Articolo di ricerca

Valutazione multimodale dell'effetto protettivo del gentiopicroside nel danno delle cellule HepG2 indotto da CDCA

DOI:

10.3791/68320

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25 luglio 2025

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1School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Internal Medicine of Traditional Chinese Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 4Institute of High Altitude Multimorbidity/TCM-Integrated High Altitude Medicine Center, Hospital of Chengdu University of TCM, 5Chengdu Tianxing Zhiyuan Biotechnology Co., Ltd.

In questo articolo

Sommario

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Questo studio ha dimostrato che il gentiopicroside può trattare il danno epatico colestatico controllando la produzione e il metabolismo degli acidi biliari e dei lipidi e prevenendo lo stress ossidativo e le risposte infiammatorie.

Abstract

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È stato dimostrato che il principale componente attivo di Swertia chirayita, il gentiopicroside (GPS), protegge il fegato nei casi di colestasi. Al fine di chiarire il meccanismo protettivo del GPS sul danno epatico colestatico, le cellule HepG2 sono state trattate con acido chenodesossicolico (CDCA) per simulare l'ambiente di colestasi in vitro, e il metodo CCK-8 è stato utilizzato per determinare l'effetto protettivo del GPS sulle cellule HepG2. Utilizzando un kit biologico, sono stati rilevati i contenuti intracellulari di TBA, T-CHO, TG, ALP, ALT, AST, GSH, IL-1β, IL-6, TNF-α, SOD e MDA. La microscopia laser confocale è stata utilizzata per confermare il livello di ROS. L'espressione delle cellule HepG2 di SHP-2, Tgr5, CYP7A1 e NTCP è stata valutata utilizzando l'immunofluorescenza e l'analisi Western blot. Il software Autodock è stato quindi utilizzato per verificare l'attracco molecolare dei suoi principali principi attivi. I risultati hanno dimostrato che il GPS ha prevenuto in modo significativo il danno che il CDCA ha causato alle cellule HepG2. Questo effetto protettivo potrebbe essere stato ottenuto controllando la produzione e il metabolismo degli acidi biliari e dei lipidi all'interno della cellula e prevenendo lo stress ossidativo e le risposte infiammatorie.

Introduzione

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Il sito metabolico dell'apparato digerente del corpo è il fegato. La secrezione biliare è un meccanismo chiave nel processo di catabolismo dei grassi del sistema epatobiliare. I costituenti primari della bile, gli acidi biliari, vengono rilasciati dalle cellule del fegato e sono fondamentali per preservare l'equilibrio del metabolismo dei grassi. Sia per gli individui sani che per i casi malati, i processi fisiologici e patologici del fegato dipendono dall'equilibrio degli acidi biliari liberi e coniugati nel fegato. Se questo equilibrio viene alterato, la circolazione degli acidi biliari non funzionerà normalmente, il che può portare a colestasi intraepatica e conseguente danno epatico1. Secondo una ricerca già condotta, il danno epatico colestatico (CLI) è una condizione legata a disturbi metabolici, squilibrio del microbiota intestinale e necrosi delle cellule epatiche2. È causato da un'ostruzione del flusso biliare e dall'accumulo di acidi biliari nelle cellule epatiche per la CLI. I casi gravi di CLI possono progredire in cirrosi epatica, fibrosi epatica e insufficienza epatica3. Attualmente, il meccanismo alla base della CLI è ancora poco chiaro e complesso e la maggior parte dei pazienti riceve una bassa efficacia dalla terapia farmacologica4 insieme a significativi effetti collaterali5. Di conseguenza, una delle questioni più urgenti che la comunità medica deve affrontare oggi è la ricerca di farmaci CLI efficaci.

La ricerca attuale ha dimostrato l'importanza di alcuni recettori nucleari nel metabolismo degli acidi biliari6. Tra questi, il recettore degli acidi biliari è un recettore regolatore cruciale degli acidi biliari che può legarsi ai BA e attivare la proteina tirosina fosfatasi (SHP)7. D'altra parte, un eccessivo accumulo di BA negli epatociti che provoca colestasi inibirebbe negativamente il recettore SHP e attiverebbe il recettore CYP7A1 (citocromo P450 7A1), che porterà alla produzione di acido biliare8. Inoltre, ha bloccato il recettore degli acidi biliari TGR5 accoppiato a proteine G dalla secernenza di BA e ha stimolato il recettore del polipeptide cotrasportatore del taurocolato di sodio (NTCP) per trasportare i BA. Provoca l'accumulo di acidi biliari nelle cellule epatiche, danneggiando il fegato9. Di conseguenza, ulteriori ricerche su questo meccanismo potrebbero far luce su opzioni di trattamento CLI più praticabili.

Con una lunga storia di utilizzo in medicina, la Swertia chirayita è una medicina tradizionale tibetana cinese. È considerata la migliore Tida ed è spesso usata dalla gente del posto per trattare le condizioni della cistifellea e del fegato10. È spesso usato per trattare calcoli biliari, colecistite, cirrosi, epatite e altre malattie del fegato11. Recenti ricerche hanno rivelato che alcuni componenti chimici iridoidi di Swertia, così come i suoi principi attivi, hanno un buon effetto terapeutico sulle malattie del fegato come la fibrosi epatica e il danno epatico acuto 12,13,14. I principi attivi di Swertia chirayita alleviano le malattie del fegato abbassando l'infiammazione15 e le sue proprietà antiossidanti16. La nostra ricerca preliminare ha dimostrato che la formula del composto della medicina tibetana con Swertia chirayita come ingrediente principale mostra un effetto terapeutico favorevole sulla CLI, suggerendo che la Swertia chirayita ha un potenziale come trattamento per la CLI17. Il principale ingrediente attivo che viene estratto e purificato da Swertia chirayita è il GPS (Gentiopicroside)18, che ha una serie di azioni farmacologiche, come la protezione del fegato19, la regolazione del metabolismo del glucosio20, il miglioramento del microbioma intestinale21 e le proprietà antitumorali22. Ricerche precedenti hanno dimostrato che il GPS migliora il danno epatico in condizioni colestatiche e diminuisce la colestasi intraepatica sovraregolando l'espressione dei trasportatori degli acidi biliari23,24. Analogamente, la ricerca condotta sia in vivo che in vitro ha dimostrato che il GPS può ridurre il danno epatico migliorando il metabolismo dei lipidi, riducendo l'infiammazione e riducendo lo stress ossidativo25,26.

Le cellule HepG2 sono frequentemente utilizzate negli studi in vitro sulle malattie epatiche perché mostrano un'attività enzimatica metabolica degli epatociti27. Nel frattempo, gli epatociti possono secernere più bile se esposti a una delle quattro forme di acidi biliari liberi, che includono il CDCA28. Di conseguenza, il CDCA può essere impiegato per creare un modello cellulare di danno epatico colestatico e imitare l'ambiente colestatico in vitro. Dato che il danno epatocitario indotto da CDCA è mediato in modo critico dallo stress ossidativo e dalle vie infiammatorie e considerando gli effetti antiossidanti e antinfiammatori documentati del GPS in altri contesti epatici26, ipotizziamo che il GPS possa conferire protezione contro il danno epatico colestatico alleviando la citotossicità indotta da CDCA nelle cellule HepG2. Questo lavoro ha studiato l'effetto protettivo del GPS sulla CLI e il suo meccanismo molecolare utilizzando un modello di danno indotto da CDCA alle cellule HepG2.

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Protocollo

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Coltura cellulare e trattamento
Le cellule HepG2 e i terreni MEM sono stati acquistati da un fornitore commerciale. Le cellule HepG2 sono state coltivate in terreni MEM integrati con il 10% di FBS, l'1% di penicillina 100 U/mL e 100 U/mL di streptomicina, a 37 °C e 5% di atmosfera di CO2 . Dopo l'adesione cellulare, i terreni di coltura sono stati modificati. Le cellule sono state coltivate in un rapporto 1:3 dopo 2-3 giorni e sono state utilizzate nell'esperimento una volta che la coltura cellulare ha raggiunto l'80% di confluenza.

Saggio di vitalità cellulare
Il giorno 1, le cellule sono state seminate a 2 x 104 cellule HepG2 (2 x 105 cellule/mL, 100 μL per pozzetto) in una piastra a 96 pozzetti in sei repliche29. Il giorno 2, dopo 24 ore dall'inoculazione, le cellule sono state trattate con CDCA a diverse concentrazioni di CDCA (0, 20, 40, 60, 80, 100 μM) per 12 ore. La vitalità cellulare è stata rilevata con il metodo CCK-8. Dopo 24 ore di semina iniziale delle cellule, le cellule sono state trattate con CDCA a diverse concentrazioni di GPS (0, 25, 50, 100, 200, 400 e 800 μM) per 24 ore. Il giorno 3, la vitalità cellulare è stata rilevata con il metodo CCK-8. Il giorno 4, 2 x 104 cellule HepG2 (2 x 105 cellule/mL, 100 μL per pozzetto) sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti in sei repliche per 24 ore. Il giorno 5, le cellule vengono separate in sei gruppi: Controllo, Modello, Acido ursodesossicolico (UDCA) e GPS: 25 μM, 50 μM e 100 μM. Escludendo il gruppo di controllo, la soluzione di CDCA da 60 μM è stata aggiunta a tutti i gruppi per 12 ore. Quindi la soluzione UDCA (60 μM) e la soluzione GPS (25 μM, 50 μM e 100 μM) sono state aggiunte per 24 ore, rispettivamente all'UDCA e ai 3 gruppi GPS. Il giorno 6, la vitalità cellulare è stata rilevata con il metodo CCK-8.

Saggio delle citochine
Secondo la letteratura riportata, i kit TNF-α, IL-6 e IL-1β sono stati utilizzati per rilevare i livelli di fattori infiammatori nelle cellule HepG2 dopo diversi trattamenti30. Dopo 24 ore di intervento CDCA o CDCA+GPS, scartare il terreno di coltura e sciacquarlo con PBS. Centrifugare la sospensione cellulare a 69 x g per 10 minuti, scartare il surnatante e prelevare il precipitato cellulare. Aggiungere la soluzione di PBS e omogeneizzare in condizioni di bagno di acqua ghiacciata per preparare omogeneizzati cellulari. Dopo una centrifugazione di 10 minuti a 10.005 x g e 4 °C, il surnatante è stato rimosso e la tecnica BCA è stata utilizzata per misurare la proteina totale nel contenuto cellulare. Secondo le istruzioni del produttore, i livelli di TNF-α, IL-6 e IL-1β nel surnatante cellulare sono stati determinati mediante ELISA. L'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre multifunzione.

Rilevamento di TBA, TG e T-CHO
I test TBA, TG e T-CHO sono stati utilizzati in conformità con le istruzioni del kit per identificare il metabolismo degli acidi biliari e dei lipidi delle cellule HepG231. TBA, TG e T-CHO sono stati acquistati commercialmente. Dopo che i precipitati cellulari sono stati frantumati ad ultrasuoni in un bagno di acqua ghiacciata, l'omogeneizzato cellulare è stato preparato aggiungendo lisato RIPA per 30 minuti. L'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre multifunzione. Dopo l'aggiunta di soluzioni di lavoro BCA a ciascun pozzetto e l'omogeneizzazione delle cellule, l'assorbanza è stata misurata a 562 nm utilizzando un enzimoletere e il periodo di incubazione è stato di 30 minuti L'assorbanza del prodotto standard è stata utilizzata per costruire la curva standard e la seguente formula è stata utilizzata per ottenere il valore di assorbanza:
Contenuto TBA (μmol/gprot) = (Unbianco-campione-A)/(Unbianco-A standard)×Calibrazione C/Cpr
T-Cho, contenuto di TG (mmol/gprot) = (Uncampione-A bianco)/(Uno standard-A bianco)×Cstandard/Cpr

Valutazione della funzionalità epatica
La funzionalità epatica è stata valutata utilizzando ALT, AST e ALP. ALT, AST e ALP sono stati acquistati commercialmente. Dopo due cicli di pulizia del tampone PBS sulle cellule raccolte, le cellule sono state centrifugate per 10 minuti a 69 x g, il surnatante è stato rimosso, le cellule sono state precipitate, è stato aggiunto il tampone PBS e l'omogenato è stato creato mediante frantumazione ultrasonica in un bagno di acqua ghiacciata. Sono stati quindi impostati i fori di prova e di controllo. Il tavolo operatorio è stato seguito aggiungendo il reagente, agitando e mescolando delicatamente la piastra forata e lasciandola riposare a temperatura ambiente per 15 minuti. Il valore OD di ciascuna lacuna è stato determinato utilizzando un enzimotore con una lunghezza d'onda di 505 nm. Il valore assoluto OD è stato quindi inserito nella curva standard ed è stata eseguita un'ulteriore analisi quantitativa utilizzando la formula.

Determinazione delle attività SOD, MDA, GSH
L'attività SOD, il contenuto di MDA e il contenuto di GSH sono stati valutati rispettivamente in conformità con le istruzioni del produttore. SOD, MDA e GSH sono stati acquistati commercialmente. Per dirla in breve, è stata utilizzata una piastra a sei pozzetti per inoculare le cellule. Dopo il trattamento, le cellule sono state sottoposte a pretrattamento (raccolta e rottura) secondo le istruzioni sperimentali del kit. Le soluzioni di lavoro appropriate sono state quindi versate sulla piastra di rilevamento delle celle dopo che i fori vuoti, i fori standard e i fori di misurazione erano stati impostati in conformità con le fasi operative delle istruzioni. Successivamente, le cellule vengono coltivate alla temperatura e alla durata indicate nelle istruzioni del kit. Un kit di rilevamento dei BCA è stato quindi utilizzato per quantificare il contenuto proteico. Alla fine, l'assorbanza è stata determinata alla lunghezza d'onda appropriata ed è stata condotta un'analisi quantitativa più approfondita dell'indice di stress ossidativo.

Rilevamento di variazioni dei ROS nelle cellule HepG2 utilizzando la sonda DCFH-DA
È stata effettuata una coltura di routine per la conta cellulare. Le cellule HepG2 con una densità di 1 x 105 cellule/mL sono state inoculate in piastre con fondo di vetro da 1,5 mL ciascuna e coltivate secondo il metodo sopra descritto. Dopo la coltura, il terreno è stato scartato e le cellule sono state lavate con PBS. Il DCFH-DA è stato diluito a una concentrazione di 1:1000, aggiunto a 1,5 mL di diluente per pozzetto e incubato per 20 minuti. Dopo l'incubazione, le cellule sono state risciacquate 3 volte con la soluzione di coltura di base MEM. Quindi, a ciascuna piastra sono stati aggiunti 100 μl di terreno di montaggio anti-dissolvenza con DAPI. Un microscopio confocale a fluorescenza è stato utilizzato per visualizzare e scattare foto a 488 nm per l'eccitazione e 525 nm per l'emissione32.

Imaging in immunofluorescenza
Le cellule sono state lavate 3 volte con tampone PBS dopo l'incubazione. Dopo essere state fissate per 30 minuti con paraformaldeide al 4%, le cellule sono state pulite utilizzando un tampone PBS su una tavola vibrante. Il diluente è stato aggiunto, quindi refrigerato a 4 °C al riparo dalla luce per tutta la notte. Successivamente, le cellule sono state rivestite con diluente fluorescente e incubate al riparo dalla luce per 1 ora a 37 °C. Dopo l'incubazione, le cellule sono state lavate tre volte con tampone PBS. Dopo la fissazione con paraformaldeide al 4% per 30 minuti, le cellule sono state risciacquate con tampone PBS su un agitatore rotante. Successivamente, sono stati aggiunti 150 μl di diluente per anticorpi primari e incubati per una notte a 4 °C in condizioni di protezione dalla luce. Il diluente anticorpale primario è stato recuperato, seguito dall'aggiunta di un volume adeguato di tampone PBS e dall'agitazione per 5 minuti; Questa procedura di lavaggio è stata ripetuta tre volte. Ogni piastra ha quindi ricevuto 150 μl di diluente anticorpale secondario fluorescente ed è stata incubata a 37 °C per 1 ora in un incubatore protetto dalla luce. Un volume appropriato di tampone PBS è stato aggiunto a ciascuna piastra e lavato su uno shaker rotante per 8 minuti, ripetuto per tre cicli. Infine, le cellule sono state ricoperte con una quantità sufficiente di soluzione colorante DAPI per 10 minuti, montate con un mezzo di montaggio anti-dissolvenza e sottoposte a imaging utilizzando un sistema di imaging a super-risoluzione33.

Analisi del western blot
Dopo vari trattamenti, l'intera proteina delle cellule HepG2 è stata estratta utilizzando il lisato RIPA e la concentrazione proteica è stata accertata utilizzando la tecnica BCA. Dopo aver isolato la proteina bersaglio utilizzando SDS-PAGE al 10%, è stata trasferita su una membrana PVDF da 0,45 μm. Successivamente, la membrana è stata sigillata per 1,5 ore a 25 °C utilizzando il 5% di BSA. Gli anticorpi primari contro SHP-2 (1:1000), CYP7A1 (1:1000), Tgr5 (1:1000), NTCP (1:1000) e β-actina (1:1000) sono stati incubati per una notte a 4 °C. Successivamente, la membrana è stata incubata con l'anticorpo secondario immunoglobulina G anti-coniglio di capra (1:10000) coniugato con perossidasi di rafano per 2 ore a 25 °C. Le bande rivestite di perossidasi sono state quindi osservate utilizzando una soluzione chemiluminescente ECL ad altissima sensibilità e le immagini sono state scattate utilizzando un sistema di imaging34.

Docking molecolare
Come riportato, il processo di docking molecolare è stato eseguito secondo le seguenti procedure35. La struttura del farmaco small molecule.mol2 è stata scaricata dalla piattaforma ChemicalBook e la struttura .sdf della proteina ligando è stata scaricata dalle piattaforme Uniprot e RCSBPDB. Il ligando e le molecole d'acqua sono stati rimossi dal software Pymol e la proteina del ligando è stata importata nel software AutoDock per l'idrogenazione e il rilevamento. L'output finale è in formato .pdbqt. L'analisi della docking box, RunAutoGrid, RunAutoDock e AutoDock Tools è stata eseguita nel software AutoDock ed è stata salvata l'energia di legame minima di ciascun gruppo di risultati di docking. È stata selezionata la conformazione con la più bassa energia di legame libera di ciascun gruppo e la sua conformazione ligando-recettore è stata visualizzata dal software Pymol.

Analisi statistica
I dati di cui sopra sono stati ordinati statisticamente utilizzando GraphPad Prism 9.2 e tutti i risultati sperimentali sono stati riportati come media ± SD. Al fine di confrontare statisticamente i dati tra i gruppi, è stata utilizzata l'ANOVA unidirezionale. La differenza tra i due gruppi è stata ritenuta significativa quandop < 0,05.

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Risultati

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La concentrazione di CDCA è stata impostata su un gradiente di concentrazione di 0 μM, 20 μM, 40 μM, 60 μM, 80 μM e 100 μM per gli esperimenti. Quando la concentrazione di CDCA era di 60 μM, l'attività cellulare era significativamente diversa da quella del gruppo di controllo e infine 60 μM sono stati utilizzati come concentrazione di CDCA (Figura 1A). I risultati hanno mostrato che dopo l'incubazione per 24 ore dopo la somministrazione del farmaco, non c'era alcuna differenza significativa ...

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Discussione

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La CLI è una malattia del fegato causata dall'ostruzione della formazione, della secrezione o dell'escrezione biliare. Si manifesta clinicamente come prurito, osteoporosi e si sviluppa anche in fibrosi epatica, cirrosi e altre malattie, che mettono seriamente in pericolo la vita e la salute 36,37,38. L'UDCA è riconosciuto come il farmaco più comunemente usato nel trattamento della CLI

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è supportato dalla Fondazione per le Scienze Naturali della Provincia del Sichuan (2024NSFSC0697), Progetto del Fondo Congiunto per l'Innovazione dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (LH202402015).

Contributo dell'autore:
Caitong Wu: Metodologia, analisi formale, cura dei dati, scrittura della bozza originale, scrittura e editing. Yang Xiao: Concettualizzazione, indagine, visualizzazione e convalida. Fuhan Fan: Convalida e editing. Zhangli Lei, Xianhua Zhou e Xianli Meng: Editing e traduzione. Yong Zeng, Hou Ya e Peng Shen: concettualizzazione, metodologia, convalida, indagine, revisione e correzione della bozza e supervisione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
ALPNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA059-2-2
ALTNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC009-2-1
ASTNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC010-2-1
BCABoster Biological Technology Co., LtdAR0146
CDCAChengdu Medesheng Technology Co., LtdKit per il conteggio delle cellule 474-25-9-8
Boster Biological Technology Co., LtdAR1160-500
Anticorpo citocromo P450 7A1Abmart Shanghai Co., Ltd.
DAPIBeyotime BiotechnologyC1005
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
IgG anti-coniglio di capra (H& Fornitore verificato -Chengdu Zen-Bioscience Co., Ltd.
capra anti-coniglio IgG AF488Abmart Shanghai Co., Ltd.
GPSChengdu Medesheng Technology Co., LtdRP210717
GSHNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA006-2-1
Celle HepG2Procell Life Science & Technology Co., LtdCL-0103
HRP Capra Anti-Coniglio IgGWuhan  ABclonale  Biotecnologia Co., Ltd.AS014
IL-1βElabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H0149c
IL-6Elabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H6156
MDANanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA003-1-2
MEM base mediumProcell Life Science & Technology Co., LtdPM150410
PBSBoster Biological Technology Co., LtdPYG0021
Buffer di trasferimento rapido (20 volte)NCM BiotechWB4600
RIPABoster Biological Technology Co., LtdBL651A
ROSBeyotime BiotechnologyS0033S
SHP2 Coniglio pAbWuhan  ABclonale  Biotecnologia Co., Ltd.A12486
SLC10A1 AnticorpoAbmart Shanghai Co., Ltd.
SODIstituto di bioingegneria Nanjing JianchengA001-3-1
TBAIstituto di bioingegneria Nanjing JianchengE003-2-1
T-CHOIstituto di bioingegneria Nanjing JianchengA111-1-1
TGIstituto di bioingegneria Nanjing JianchengA110-1-1
TGR5 Anticorpo policlonaleAzienda di biotecnologie ImmunoWayYT4636
TNF-&alfa;Elabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H0109c
Soluzione di tripsina (0,25%)Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd40126ES60
UDCAChengdu Lemetian Medical Technology Co., LtdDSTDX007601
β-Actina Coniglio mAbWuhan  ABclonale  Biotecnologia Co., Ltd.AC026
TD2612S511202M21012MPU276166S

Riferimenti

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