Articolo metodologico

Mutagenesi semi-casuale inducibile dalla luce blu su DNA esogeno specifico nel ceppo BL21 di Escherichia coli

DOI:

10.3791/68283

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20 giugno 2025

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1Central Laboratory, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, 2Department of Emergency Medicine, Mount Sinai Hospital, 3NNHS, 2024 International Genetically Engineered Machine Team, Luoyang Central Hospital, 4USC Alfred E. Mann School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Southern California

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo delineato descrive metodi semplificati per riconoscere qualsiasi DNA esogeno generando mutazioni solo su quei DNA esogeni in Escherichia coli.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le tecnologie di mutagenesi sono state ampiamente utilizzate nel miglioramento genetico delle variazioni, nell'evoluzione diretta e nell'ingegneria delle proteine. Tuttavia, la maggior parte dei metodi può indurre solo mutazioni genomiche casuali del DNA che sono incontrollabili, portando a deformità o addirittura effetti letali. Qui, sfruttando la fusione di tre sistemi: editor di basi di citosina (CBE), elementi p-Mag/n-Mag inducibili dalla luce blu e RNA polimerasi T7 divisa, questo metodo incorpora un sistema di mutagenesi semi-casuale controllabile dalla luce blu, specifico per regione del DNA.

Questo sistema può mutare la citosina in timina sul DNA a partire dal promotore T7 e terminando nel terminatore T7. Qualsiasi gene esogeno a valle del promotore T7 può essere potenzialmente mutato. Questi strumenti sono stati inoltre progettati in due parti per rendere il sistema controllabile con la luce blu. La prima parte è stata creata fondendo CBE con n-Mag e il gene della RNA polimerasi N-terminale-T7. La seconda parte ha comportato la fusione di p-Mag con la RNA polimerasi C-terminale-T7. Sotto la luce blu, queste due parti sono state assemblate per funzionare come generatore di mutazioni sul DNA tra il promotore T7 e il terminatore T7. Senza luce blu, p-Mag si stacca da n-Mag, liberando il CBE dall'editing del DNA.

Lo scopo di questo protocollo è quello di generare mutazioni casuali region-specific in Escherichia coli con il controllo della luce blu e validare ulteriormente i plasmidi mutati. Il sistema può essere adattato a un sistema di evoluzione in vivo in cui è possibile selezionare la funzione del gene di interesse e raccogliere le mutazioni desiderate per ulteriori studi.

Introduzione

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La mutazione casuale e la selezione naturale sono le forze chiave che guidano l'evoluzione, che ha generato una grande variazione genetica tra le specie. Il processo evolutivo è stato utilizzato come potente strumento per ingegnerizzare proteine con funzioni ottimizzate o nuove1. I tassi di mutazione naturale derivanti dalla replicazione del DNA sono stimati in circa una su 109 basi per divisione cellulare in più procarioti ed eucarioti2. I bassi tassi di mutazione naturale rendono impraticabile la generazione di una grande diversità genetica in laboratorio. Gli studi si sono concentrati sullo sviluppo di metodi che aumentano i tassi di mutazione per coprire il maggior numero possibile di siti in un determinato gene entro un ragionevole lasso di tempo.

Sono stati sviluppati più sistemi per ottenere tassi di mutazione più elevati negli studi di evoluzione di laboratorio 3,4,5,6,7,8,9,10. I sistemi di evoluzione in vitro sfruttano la PCR soggetta a errori, la mutagenesi di saturazione sito-diretta o la progettazione di librerie computazionali per introdurre mutazioni nei geni di interesse1. Le librerie di DNA vengono trasformate in cellule ospiti dove i prodotti proteici vengono sottoposti a screening o selezionati. Le fasi di mutagenesi e selezione nell'evoluzione in vitro non sono accoppiate, limitando l'efficienza e la scala delle popolazioni che possono essere generate11. I sistemi di evoluzione in vivo hanno superato i limiti introducendo sistemi di mutazione nelle cellule e accoppiando le fasi di mutagenesi e selezione per consentire un'evoluzione continua. I precedenti metodi di mutagenesi in vivo utilizzavano mutageni chimici 3,4 e ceppi mutatori 5,6. Tuttavia, questi metodi soffrono di bassi tassi di mutazione, mancanza di controllo e spettro mutazionale ristretto o irregolare12. Studi recenti hanno sviluppato nuovi e migliorati sistemi di evoluzione in vivo, rappresentati da OrthoRep, un sistema di replicazione del DNA soggetto a errori ortogonali 7,8; MutaT7, una fusione della citidina deaminasi con l'RNA polimerasi T79; ed EvolvR, una fusione della nickasi Cas9 con la DNA polimerasi10 soggetta a errori. Questi metodi hanno celle host, contesto di destinazione e facilità di implementazione diversi.

La T7 RNA polimerasi (T7 RNAP), un componente chiave del sistema MutaT7, è stata ampiamente studiata e ingegnerizzata nel campo della biologia sintetica. Frammenti di RNAP T7 sono stati co-espressi a diversi livelli in diversi punti temporali per costruire un allocatore di risorse13. È stato costruito un RNAP T7 diviso con frammenti C-terminali di diversa specificità del promotore per creare la porta logica AND14. La capacità dei frammenti di RNAP T7 di assemblarsi per ricostituire una polimerasi funzionale ha portato allo sviluppo di biosensori attivati dalla luce e da piccole molecole, in cui la dimerizzazione dei partner di interazione fusi a ciascuno dei terminali N e C di RNAP T7 genera un output trascrizionale15. L'RNAP T7 diviso è stato anche fuso con i domini n-Mag e p-Mag per costruire un controllo dell'espressione genica inducibile dalla luce in Escherichia coli16. Dopo l'attivazione della luce blu, i domini del magnete si dimerizzano, avvicinando spazialmente due domini dell'RNAP T7 diviso per svolgere la funzione della polimerasi. Questo sistema consente un controllo spazio-temporale preciso dell'espressione genica con una bassa espressione basale e un ampio intervallo dinamico.

Questo articolo presenta un protocollo per costruire un sistema di mutagenesi semi-casuale controllabile con luce blu, in vivo (Figura 1). È costruito sulla rAPOBEC1 deaminasi fusa con n-Mag-N-T7 RNAP. La co-espressione di p-Mag-C-T7 RNAP dallo stesso plasmide consente il controllo della polimerasi con la luce blu e le attività di editing delle basi. Il sistema combina la capacità di editing di base di rAPOBEC1 con RNAP T7 split controllato dalla luce. È stato convalidato in E. coli utilizzando la proteina fluorescente verde (GFP) come gene bersaglio, dove la sua intensità è selezionata mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Rispetto al sistema originale MutaT7, il nostro sistema controllato dalla luce blu introduce mutazioni semi-casuali nel gene bersaglio modulando l'intervallo di luce. Invece di convertire tutta la citosina in basi uracili nel gene bersaglio, genera un profilo di mutazione più ampio modificando un sottoinsieme dei nucleotidi attraverso il controllo della luce. Il sistema può essere facilmente adattato a un sistema di evoluzione in vivo in cui la GFP può essere sostituita da altri geni di interesse e la funzione può essere selezionata in base all'idoneità cellulare o alla sopravvivenza.

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Protocollo

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Il seguente protocollo descrive come eseguire la progettazione della mutagenesi del DNA esogeno utilizzando il sistema di mutagenesi della polimerasi CBE-Mag-T7 (Passaggio 1). Una volta costruito il plasmide di DNA esogeno, vengono descritte le fasi di trasformazione dei due plasmidi per esprimere la mutagenesi della polimerasi CBE-Mag-T7 nel ceppo BL21 di E. coli aggiungendo isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e seguito dall'irradiazione con luce blu per l'inizio della mutagenesi (Fasi 2-9.2). Le fasi di controllo della qualità per valutare quante mutazioni sono state generate su GFP o DNA esogeno sono state eseguite utilizzando il sequenziamento Sanger (Fasi 9.3-11.2).

1. Progettare DNA esogeno e costruire il sistema di mutagenesi della polimerasi CBE-Mag-T7

  1. Trova il sequenziamento del DNA esogeno o del cDNA utilizzando strumenti online (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene o https://www.uniprot.org/).
    NOTA: Qui, abbiamo usato la sequenza GFP come DNA esogeno per la mutagenesi della citosina.
  2. Sostituire il DNA gfp con il DNA di interesse utilizzando un apposito kit di clonazione.
    NOTA: Usiamo NheI per rimuovere il DNA gfp nel plasmide originale nel kit di assemblaggio della colonia di DNA. Un'alternativa è quella di lavorare con le aziende per la sintesi del DNA. Vedi File supplementare 1 per la sequenza plasmidica.
  3. Sintetizzare tutti i geni insieme al sistema di mutagenesi della polimerasi CBE-Mag-T7 e incorporarli nella spina dorsale pET-11a con resistenza all'ampicillina.
    NOTA: Abbiamo lavorato con un'azienda di sintesi del DNA per costruire questo plasmide e abbiamo ottenuto batteri stock di glicerolo contenenti il nostro plasmide bersaglio.

2. Attivazione del ceppo batterico

  1. Pipettare 10 μl di batteri madre di glicerolo sul bordo di una piastra di agar LB contenente 100 μg/mL di ampicillina. Strisciare i batteri da questo punto sulla piastra utilizzando un anello sterile.
  2. Incubare la piastra capovolta a 37 °C per una notte in un incubatore batterico.

3. Amplificazione plasmidica

  1. Prelevare una singola colonia dalla piastra e inocularela in una provetta conica da 50 mL con 15 mL di terreno LB contenente 100 μg/mL di ampicillina.
  2. Mettere la coltura in un'incubatrice agitata a 37 °C, 180 giri/min per 14-16 ore.

4. Estrazione plasmidi

  1. Prelevare 5-15 ml di coltura batterica durante la notte e trasferirli in una provetta da centrifuga. Centrifugare a 18.894 × g per 1 min.
  2. Raccogliere il pellet batterico e rimuovere con cura tutto il surnatante. Risospendere il pellet batterico in 500 μL di tampone di risospensione mediante vortex o pipettaggio.
  3. Aggiungere 500 μl di tampone di lisi alla provetta, mescolare delicatamente capovolgendo la provetta 8-10 volte e lasciarla riposare a temperatura ambiente per 5 minuti per lisare le cellule.
    NOTA: Confermare la lisi completa assicurandosi che non rimangano residui visibili di materiale flocculante bianco.
  4. Aggiungere 200 μl di tampone di equilibratura alla colonna di centrifuga posta in una provetta di raccolta. Centrifugare a 18.894 × g per 2 minuti ed eliminare il flusso. Riposizionare la colonna nella provetta di raccolta.
  5. Aggiungere 500 μL di tampone di neutralizzazione al lisato batterico, mescolare delicatamente capovolgendo la provetta 8-10 volte fino a quando appare un precipitato bianco e lasciarla riposare a temperatura ambiente per 5 minuti.
  6. Centrifugare a 18.894 × g per 5 minuti e trasferire il surnatante in una colonna filtrante. Centrifugare a 18,894 × g per 1 minuto per filtrare la soluzione.
  7. Aggiungere 0,3 volte il volume di isopropanolo alla soluzione filtrata, mescolare invertendo. Trasferire il composto nella colonna centrifuga bilanciata.
  8. Centrifugare a 18.894 × g per 1 minuto, scartare il flusso e reinserire la colonna nella provetta di raccolta.
  9. Lavare la colonna con 750 μl di tampone di lavaggio, centrifugare a 18.894 × g per 1 minuto ed eliminare il flusso.
  10. Centrifugare nuovamente la colonna a 18.894 × g per 1 minuto per rimuovere il tampone di lavaggio residuo.
  11. Posizionare la colonna di centrifuga in una nuova provetta da centrifuga. Aggiungere 100-200 μl di tampone di eluizione al centro della membrana della colonna. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 2-5 minuti e centrifugare a 18.894 × g per 2 minuti. Conservare il DNA plasmidico a -20 °C.

5. Trasformazione plasmidica (cellule di E. coli BL21 chimicamente competenti)

  1. Prelevare 50 μL di cellule BL21 scongelate chimicamente competenti su ghiaccio. Aggiungere 2 μL di DNA plasmidico del passaggio 4.11 e mescolare delicatamente. Incubare con ghiaccio per 30 min.
  2. Shock termico a 42 °C per 45 s, quindi trasferire immediatamente il tubo di nuovo nel ghiaccio per 2 minuti.
  3. Aggiungere 500 μl di terreno sterile LB a ciascuna provetta. Incubare a 37 °C, 180 giri/min per 1 ora per consentire il recupero.
  4. Centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti, scartare il surnatante in eccesso, lasciando circa 100 μL. Risospendere le cellule e la piastra su agar LB contenente 100 μg/mL di ampicillina. Incubare a testa in giù a 37 °C per una notte.

6. Espressione del generatore di mutazioni della polimerasi CBE-Mag-T7 (forma inattiva)

  1. Seguire i passaggi 5.1-5.4. Prima di stendere le cellule, applicare uniformemente 1 mM di IPTG sulla superficie dell'agar LB con ampicillina. Utilizzare l'acqua deionizzata come controllo per il confronto con i gruppi trattati con IPTG.
  2. Dopo che tutte le colonie sono cresciute, raccogliere 10-20 colonie da coltivare in 5 mL di terreno LB contenente 1 mM di IPTG in 100 mL di provette di vetro a fondo tondo con tappo a vite fenolico e rivestimento in gomma a 16 °C, 180 giri/min per 8 ore.
    NOTA: Tutte le colonie possono essere conservate a 4 °C per una conservazione a breve termine prima di procedere alla fase 7.

7. Attivare il generatore di mutazioni della polimerasi CBE-Mag-T7

  1. Raccogliere i batteri in provette di vetro a fondo tondo da 100 ml con tappo a vite fenolico e rivestimento in gomma e centrifugare a 18.894 × g per 2 minuti.
  2. Cambiare il mezzo in LB medio senza alcun IPTG.
    NOTA: Questo passaggio è importante per assicurarsi che il generatore di mutazioni della polimerasi CBE-Mag-T7 non possa modificarsi da solo. Abbiamo progettato il sistema lacI/O per proteggere i cluster di geni della polimerasi CBE-Mag-T7.
  3. Irradiare la piastra con un irradiatore a luce blu (470 nm, 4 mW/cm2) durante la coltura a 37 °C per il tempo predeterminato. Eseguire il sequenziamento Sanger per verificare le mutazioni e verificare se un'esposizione più lunga aumenta la frequenza delle mutazioni.
    NOTA: Qui, impostiamo l'esposizione alla luce blu per 0, 8, 16 e 24 ore.

8. Selezione di mutazioni per l'aumento della funzione proteica e la mutagenesi continua

NOTA: Qui, usiamo il gene gfp come DNA esogeno per la mutagenesi e stiamo cercando mutazioni che possano aumentare l'intensità fluorescente della proteina GFP.

  1. Raccogli le colonie, etichetta la posizione su una piastra e inocula le colonie raccolte in 100 μL di ddH2O.
  2. Trasferire i 100 μL di sospensione batterica in una piastra a 96 pozzetti e leggere l'intensità GFP a Ex/Em = 488/510 nm.
  3. Ripetere i passaggi da 6.3 a 9.2 fino a quando non è possibile identificare alcune colonie evidenti.

9. Fermare la mutagenesi e verificare le mutazioni

  1. Dopo aver eseguito diverse ore di irradiazione con luce blu, spostare tutti i batteri in un luogo buio a 4 °C per altri 15 minuti.
  2. Segui gli stessi passaggi di estrazione del plasmide descritti nel passaggio 4.
  3. Progetta i primer in avanti e all'indietro per il sequenziamento Sanger.
    NOTA: Qui, usiamo ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT come primer diretto e TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG come primer inverso per il sequenziamento Sanger.

10. Analisi dei dati e calcolo della frequenza delle mutazioni

  1. Visualizza la mutazione aprendo il file .ab1 e controlla manualmente i picchi.
  2. Analizza la frequenza delle mutazioni utilizzando strumenti online (ad esempio, lo strumento Mutation Surveyor).
  3. Carica il file di dati Sanger sullo strumento online e avvia l'analisi del tasso di mutazione.

11. Preparazione del brodo di glicerolo batterico

  1. Inoculare una singola colonia in una provetta contenente 5 mL di terreno LB con 100 μg/mL di ampicillina. Incubare a 37 °C, 180 giri/min per 12-16 ore.
  2. Mescolare la coltura batterica con il 50% di glicerolo in un rapporto 1:1. Aliquotare in provette da centrifuga da 1,5 mL. Conservare a -80 °C.

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Risultati

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I metodi descritti in questo protocollo riguardano la creazione di mutazioni su DNA esogeno utilizzando un generatore di mutazioni della RNA polimerasi CBE-Mag-T7 split. I geni per la costruzione del sistema di mutazione della RNA polimerasi CBE-Mag-T7 e il gene bersaglio per la mutagenesi sono tutti incorporati nella spina dorsale del plasmide pET-11a. La trasformazione e l'irradiazione con luce blu sono state eseguite con successo senza alcun danno al DNA genomico batterico, dimostrato attraverso numeri di colonie norm...

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Discussione

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Lo strumento di editing delle basi guidato dalla polimerasi è stato creato per la prima volta da Cravens et al. nel 2021, utilizzando una strategia di fusione delle proteine17. Le mutazioni su quattro nucleotidi del DNA sono state incorporate con successo a tassi superiori a 10-4 mutazioni per bp. Tuttavia, poiché le mutazioni sono state continuamente introdotte tra il promotore T7 e il terminatore senza un ulteriore controllo da parte dei ricercatori

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette da centrifuga coniche da 50 mLFalconeCLS352070
AmpicillinaTermo Chimica ScientificaJ60977.14
Irradiatore a luce bluThorlabsLIU470A
Kit di clonazione per l'assemblaggio del DNA NEBE5520S
Sintesi DNA/PrmersBGI Genomica
Kit Midi Plasmidico EndoFree CWBIOCW2106SBuffer P1: tampone di risospensione, Buffer P2: tampone di lisi, Buffer E3: tampone di equilibrio, Buffer PS: tampone di neutralizzazione, Buffer PW: tampone di lavaggio, Endo-Free Buffer EB: tampone di purificazione del DNA, RNase A Endo-Remover FM: tampone di rimozione delle endotossine, Spin Columns DM con provette di raccolta
GliceroloFisher ChemicalG33-4
Agitatore incubatoTermo ScientificoSK2001CPKG
IPTG (isopropiltio-beta;-galattoside)Invitrogen15529019
Lettore di micropiastreTermo ScientificoVarioskan LUX
Microscopio LeicaDMI 4000B
Multiskan FCTermo Chimica Scientifica
One Shot BL21 (DE3) E. coli chimicamente competenteInvitrogenC600003
Kit di purificazione del plasmidi midi a basso contenuto di endotossine PureLink FastInvitrogenCodice: A36227
Pyrex  Provette da centrifuga a fondo tondo per impieghi gravosi, con tappo a vite fenolico e rivestimento in gommaCorning  8422CLS8422100

Riferimenti

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