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Articolo metodologico

Una pipeline di intruglio per la generazione di unità tassonomiche operative molecolari (MOTU) tra coleotteri ripariali e acquatici

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DOI:

10.3791/68323

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11 luglio 2025

 ,  , 
1Ateneo Biodiversity Research Laboratory, Department of Biology, School of Science and Engineering, Higher Education Cluster, Ateneo de Manila University, 2Ateneo Institute of Sustainability, Ateneo de Manila University, 3Ateneo School of Medicine and Public Health, Higher Education Cluster, Ateneo de Manila University

In questo articolo

Sommario

Il protocollo qui presentato mira a guidare gli utenti nell'elaborazione computerizzata di sequenze geniche della subunità I della citocromo c ossidasi (COI) generate dai coleotteri, in modo tale che l'ipotesi di raggruppamento delle specie chiamata unità tassonomiche operative molecolari (MOTU) possa essere generata dal DNA.

Abstract

Il declino della biodiversità sta avvenendo a ritmi inimmaginabili, ma il monitoraggio della biodiversità è ostacolato da una pletora di fattori, tra cui l'inventario incompleto della diversità di base e la diminuzione della popolazione di tassonomisti qualificati. Colmare questo ostacolo nell'inventario delle specie di "taxa oscuri", o gruppi iperdiversi spesso poco studiati nella tassonomia, è particolarmente cruciale nei tropici che affrontano pressioni ambientali insormontabili. Mentre l'alfa-tassonomia basata sulla morfologia rimane il gold standard nell'identificazione delle specie, i metodi basati sul DNA hanno mostrato un enorme potenziale nell'accelerare la delineazione e la scoperta delle specie. Qui, descriviamo una pipeline di intruglio per la generazione di unità tassonomiche operative molecolari (MOTU) che coinvolge sei approcci di delimitazione delle specie molecolari implementati su due generi di coleotteri altamente poco appariscenti, vale a dire Byrrhinus Motschulsky, 1858 della famiglia Limnichidae e Anacaena Thomson, 1859 della famiglia Hydrophilidae, dalle Filippine. Poiché questo protocollo si concentra sull'elaborazione dei codici a barre del DNA e dato che questi dati genetici possono essere ottenuti sia mediante sequenziamento che scaricando da database online, il punto di partenza per il protocollo qui descritto sono le sequenze di DNA. Dati i codici a barre COI, la pipeline utilizza una combinazione di tre approcci di delimitazione delle specie molecolari basati su soglie, vale a dire TaxonDNA, K2P e ASAP, che utilizzano l'allineamento delle sequenze come dati di input. Inoltre, la pipeline procede con tre approcci basati sulla coalescenza, ovvero PTP-ML, PTP-BI e mPTP, che richiedono un file ad albero come dati di input. Alcuni approcci prevedono l'uso di server web, mentre altri utilizzano software locale. Con la selezione dei metodi algoritmici presentati, i MOTU possono essere identificati, sia per consenso che a maggioranza. Sorprendentemente, questa conduttura ha delineato specie di coleotteri quasi cospicui provenienti dalle Filippine, anche quelle documentate dalla stessa località o da località adiacenti.

Introduzione

Con i tassi senza precedenti di declino delle specie globali in vari taxa 1,2,3,4, l'impulso a creare un inventario completo della biodiversità, che includa specie precedentemente non scoperte e non descritte, diventa una corsa contro il tempo 2,5. Per prima cosa, la conservazione della biodiversità ha senso solo alla luce di un'adeguata conoscenza tassonomica 6,7. Pertanto, l'identificazione della biodiversità a livello di specie è necessaria, dato che specie strettamente correlate ma diverse possono avere nicchie fondamentali uniche8.

Nella sistematica dei coleotteri, l'alfa-tassonomia o tassonomia tradizionale è il gold standard nell'identificazione delle specie simile alla maggior parte, se non a tutti, i gruppi di animali9. Questo approccio si basa sui caratteri morfologici per classificare gli organismi a una tassonomia più alta e per fornire l'identificazione a livello di specie10,11. In molti casi, l'identificazione della famiglia12 o anche a livello di genere13 può essere effettuata utilizzando solo caratteristiche morfologiche esterne, come la forma del corpo e adattamenti specializzati. Nel frattempo, l'identificazione a livello di specie nei coleotteri viene solitamente effettuata attraverso il confronto dei dettagli strutturali dell'aedeagus o dei genitali maschili 14,15,16.

Nonostante l'ampia accettazione di questa alfa-tassonomia basata sulla morfologia, questo approccio alla scoperta delle specie è ostacolato da numerosi "impedimenti tassonomici"6,17,18, specialmente tra gli invertebrati19. Nella sistematica dei coleotteri, l'identificazione e/o la scoperta delle specie utilizzando l'alfa-tassonomia affronta le sfide di avere un numero limitato di tassonomisti qualificati20,21, di descrizioni precedenti brevi e scarsamente informative22 e di problemi logistici legati all'accesso alla letteratura e agli esemplari tipo23.

Questo è anche esacerbato quando il taxon in questione è criptico o altamente poco appariscente. La specie criptica si riferisce all'insieme di specie dello stesso genere, o anche di generi diversi, che non possono essere facilmente delineate dalla morfologia comparativa, date le sottili differenze fenetiche interspecifiche24. Alcuni taxa criptici, considerati come "taxa oscuri"25,26,27, soffrono inoltre di essere iperdiversi ma fortemente poco studiati. Sfortunatamente, questo non è raro nei coleotteri ripariali e acquatici 8,28. L'incapacità di affrontare la delineazione delle specie tra criptici taxa oscuri minaccia la biodiversità poiché viene data una misura di conservazione unica per tutti a organismi di nicchie e requisiti ecologici potenzialmente diversi 8,29.

Alla luce di queste sfide, la "tassonomia integrativa"23, o l'approccio di accoppiare l'alfa-tassonomia con un'altra linea di evidenza, ha guadagnato terreno come mezzo per erigere nuove specie negli ultimi due decenni 30,31,32. Una di queste linee di evidenza utilizzate negli studi tassonomici integrativi sui coleotteri 33,34,35,36,37,38,39 e altri ordini di insetti 40,41,42,43,44,45 è la sequenza del DNA. In particolare, il gene della subunità I (COI) della citocromo c ossidasi mitocondriale viene utilizzato per codificare a barre un insieme diversificato di animali a causa della sua natura moderatamente conservativa 46,47,48. Mentre la sua estremità 5' lunga 658 bp (COI-5'), nota anche come 'frammento di codifica a barre' o 'frammento di Folmer', è stata proposta come sequenza 'diagnostica'49, la COI-3' lunga 723 bp viene utilizzata anche grazie a un robusto set di primer per l'estremità 3' 50,51,52.

Mentre il DNA barcoding che utilizza COI è stato concepito per l'identificazione a livello di specie, è limitato da un repository di sequenze a priori 53, come GenBank54 e BOLD55, gli approcci molecolari di delimitazione delle specie stabiliscono i limiti delle specie utilizzando solo le sequenze di DNA fornite senza alcun repository di prerequisiti56. Esistono due classi di approcci di delimitazione delle specie molecolari basati sul file di input. In primo luogo, utilizzando l'allineamento della sequenza come input, gli approcci basati sulla soglia utilizzano valori di cut-off per determinare la divergenza tra e all'interno delle specie 48,57,58. Come metodi basati sulla distanza, questi approcci si basano su una distanza intraspecifica massima osservata del 3% per gli insetti, che viene definita "barcoding gap"51,59. Alcuni degli approcci basati su soglie sono SpeciesIdentifier implementato in TaxonDNA60, la distanza genetica tramite Kimura 2-parameter (K2P)61 e Assemble Species by Automatic Partitioning (ASAP)62.

In secondo luogo, utilizzando l'albero come file di input, gli approcci basati sulla coalescenza identificano i confini delle specie e ordinano i lignaggi indipendenti determinando il cambiamento nel tasso di ramificazione del lignaggio 63,64,66. Spesso basati sul concetto filogenetico delle specie67, gli approcci basati sulla coalescenza includono i processi dell'albero di Poisson (PTP)68 e la loro variazione, PTP69 multi-rate. In ogni caso, i cluster formati dagli approcci di delimitazione delle specie molecolari sono collettivamente indicati come unità tassonomiche operative molecolari (MOTU).

Qui, presentiamo i metodi per una pipeline di intruglio per la generazione di MOTU che coinvolge tre approcci basati su soglie e tre approcci basati sulla coalescenza (Figura 1). La pipeline è testata su due set di dati, vale a dire (1) sequenze COI-3' del ripariale Byrrhinus Motschulsky, 1858 beetles, che è composto da due specie pubblicate35 precedentemente erette utilizzando la tassonomia integrativa e sequenze aggiuntive da specie non descritte, e (2) sequenze COI-5' di Anacaena Thomson, 1859 beetles, che è composto da sequenze di due specie pubblicate70 precedentemente eretto utilizzando l'alfa-tassonomia e sequenze aggiuntive di specie non descritte.

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Figura 1: Diagramma di flusso della pipeline di intruglio per la generazione di MOTU. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

I materiali di partenza per questa pipeline di intruglio sono sequenze di DNA, che possono essere scaricate da repository online (ad esempio, BOLD, GenBank) o generate dal sequenziamento Sanger71. La Tabella 1 e la Tabella 2 elencano i numeri di accesso per i set di dati i cui risultati rappresentativi sono presentati in questo articolo.

1. Fase preparatoria per gli approcci basati su soglie: allineamento delle sequenze

  1. Sequenze di carico in MEGA X72.
    NOTA: MEGA X può essere scaricato da https://www.megasoftware.net/
    1. Fare clic su Allinea per aprire un menu a discesa. Fare clic su Modifica/Crea allineamento e selezionare Crea un nuovo allineamento. Fare clic su OK per confermare la selezione. Selezionare DNA come tipo di dati per l'allineamento.
    2. Passate il mouse sulla scheda Modifica e selezionate Inserisci sequenza da file. Naviga nella directory con le sequenze e selezionale per essere caricate in MEGA.
  2. Allinea le sequenze facendo clic su Allineamento, quindi su Allinea con ClustalW73. Continua con le impostazioni predefinite e fai clic su OK.
  3. Modifica manualmente le sequenze tagliando entrambe le estremità e pulendo eventuali inserimenti o eliminazioni.
    1. Per eliminare gli inserimenti, fare clic sulle basi e/o sulle posizioni inserite e premere Elimina sulla tastiera.
    2. Per correggere le cancellazioni, fare clic sulla posizione che si suppone sia stata eliminata come indicato da "-". Elimina il "-" e digita la base desiderata.
    3. Trova la prima posizione in cui tutte le sequenze hanno un carattere. Fare clic sulla casella vuota nell'intestazione della riga della posizione a sinistra della posizione determinata e trascinare fino a selezionare le posizioni in eccesso per tutte le sequenze fino alla fine iniziale. Premere Elimina per tagliare.
    4. Ripetere il passaggio 1.3.3 cercando l'ultima posizione in cui tutte le sequenze hanno un carattere. Fare clic sulla casella vuota sulla riga di intestazione della posizione a destra della posizione determinata, trascinare fino a selezionare le posizioni in eccesso per tutte le sequenze fino alla fine del terminale. Premere Elimina.
      NOTA: La Figura 2A mostra un buon allineamento delle sequenze di DNA. Il set di dati finale è una matrice di sequenze di uguale lunghezza; In tal modo, la lunghezza della sequenza non è un fattore che influenza i risultati dello studio. Le sequenze di riferimento servono come base per la lunghezza finale della matrice di allineamento.
  4. Tradurre la sequenza per verificare la presenza di codoni di stop, dato che il COI è una sequenza codificante proteine.
    1. Seleziona tutte le sequenze, quindi fai clic sulla scheda Sequenze proteiche tradotte .
    2. Quando richiesto, verificare il codice genetico come Mitocondriale invertebrato. Se il codice genetico è diverso, fare clic su No e apparirà un menu che consente di spuntare la casella per il codice genetico mitocondriale degli invertebrati .
    3. Se i codoni di stop, come indicato da asterischi nel corpo di allineamento, sono presenti per un'intera colonna, fare clic su Sequenze DNA ed eliminare la prima posizione per tutte le sequenze.
    4. Ripetere il passaggio precedente se i codoni di stop sono ancora presenti in qualsiasi sequenza.
    5. Se i codoni di stop sono ancora presenti, ripristinare le posizioni precedentemente eliminate. Seleziona tutte le sequenze, quindi passa il mouse sulla scheda Dati e fai clic su Inverti.
    6. Ripetere il passaggio 1.4.1. Se i codoni di stop sono ancora presenti, ripetere i passaggi 1.4.3 e 1.4.4.
      NOTA: La Figura 2B mostra un buon allineamento dei codoni.
  5. Fare clic su Sequenze DNA e salvare l'allineamento della sequenza in .mas/x. Esporta la sequenza in altri tipi di file pertinenti, come il file .meg e il file .fasta.
    NOTA: Alcuni approcci di delimitazione delle specie molecolari funzionano meglio senza l'outgroup. Pertanto, una possibile considerazione consiste nel generare una copia del file di allineamento senza l'outgroup.

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Figura 2: Allineamento della sequenza in MEGA X. (A) Allineamento finale della sequenza di DNA pulito manualmente e (B) allineamento della sequenza proteica tradotta del set di dati di Byrrhinus che non mostra inserzioni, delezioni e lacune. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Delimitazione per modulo DNA taxon nell'identificatore di specie 1.8

NOTA: L'identificatore di specie può essere scaricato da https://taxondna.sourceforge.net/

  1. Apri TaxonDNA. Fare clic su Importa, quindi fare clic su FASTA. Carica l'allineamento in formato .fasta.
  2. Fare clic su Moduli e fare clic su Cluster. Imposta la soglia al 3%. Quindi, selezionare Genera informazioni sul singolo cluster (Figura 3).
  3. Clicca su Crea cluster ora!. Salva i risultati facendo uno screenshot.

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Figura 3: TaxonDNA nella finestra dell'identificatore di specie 1.8 che mostra la soglia del 3% identificata dall'utente per la delimitazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Delimitazione con Kimura a 2 parametri (K2P) in MEGA X

  1. In MEGA, apri il file .meg facendo clic su File, quindi Apri un file/sessione. Fare clic su Distanza, quindi fare clic su Calcola distanze a coppie. Confermare il file .meg per la delimitazione.
  2. Passa il mouse sopra la casella gialla accanto a Modello/Metodo, quindi fai clic sulla freccia che appare a destra della casella.
  3. Seleziona il modello Kimura a 2 parametri dal menu a discesa. Fare clic su Ok per eseguire il programma. Aprire la finestra di output dei dati (Figura 4).
  4. Fare clic su File, quindi su Esporta/Stampa distanze.
  5. Apri il menu a discesa accanto a Formato di output e seleziona XL: cartella di lavoro di Microsoft Excel. Per Cifre decimali, scegli 4.
  6. Salva il foglio di calcolo risultante in Microsoft Excel. Usa la formattazione condizionale per evidenziare quelli con una distanza inferiore a 0,03 (o 3%).
    NOTA: A differenza degli altri approcci illustrati in questo articolo, K2P non fornisce immediatamente il clustering perché dipende dalla soglia identificata dall'utente. Questa pipeline sta lavorando sull'ipotesi che la soglia sia del 3%, il che significa che qualsiasi coppia di sequenze la cui distanza genetica è inferiore al 3% appartiene allo stesso cluster molecolare.

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Figura 4: Finestra risultante in MEGA X che mostra i risultati del parametro Kimura-2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Delimitazione per specie assemblate mediante partizionamento automatico (ASAP)

  1. Accedere al server Web ASAP: https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap/asapweb.html
  2. Carica l'allineamento facendo clic sulla casella arancione con l'etichetta Scegli un file... e selezionando il file .fasta. In alternativa, trascina il file .fasta nella casella arancione. Scorri verso il basso e fai clic su Vai.
  3. Per scaricare il clustering, fare clic sull'elenco per la riga con il punteggio ASAP più basso e il rango p-val più alto (Figura 5).
    NOTA: L'output del risultato è un file .txt, che presenta sottoinsiemi dei cluster molecolari.

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Figura 5: Finestra risultante in ASAP che mostra le possibili delimitazioni. Il primo risultato (casella blu) è accettato a causa del punteggio ASAP più basso (casella rossa) e del grado P-val più alto (casella gialla). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Fase preparatoria per approcci basati sulla coalescenza: stima dell'albero

  1. Apri il file .meg facendo clic su Dati, quindi Apri un file/sessione. Testare il modello di sostituzione più adatto.
    1. Fai clic su Modelli, quindi trova i migliori modelli di DNA/proteine (ML). Confermare il file .meg per l'analisi.
    2. Fare clic su Ok nel menu Preferenze di analisi (Figura 6A). Prendere nota del modello migliore che utilizza il valore BIC e AICc più basso (Figura 6B).
      NOTA: Di solito è il primo nell'elenco dei modelli nella finestra risultante. Fare riferimento ai nomi completi dei nomi dei modelli abbreviati nella parte inferiore della finestra risultante.
  2. Generare l'albero.
    1. Fare clic su Filogenesi e quindi su Costruisci/Testa l'albero della massima verosimiglianza.
    2. Utilizzare il modello di sostituzione nucleotidica più adatto. Fallo cliccando sulla casella gialla accanto a Modello/Metodo. Seleziona il modello dal menu a discesa.
    3. Se il modello di sostituzione nucleotidica più adatto ha '+G' o '+I' o entrambi, fare clic sulla casella accanto a Tassi tra siti e selezionare i parametri (G, I, G + I) dal menu a discesa (Figura 6C).
    4. In Test filogenesi, fai clic sulla casella accanto a Test di filogenesi e seleziona Metodo Bootstrap dal menu a discesa. Fare clic sulla casella accanto a "No. di repliche Bootstrap" e digitare 1000 (Figura 6C). Fare clic su Ok per eseguire l'analisi.
  3. Una volta aperta una finestra contenente l'albero risultante (Figura 6D), salvare la sessione dell'albero come .mts/x. Salvare l'output come file con estensione nwk. Salva anche l'albero come file .png immagine.

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Figura 6: Stima dell'albero in MEGA X come fase preparatoria per approcci basati sulla coalescenza. (A) Impostazione per determinare il modello di sostituzione nucleotidica più adatto. (B) Per il set di dati di Byrrhinus , il modello più adatto è GTR + I a causa dei valori BIC e AICc più bassi (riquadro rosso). (C) Nell'esecuzione dell'albero della massima verosimiglianza, GTR (casella gialla) + I (casella blu) sono stati impostati come parametri. (D) L'albero di ML grezzo risultante da utilizzare nelle analisi successive. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Delimitazione mediante processi ad albero di Poisson (PTP)

NOTA: I passaggi seguenti produrranno i risultati di PTP-ML e PTP-BI.

  1. Vai al server web PTP: https://species.h-its.org/ptp/
  2. Carica un file newick facendo clic su Scegli file. In Il mio albero è, selezionare Radicato (Figura 7A).
  3. Inserire i parametri per l'analisi. Sotto il n. Generazioni MCMC, inserire 100000. In Diluizione (Thinning), inserite 100. In Burn-in, immettere 0.1. In Seme, inserisci 123.
  4. Inserire l'outgroup digitando il nome delle punte nella casella sotto Nomi taxa outgroup (se presenti). Le istruzioni per la formattazione dell'input si trovano a destra della casella di input.
  5. Inserisci l'indirizzo e-mail nel campo corrispondente e fai clic su Invia. Nella finestra dei risultati della delimitazione delle specie PTP, fare clic qui per aprire la finestra dei risultati.
  6. Nella soluzione di massima verosimiglianza, scaricare i risultati di PTP-ML facendo clic su Scarica risultati di delimitazione (Figura 7B).
  7. Nella soluzione supportata da Bayesian, scaricare i risultati di PTP-BI facendo clic su Scarica risultati della delimitazione.
    NOTA: i risultati indicherebbero gruppi di sequenze nelle partizioni. Questi saranno etichettati come specie numerate seguite da un valore di supporto, in cui 1.000 è l'ideale.

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Figura 7: Delimitazione delle specie molecolari mediante processi ad albero di Poisson. (A) Finestre che mostrano i parametri di input. (B) Finestra risultante nel server web PTP, con collegamento contenente i risultati della delimitazione (riquadro rosso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Delimitazione mediante processi ad albero di Poisson multi-rate (mPTP)

  1. Vai al server web mPTP: https://mptp.h-its.org/#/tree
  2. Carica il file newick trascinandolo sul rettangolo grigio o facendo clic sul rettangolo. Una volta caricati i dati sulla stessa pagina, fare clic su Procedi alla selezione dell'outgroup (Figura 8A).
  3. Nella pagina delle specifiche dell'outgroup , selezionare l'outgroup facendo clic sulla casella accanto alle etichette dei taxa degli esemplari dell'outgroup. Fare clic sull'opzione Ritaglia outgroup nella parte inferiore della sequenza. Fare clic su Selezione modello.
  4. Fare clic su MPTP, quindi fare clic su Opzioni di visualizzazione. Nella pagina Opzioni di visualizzazione , accettare le impostazioni predefinite.
    NOTA: In alternativa, la dimensione totale dell'immagine può essere regolata inserendo un valore (in px) sotto la larghezza SVG. Il carattere e la spaziatura del testo possono essere regolati inserendo le dimensioni desiderate (in px) in Dimensione carattere SVG, Spazio tra le punte, Margine sinistro, Margine destro, Margine superiore e Margine inferiore.
  5. Fare clic su Dettagli di contatto. Inserisci l'indirizzo e-mail per il riferimento futuro dei risultati (facoltativo).
  6. Fare clic su Panoramica. Assicurati di rivedere il numero di taxa in input e gli outgroup selezionati.
  7. Fare clic su Invia. Fare clic con il pulsante destro del mouse sui file in File scaricabili (Figura 8B) e selezionare Salva con nome... per salvare i risultati.
    NOTA: Il file di testo di output indicherà il numero totale di specie delimitate all'inizio dei risultati. Presenterà quindi quali sequenze rientrano in ciascuno dei cluster. Questi cluster e le sequenze corrispondenti sono disposti in modo simile all'albero generato nel file .svg. Il file SVG mPTP visualizzerà il clustering delle sequenze. I cluster sono presentati da gruppi di sequenze collegate da rami rossi lungo l'albero. Ogni serie isolata di rami rossi indica un MOTU singolare.

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Figura 8: Delimitazione delle specie molecolari mediante processi multi-rate dell'albero di Poisson. (A) Finestre che mostrano le informazioni di lettura mPTP relative all'albero caricato. (B) Finestra risultante nel server web mPTP, con collegamento contenente i risultati della delimitazione (riquadro rosso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

8. Generazione MOTU

  1. Apri l'albero utilizzando un programma di editor di foto o utilizzando PowerPoint.
  2. Creare una barra per rappresentare i risultati di ciascun approccio di delimitazione delle specie molecolari (vedere la Figura 9 e la Figura 10 per i campioni). Assicurati che ogni singola barra sia allineata con le sequenze che include nel suo cluster molecolare.
  3. Determinare il MOTU con uno di questi due approcci74
    1. Se tutti gli approcci generano risultati identici per un dato cluster molecolare, erigere il cluster molecolare come MOTU per consenso.
    2. Se la maggior parte degli approcci genera risultati identici per un dato cluster molecolare, erigere il cluster molecolare come MOTU a maggioranza.

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Risultati

Questo articolo ha implementato una pipeline di intruglio per la delimitazione delle specie molecolari, che include TaxonDNA, K2P, ASAP, due varianti di PTP e mPTP, per coleotteri acquatici e ripariali. Il risultato di ciascuno dei sei approcci è indicato come "cluster molecolari", mentre il riassunto è indicato come "unità tassonomiche operative molecolari" o MOTU75.

La pipeline di intruglio è stata testata su due set di dati. Il primo dataset (Tabella 1,

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Discussione

Mentre le sequenze di DNA, in particolare il COI49, possono essere confrontate con le sequenze di riferimento 22,53,78 negli archivi pubblici online 54,55,79,80 per un sistema di bioidentificazione46, tale approccio è limitato dalle sequenze depositate disponibili.

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Dichiarazioni

Non abbiamo nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Bureau of Fisheries and Aquatic Resources (BFAR) e le unità governative locali interessate per averci concesso il consenso informato preventivo per eseguire il campionamento della biodiversità. Ringraziamo il dottor Hendrik Freitag per la guida sul lavoro tassonomico. Ringraziamo anche i revisori e gli editori per i loro commenti utili e costruttivi. Infine, esprimiamo la nostra massima gratitudine all'University Research Council Big Project Grant (URC 2022-09) e all'Open Access Publication Grant dell'Ateneo de Manila University, al SC Johnson Student Research and Development Fund for Environmental Leadership dell'Ateneo Research Institute of Science and Engineering, al LinnéSys: Systematics Research Fund della Linnean Society di Londra e alla Systematics Association per aver finanziato questo studio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AL PIÙ PRESTO Esploratore di partihttps://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap/asapweb.html
ComputerQualsiasi unità di elaborazione
MEGA XMEGA Softwarehttps://www.megasoftware.net/
Server web mPTPhttps://mptp.h-its.org/#/tree
Server web PTPIstituto di studi teorici di Heidelberg (HITS)https://species.h-its.org/ptp/
Identificatore di specie   https://taxondna.sourceforge.net/

Riferimenti

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