Articolo metodologico

Cambiamenti dinamici nella funzione polmonare e nel flusso sanguigno durante la progressione dell'adenocarcinoma polmonare nei topi mediante pletismografia di tutto il corpo ed ecografia Doppler

DOI:

10.3791/68306

⸱

10 giugno 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Clinical Medicine, Chengdu University of TCM, 2Chengdu Xinjin District Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3China Civil Affairs University, 4Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo utilizza la funzione polmonare del topo e l'ecografia Doppler come tecniche investigative, offrendo un metodo non invasivo, semplice ed efficiente per lo studio dell'adenocarcinoma polmonare.

Abstract

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L'adenocarcinoma polmonare (LUAD) è un tumore polmonare maligno comune e la sua progressione porta ad alterazioni della ventilazione e del flusso sanguigno, evidenziando le caratteristiche funzionali distintive del polmone in condizioni patologiche. Il sistema non invasivo di pletismografia di tutto il corpo (WBP) consente il monitoraggio in tempo reale della funzione polmonare e della reattività delle vie aeree nei topi svegli, evitando interferenze da tracheotomia e anestesia. L'ecografia Doppler (DU) per piccoli animali, utilizzando la tecnologia di imaging ad alta frequenza, cattura in modo non invasivo le strutture microvascolari e le variazioni della velocità del flusso sanguigno polmonare, offrendo un supporto cruciale per lo studio delle anomalie di ventilazione e perfusione associate al LUAD. In questo studio, è stato stabilito un modello LUAD in topi A/J utilizzando 100 mg/kg di 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanone (NNK). La WBP combinata con l'uranio impoverito è stata impiegata per monitorare la funzione polmonare e i parametri emodinamici nei topi. I risultati hanno rivelato un calo significativo (p < 0,05) nelle metriche chiave, tra cui il flusso espiratorio del 50% (EF50), la ventilazione al minuto (MV), il picco del flusso espiratorio (PEF), il picco del flusso inspiratorio (PIF), l'aumento della pausa (Penh) e il volume corrente (TV), nonché una marcata riduzione della velocità del flusso sanguigno arterioso polmonare (p < 0,05) nel gruppo modello durante la progressione del tumore. Questo approccio combinato cattura efficacemente le interruzioni funzionali che si verificano durante lo sviluppo patologico del LUAD nei topi, fornendo un metodo non invasivo ed efficiente per far progredire la ricerca sulle malattie respiratorie.

Introduzione

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L'adenocarcinoma polmonare (LUAD) è il sottotipo più comune di carcinoma polmonare non a piccole cellule1. Con l'aumento dell'inquinamento ambientale, dell'uso del tabacco e dell'invecchiamento della popolazione, la prevalenza globale di LUAD è aumentata ogni anno 2,3,4. Gli studi attuali indicano che i pazienti sperimentano un progressivo declino della funzione polmonare e disturbi emodinamici con l'avanzare del LUAD 5,6,7,8. Lo sviluppo di metodi non invasivi, efficienti ed economici per monitorare e valutare la funzione polmonare e le fluttuazioni del flusso sanguigno dell'arteria polmonare può fornire prove critiche per la gestione clinica del LUAD.

La ricerca esistente dimostra che la crescita del tumore LUAD ostruisce progressivamente le vie aeree, riduce la capacità polmonare e la ventilazione9 e innesca la secrezione infiammatoria di citochine che esacerba la stenosi delle vie aeree attraverso l'infiammazione cronica localizzata10. Di conseguenza, la diminuzione della funzione polmonare porta a un aggravamento dell'ipossia e ad anomalie del flusso sanguigno11,12. Questi cambiamenti patologici spesso si manifestano clinicamente come dispnea progressiva e costrizione toracica. Mentre l'imaging TC non riesce a catturare in tempo reale le anomalie dei parametri di funzione polmonare o le alterazioni emodinamiche indotte dalla progressione LUAD, anche le scansioni TC ripetute a breve termine aumentano l'esposizione alle radiazioni13. Al contrario, la pletismografia di tutto il corpo (WBP) e la flussimetria a ultrasuoni Doppler fungono da approcci complementari non invasivi, di facile utilizzo e riproducibili per il monitoraggio dinamico. L'integrazione di queste tecniche per monitorare la funzione polmonare e l'emodinamica potrebbe migliorare la valutazione della progressione della malattia e il processo decisionale terapeutico.

In questo studio, abbiamo utilizzato il 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanone (NNK) nei topi A/J per modellare l'inizio e la progressione del LUAD. La funzione polmonare e le alterazioni emodinamiche sono state monitorate longitudinalmente tramite WBP ed ecografia Doppler (DU) alle settimane 4, 10 e 20. Questo approccio mira a fornire nuove intuizioni sulla fisiopatologia LUAD e sulle strategie terapeutiche.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo studio sono stati approvati dal Comitato etico per il benessere degli animali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu e sono stati condotti in conformità con le leggi e gli standard pertinenti per l'etica della ricerca sugli animali (20240616IV). I topi femmina consanguinea di A/JGpt (7-8 settimane di età) sono stati mantenuti a 20-24 °C e un'umidità relativa del 40%-70%. Durante il ciclo luce-buio di 12 ore, ai topi è stato fornito mangime standard per animali e acqua purificata. Gli animali sono stati acclimatati a questo ambiente 7 giorni prima di iniziare gli esperimenti.

1. Creazione e preparazione del modello animale

  1. Sciogliere NNK in soluzione fisiologica normale per preparare una soluzione madre con una concentrazione di 10 mg/mL.
  2. Misurare la funzione polmonare utilizzando la WBP alle settimane 4 (giorno 28 dopo la modellazione), 10 (giorno 70 dopo la modellazione) e 20 (giorno 140 dopo la modellazione). La velocità del flusso sanguigno arterioso polmonare è stata misurata utilizzando l'uranio impoverito alla settimana 20 (giorno 140 dopo la modellazione). Prima di ogni misurazione, posizionare i topi in un ambiente appropriato per ridurre al minimo lo stress.

2. Test di funzionalità polmonare non invasivi

NOTA: Il sistema WBP misura la funzione respiratoria negli animali svegli che si muovono liberamente utilizzando una camera di misurazione appositamente progettata. La camera è dotata di schermi pneumotachi, che consentono all'aria di entrare e uscire dalla camera. La resistenza dell'aria creata dai vagli pneumotachici provoca piccole variazioni di pressione nella camera rispetto all'aria ambiente. Per misurare queste variazioni di pressione all'interno della camera è collegato un trasduttore di pressione sensibile, da cui è possibile derivare il flusso (chiamato flusso a scatola). Il software fornisce parametri respiratori come flusso e volume, insieme a report in tempo reale.

  1. Ottenere i seguenti componenti principali: controller WBP, trasformatore di alimentazione del controller, barra console, cavo barra console lungo e cavo barra console corto, colonna calibratrice, pletismografo WBP, trasduttore di flusso, sonda di temperatura e umidità, testa del nebulizzatore (viola), filtro di flusso di polarizzazione e tubo, PC.
  2. Assemblare l'hardware come descritto di seguito.
    1. Eseguire il collegamento del pannello posteriore come descritto di seguito.
      1. Collegare l'unità controller al computer utilizzando un cavo USB 2.0 e assicurarsi che la connessione sia stabile.
      2. Riempire la colonna con acqua del rubinetto fino alla linea di riempimento dell'acqua, collegarla alla porta sul retro del controller e assicurarsi che la linea sia asciutta.
      3. Collegare il trasformatore di alimentazione alla parte posteriore del controller, assicurandosi che sia ben collegato.
      4. A seconda di dove è posizionata la striscia della console, scegli un cavo lungo o corto da collegare al retro del controller.
      5. Spingere l'unità di controllo in posizione e sistemare la colonna di calibrazione e il trasformatore di alimentazione.
    2. Eseguire il collegamento del pannello frontale come descritto di seguito.
      1. Collegare ciascun sensore di flusso alla porta etichettata Sensore. Collegare ciascun filtro di flusso di polarizzazione e tubo alla porta del controller etichettata Bias Flow sul pannello frontale. Collegare un resistore di isolamento del flusso di polarizzazione all'estremità aperta del tubo di flusso di polarizzazione.
    3. Eseguire il collegamento della camera come descritto di seguito
      1. Posizionare la camera davanti all'unità di controllo, assicurandosi che sia posizionata su una superficie solida, stabile e priva di vibrazioni.
      2. Collegare il sensore di flusso alla camera e orientare il sensore in modo che il segno DSI sia rivolto verso l'alto.
      3. Collegare il tubo di flusso di polarizzazione (con resistenza di isolamento) alla porta inferiore del pletismografo.
      4. Rimuovere il tappo sulla parte superiore del pletismografo e sostituirlo con una testina del nebulizzatore (viola).
  3. Configurare il software come descritto di seguito.
    1. Avviare il software del programma di controllo ed effettuare l'accesso. Nella home page del controller, fare clic su Configurazione hardware. Avviare la procedura guidata di configurazione facendo clic su Nuova configurazione, quindi selezionare WBP (Numero di serie: DEMO-061) e fare clic su Avanti.
    2. Nel menu a discesa Specie, seleziona Mouse. Impostare la portata sui valori predefiniti. Seleziona 4 siti (ogni sito corrisponde a una camera, con un massimo di 4 camere per sessione). Assicurarsi che la velocità di flusso di polarizzazione per tutti i siti attivi sia coerente. Far corrispondere i siti nel software con le porte effettive sul controller WBP. Infine, fare clic su Fine per completare la configurazione.
  4. Raccolta dei dati
    1. Aprire il programma principale e calibrare le camere, poiché questo passaggio è fondamentale. Passa il mouse sopra l'hardware per visualizzare un'icona gialla dello strumento. Fare clic sull'icona per accedere all'interfaccia di calibrazione, quindi fare clic su Tutto per calibrare le camere per tutti e quattro gli animali contemporaneamente.
    2. Creare il protocollo di studio richiesto selezionando lo studio dose-risposta in Crea opzioni di studio. Impostare la configurazione GLP in modo che non segua GLP.
    3. Per configurare i parametri di misurazione e le sequenze di attività, fare clic su Nuovo parametro per aprire il Generatore di parametri e aggiungere i parametri da misurare. Usare le impostazioni predefinite per la sequenza di attività.
    4. Per avviare la raccolta dei dati, accedere alla pagina Il mio laboratorio nella workstation, quindi trascinare e rilasciare il protocollo di studio preparato in WBP per mouse.
    5. Fare clic sul pulsante triangolo rosso per ogni sito per iniziare l'acquisizione dei dati. Per avviare tutti e quattro i siti contemporaneamente, fare clic su Sessione > Riconosci tutti i siti. Dopo aver avviato l'acquisizione, la workstation aprirà la pagina Configura acquisizione e la utilizzerà per modificare le informazioni per ciascun mouse nei siti di acquisizione.
    6. Fare clic in sequenza su Sessione > Riconosci tutti i siti per avviare la raccolta dei dati. Per garantire che i risultati sperimentali siano veritieri e affidabili, stabilizzare i topi sperimentali in una stanza tranquilla per 30 minuti prima.
    7. Metti i mouse silenziosi nel barattolo di prova completamente sigillato. Fare clic sull'opzione Avvia nel sistema per raccogliere i dati. Il sistema raccoglie dati ogni 2 s, quindi raccogli almeno 10 min. Intercetta 4 minuti di dati nel mezzo. Qui, cinque animali sono stati testati in ogni gruppo e il test è stato ripetuto 3 volte.
    8. Fare clic su Crea report nella pagina Studio e selezionare il tipo di report. Salva i dati sperimentali in formato foglio di calcolo. In questo esperimento, per valutare la funzione polmonare dei topi sono stati utilizzati il picco di flusso espiratorio (PEF), il picco di flusso inspiratorio (PIF), la pausa aumentata (Penh) e il volume corrente (TV).

3. Misurazione della velocità del flusso sanguigno arterioso polmonare

  1. Preparazione degli animali
    1. Posizionare il topo in una camera di induzione dell'anestesia e anestetizzarlo con isoflurano al 5% (portata: 1 L/min). Fissare il mouse su una piattaforma per la movimentazione degli animali, mantenendo la temperatura della piattaforma a 35-37 °C per preservare la temperatura corporea.
    2. Posizionare la bocca e il naso del topo in una maschera per anestesia. Mantenere l'anestesia con isoflurano all'1%-2% (portata: 0,6-1 L/min). Quando il topo mantiene una posizione supina stabile con frequenza cardiaca stabile e ritmo respiratorio regolare, completo rilassamento muscolare, assenza di movimento degli arti, nessuna risposta di contrazione delle vibrisse, scomparsa del riflesso di ritiro del pedale, mucose rosa e nessuna dilatazione pupillare, si ritiene che abbia raggiunto una profondità di anestesia appropriata.
    3. In questa fase, applicare 2-3 mg di unguento veterinario sul sacco congiuntivale inferiore utilizzando un batuffolo di cotone sterile. Accarezzare delicatamente le palpebre superiori e inferiori per favorire la chiusura senza comprimere il bulbo oculare, garantendo una distribuzione uniforme dell'unguento su tutta la superficie corneale.
  2. Preparazione dell'area di imaging
    1. Rimuovere i peli del torace utilizzando una crema depilatoria e un dispositivo depilatorio. Pulire l'area trattata con una garza umida o un fazzoletto bagnato, quindi applicare l'agente accoppiante preriscaldato a 37°C in modo uniforme con un batuffolo di cotone per ottenere uno spessore uniforme di 0,3 mm, garantendo l'assenza di bolle d'aria visibili.
  3. Ecografia Doppler
    1. Utilizzare una sonda ecografica Doppler da 40 MHz per misurare la velocità del flusso sanguigno arterioso polmonare dalla vista dell'asse lungo parasternale. Inclinare la sonda di 45° a sinistra e il tavolo operatorio di 15° a destra. Abbassare la sonda dal lato destro del torace e regolare con precisione gli assi X e Y per localizzare il ventricolo destro e l'arteria polmonare, guidati dalle loro relazioni spaziali anatomiche, dalle caratteristiche morfologiche e dalla direzione del flusso emodinamico.
    2. Premere il pulsante CF per passare alla modalità Doppler. Visualizza il segnale blu del flusso sanguigno arterioso polmonare. Posizionare la linea di campionamento sull'arteria polmonare e premere il pulsante PW per visualizzare lo spettro del flusso sanguigno arterioso polmonare.
    3. Premere il pulsante Blocca per bloccare l'immagine, quindi premere il pulsante Misura e selezionare l'opzione Velocità sul touchscreen. Posizionare la linea di misurazione al picco dello spettro per ottenere la massima velocità del flusso sanguigno arterioso polmonare.
  4. Acquisizione dati
    1. Utilizza il software di analisi offline per selezionare i dati Doppler pulsati arteriosi polmonari. Accedi al pacchetto di misurazioni cardiache, seleziona la funzione RV e PV e visualizza la velocità del flusso sanguigno arterioso polmonare e le immagini salvate.

4. Analisi dei dati

  1. Utilizzare R4.4.2 e GraphPad Prism 9.5.1 per l'analisi dei dati e tracciare i dati. I confronti intergruppo dei dati di funzionalità polmonare sono stati eseguiti utilizzando campioni indipendenti t-test, mentre i confronti intra-gruppo hanno utilizzato misure ripetute ANOVA. I confronti della velocità del flusso sanguigno arterioso polmonare tra i gruppi sono stati analizzati con campioni indipendenti t-test, con significatività statistica impostata a p < 0,05.

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Risultati

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Per convalidare la fattibilità, l'accuratezza e la riproducibilità della funzione polmonare e della metodologia di valutazione del flusso sanguigno arterioso polmonare, abbiamo tracciato le curve medie minuto per minuto di PIF, PEF e flusso espiratorio al 50% della capacità vitale (EF50, 10x ingrandito) durante il periodo di monitoraggio della quarta settimana nel gruppo bianco (Figura 1A). Come mostrato in questo pannello, le tre curve corrispondenti mostrano un alto grado di conformità nel...

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Discussione

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In questo studio, NNK combinato con topi A/J è stato selezionato per creare un modello di adenocarcinoma polmonare secondo i rapporti precedenti. Studi pertinenti hanno dimostrato che NNK combinato con topi A/J può iniziare ad avere una formazione tumorale minima nella 10asettimana e una formazione tumorale stabile nella 16a-20a settimana 18,19. Pertanto, abbiamo selezionato il test alla 4ase...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il professor Cong Huang della Scuola di Scienze Mediche di Base dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu, per il loro sostegno. Questa ricerca è stata supportata dal Sichuan Science and Technology Program (numero di approvazione del progetto: 2024YFFK0173)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Topi A/JGemPharmatech LLC.
provette EDTA da 0,5 mlLabshark 
1-butanone,4-(metilnitrosoammino)-1-(3-piridinil)Gu Shi Gong Yuan Medical Equipment Co.
75% etanoloChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd2023052901
Camera di induzione per anestesiaShanghai Tawans Intelligent Technology Co., Ltd.MZ-MR
Crema depilatoriaShanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.
Dispositivo depilatorioShanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.3180
IsofluraneShanghai Duma Biotechnology Co., Ltd.DM-M9462
Nastro medicoBeijing Lanbokangs Technology Co., Ltd.19-5023
tricorder medicoMedChemexpress69652
Soluzione tampone PBSShanghai Fusheng Co., Ltd.A-RY5256
Soluzione salina (medicina)Beijing Biolabs Technology Co.GL1736‌
Agente di accoppiamento ad ultrasuoniQisheng (Shanghai) Medical Equipment Co., Ltd.
N000018130201070N58977020230623Fornitore verificato -20212060273

Riferimenti

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