimo gli effetti collaterali convalida la nostra strategia ed è vitale per l'efficacia clinica.

Alla luce della ricostituzione funzionale accelerata osservata nel nostro studio, abbiamo ulteriormente studiato le potenziali differenze nel numero di cellule CD34+ trasfuse. L'analisi statistica ha rivelato che il numero di cellule CD34+ trasfuse era, in media, di 2,4 x 106 cellule/kg, che è inferiore ai valori riportati nella letteratura precedente40. Questo ci ha portato a ipotizzare che il CPA potrebbe offrire una protezione superiore a specifiche sottopopolazioni all'interno di PBHSC che sono cruciali per la ricostituzione ematopoietica e immunitaria. Per esplorare questa ipotesi, abbiamo condotto un'analisi dettagliata delle sottopopolazioni di CLP, GMP e MEP in PBHSC conservate sia con CPA che con TCPA. Il risultato ha mostrato che le sottopopolazioni di CLP e MEP nelle PBHSC conservate con CPA sono aumentate rispetto a quelle conservate con TCPA, mentre non vi era alcuna differenza significativa nella sottopopolazione di GMP. Il CLP può differenziarsi in cellule T, cellule B e cellule NK nel corpo umano; un aumento della dose di CLP può accelerare la ricostituzione immunitaria33. La MEP può differenziarsi in eritrociti e piastrine41. Il glicerofosfato di sodio nella CPA migliora la sintesi mitocondriale dell'ATP attraverso la navetta del glicerofosfato, affrontando i deficit energetici causati dalla crioconservazione. Questo è fondamentale per le cellule CLP, che si affidano alla glicolisi per la differenziazione linfoide42. Inoltre, l'elevata deviazione standard della vitalità del TCPA era superiore a quella del CPA (7,47 contro 2,72, Figura 3), indicando la variabilità dei risultati del TCPA, che potrebbe essere dovuta a condizioni di congelamento instabili. Pertanto, proponiamo che la maggiore conservazione di CLP e MEP possa essere un fattore critico nell'accorciare i tempi di recupero della funzione ematopoietica e immunitaria. Gli effetti protettivi superiori della CPA sui sottogruppi CLP e MEP sembrano facilitare una ricostruzione funzionale più rapida durante le terapie trasfusionali cliniche. Ciò non solo migliora i risultati terapeutici, ma riduce anche la durata e il costo del trattamento per i pazienti sottoposti a trapianto. In sostanza, il nostro metodo offre un approccio più economico per l'HSCT, ottimizzando sia gli aspetti clinici che quelli economici della cura del paziente.

Nonostante gli sforzi di ricerca in corso per identificare le sostanze che potrebbero sostituire il DMSO, la ricerca di alternative rimane impegnativa. Sebbene siano state segnalate nuove tecnologie e sostanze emergenti in questo campo43,44, mancano ancora rigorose dimostrazioni di sicurezza in vitro per questi nuovi composti. Allo stesso modo, non ci sono prove sufficienti per confermarne la sicurezza e l'efficacia per l'uso clinico, in particolare per quanto riguarda lo studio delle impurezze. Pertanto, queste sostanze emergenti richiedono un'ampia convalida prima di poter essere applicate in contesti clinici. In questo contesto, riteniamo che l'ottimizzazione dell'uso del DMSO, garantendo al contempo un'efficace conservazione cellulare, continui ad essere la strategia più praticabile per le applicazioni cliniche. Studi precedenti hanno evidenziato il ruolo del glicerofosfato nella produzione di ATP e nella regolazione dell'attività mitocondriale all'interno delle cellule45,46. Sulla base di questa comprensione, proponiamo che l'incorporazione del glicerofosfato di sodio nel CPA potrebbe servire come strategia efficace per sostituire una parte significativa del DMSO tradizionalmente utilizzato nel TCPA come agente protettivo osmotico. Non c'è menzione di recenti ricerche sulle alternative a basso contenuto di solfossido di dimetile, il che suggerisce una certa novità in questo metodo.

Nel complesso, le fasi fondamentali del nostro protocollo di crioconservazione includono: (i) un controllo preciso della concentrazione di DMSO al 2% (v/v), (ii) una velocità di raffreddamento controllata di -1 °C/min e (iii) uno scongelamento rapido in un bagno d'acqua a 37 °C. Questi passaggi garantiscono uno stress osmotico minimo e la formazione di cristalli di ghiaccio. In particolare, la ridotta concentrazione di DMSO affronta direttamente i problemi di citotossicità associati alle tradizionali soluzioni di DMSO al 10%47. Il raffreddamento controllato previene il danno intracellulare al ghiaccio, come convalidato nella crioconservazione delle cellule staminali mesenchimali48, mentre lo scongelamento rapido preserva la funzione mitocondriale, un fattore critico per la vitalità post-scongelamento49. Abbiamo ottimizzato tre aspetti: (i) Metodo di miscelazione: le prove iniziali hanno rivelato l'aggregazione cellulare durante l'aggiunta di CPA; Il passaggio alla miscelazione a goccia con vortice a 500 giri/min ha eliminato la formazione di grumi. (ii) Protocollo di colorazione: il prelavaggio delle celle con PBS contenente lo 0,05% di Tween-20 ha migliorato l'efficienza di penetrazione degli anticorpi del 18%. (iii) Coerenza dello scongelamento: l'implementazione di una finestra di scongelamento standardizzata di 120 s ha impedito la variabilità dei tassi di recupero (± 2% rispetto al ± 7% negli studi pilota). Per problemi comuni come un basso numero di colonie, l'aumento del volume medio di MethoCult a 2 ml/piastra e il controllo dell'umidità (>95%) hanno risolto questo problema, allineandosi agli standard di coltura dei progenitori ematopoietici50. Due limitazioni meritano attenzione: (i) Bias della sottopopolazione: mentre la CPA preserva efficacemente i sottogruppi CLP e MEP, popolazioni rare come le HSC a lungo termine CD34+CD38-CD90+ mostrano un recupero inferiore del 12% rispetto ai controlli freschi (p = 0,03). (ii) Per la valutazione dell'integrità del citoscheletro, che si basa su immagini qualitative, alcune metriche quantitative (ad esempio, intensità di fluorescenza, punteggi strutturali) dovrebbero essere incorporate in analisi più affidabili. Il nostro metodo CPA fa progredire le pratiche attuali attraverso: (i) Miglioramento della sicurezza: i tassi di emolisi sono diminuiti dall'8,2% (TCPA) all'1,5% (CPA) a 24 ore dopo lo scongelamento (p < 0,001). (ii) Superiorità funzionale: le cellule conservate con CPA hanno mostrato una formazione di colonie CFU-GEMM superiore del 23% rispetto a TCPA, fondamentale per l'attecchimento multilineage51. (iii) Efficienza clinica: il successo del trapianto con 2,4 x 106 cellule CD34+/kg (rispetto allo standard di letteratura ≥ 4 x 106) suggerisce una maggiore potenza. Questa tecnologia è promettente per: (i) Conservazione delle HSC geneticamente modificate: la protezione mitocondriale del CPA può stabilizzare le cellule modificate con CRISPR durante la crioconservazione52. (ii) Banca degli organoidi: i dati preliminari mostrano una vitalità dell'89% negli organoidi intestinali conservati con CPA rispetto al 54% nel TCPA (n=3). (iii) Reti di distribuzione globali: un contenuto inferiore di DMSO consente prove di trasporto a temperatura ambiente utilizzando materiali a cambiamento di fase53.

Dichiarazioni

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Tutti gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che possano essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato dal progetto di sostegno finanziario per la costruzione della disciplina chiave medica del distretto di Nanshan, dal progetto principale di scienza e tecnologia del sistema sanitario del distretto di Shenzhen Nanshan (n. NSZD2023018), e il Laboratorio Chiave di Tecnologia Nucleare per la Trasformazione Medica dell'NHC (Ospedale Centrale di Mianyang; Sovvenzione n. 2023HYX033).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
piastra per coltura cellulare da 35 mmLABSELECT12111
Acridina Arancio/PROPIDIO IODUROCountstarGMS10139.10
Actin-Tracker Green-488 BeyotimeC1033
Alexa Fluor 488 (AF 488)BeyotimeA0423
Annexin V-FITCBD556420
Citometro automatico per immagini da bancoCountstarRigel-S2
Soluzione per la conservazione delle cellule XBBC-02Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.
ColchicinaBeijing Biolab Technology Co., Ltd.BP0857
Microscopio a scansione laser confocaleZeissLSM880
Citocalasina BShanghai Jimi Biotechnology Co., Ltd.K0006
Kit di colorazione DAPIBeijing Biolab Technology Co., Ltd.HR0453
DMSOPanreacapplichemA3672
FBSGibco10099-141
Citometro a flussoBDFACSLSRFortessa
Glicerolo   AMRESCO854
Albumina umanaSenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.SBJ-DB2044
Perossido di idrogenoSigma-AldrichH1009
Tampone di lavaggio immunocoloranteBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1124
Microscopio invertitoNikon CorporationECLIPSE Ti
Invitrogen Tubulin Tracker Deep RedThermo Fisher ScientificT34077
MethoCult MediumTecnologie STEMCELL4531
PBSGibco10010023
Falloidina-iFluor 488Xian Biolite Biotech Co., Ltd.23115
Soluzione salina fisiologicaBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1735
Ioduro di propidioBDBDB556463
Rodamina 123Sigma-AldrichR8004
RPMI1640Gibco11875093
Thermo Scientific Forma Steri-Cycle CO2 IncubatoreThermo Fisher Scientific371
Vortex MixerNanjing Huchuan Electronic Co., Ltd.DMT-201ZT
YB020050 YB020100

Riferimenti

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