Analisi dell'espressione e dell'assemblaggio dei complessi delle proteine della catena respiratoria mitocondriale nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

I mitocondri svolgono un ruolo importante in diversi processi biologici, come la respirazione cellulare per l'energia, il metabolismo nutrizionale e la morte cellulare¹. Il malfunzionamento dei mitocondri è correlato a malattie cerebrali, muscolari e dello sviluppo ^2,3. Pertanto, gli studi sui mitocondri sono vitali per migliorare l'invecchiamento e la salute umana.

Il lievito Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) è stato a lungo utilizzato per studiare le funzioni dei geni nei mitocondri⁴ perché i mutanti del lievito difettosi nella respirazione possono ancora produrre energia per la sopravvivenza attraverso la fermentazione. Tuttavia, è piccolo-positivo e può proliferare senza DNA mitocondriale (mtDNA). Di conseguenza, i mutanti genici difettosi nell'espressione genica mitocondriale spesso perdono il loro mtDNA, il che complica ulteriori studi. Al contrario, il lievito di fissione Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), che è evolutivamente distante da S. cerevisiae, è un lievito piccolo-negativo che richiede mtDNA per la sopravvivenza. Inoltre, l'organizzazione del mtDNA e dell'mRNA mitocondriale di S. pombe è simile a quella degli eucarioti superiori⁵. Molti (96) geni essenziali in S. pombe, rispetto ai soli sei geni essenziali in S. cerevisiae, sono necessari per l'espressione genica mitocondriale⁶. Pertanto, S. pombe sta emergendo come un modello interessante per studiare nuove funzioni dei geni nei mitocondri. Tuttavia, il numero di pubblicazioni che studiano i mitocondri in S. cerevisiae è circa 100 volte superiore a quello di S. pombe, e anche i metodi e i protocolli riportati che studiano i mitocondri in S. pombe sono scarsi,⁷.

La catena respiratoria mitocondriale è fondamentale per la produzione di energia cellulare e funge da nucleo dei mitocondri⁸. Comprende i complessi della catena respiratoria I-V, come la NADH-ubichinone ossidoreduttasi (Complesso I), la succinato deidrogenasi (Complesso II), l'ubichinone-citocromo c ossidoreduttasi o il complesso del citocromo bc1 (Complesso III), la citocromo c ossidasi (Complesso IV) e l'ATP sintasi (Complesso V), insieme a due substrati intermedi che trasportano elettroni, ubichinone (CoQ) e citocromo c (Cyt c)⁹. Interagiscono anche e formano supercomplessi di ordine superiore, i cui meccanismi di assemblaggio rimangono in gran parte poco chiari^10,11. Tuttavia, S. pombe manca del complesso I, che può essere sostituito dalle NADH deidrogenasi esterne Nde1 e da Ndi1 12,13,14 interne. Il genoma mitocondriale di S. pombe codifica per una subunità del complesso III (Cob1), tre subunità del complesso IV (Cox1, Cox2, Cox3) e tre subunità del complesso V (Atp6, Atp8, Atp9)^15,16. Abbiamo recentemente riportato che l'espressione e l'assemblaggio dei complessi di queste proteine sono influenzati dalla delezione dell'RNA elicasi Mss116 (Δmss116)¹⁶ e del fattore di assemblaggio Shy1 (Δshy1)¹⁵ in S. pombe, rispettivamente. Per facilitare la scoperta di nuove funzioni di più geni nella catena respiratoria mitocondriale utilizzando questi metodi, qui forniamo un protocollo dettagliato per l'analisi dell'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE) dei livelli di espressione e l'analisi del blue native-PAGE (BN-PAGE) dell'assemblaggio dei complessi delle proteine della catena respiratoria mitocondriale in S. pombe.

Il razionale alla base dell'isolamento dei mitocondri da S. pombe si basa sui metodi stabiliti in S. cerevisiae¹⁷. Gli sferoplasti vengono prima preparati digerendo le pareti cellulari del lievito. Sono omogeneizzati meccanicamente e i mitocondri sono frazionati mediante centrifugazione differenziale¹⁸. Successivamente, le proteine della catena respiratoria mitocondriale vengono solubilizzate e immunoblotte seguendo SDS-PAGE e BN-PAGE. La tecnica BN-PAGE è stata originariamente sviluppata per la separazione delle proteine della membrana mitocondriale come i complessi della catena respiratoria 19,20,21. Le proteine di membrana con complessi intatti conservati sono solubilizzate da detergenti non ionici delicati e caricate dal colorante anionico Coomassie G-250. Pertanto, i complessi proteici vengono separati in base alla loro massa in un gradiente nativo PAGE^{gel 22}. Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per lo studio dei complessi della catena respiratoria mitocondriale in S. cerevisiae²³ e nelle cellule di mammifero^24,25; tuttavia, non è stato ampiamente applicato ai mitocondri di S. pombe.

Collettivamente, qui presentiamo un metodo in cui i mitocondri sono isolati dalle cellule di S. pombe e le proteine della catena respiratoria mitocondriale sono sottoposte a SDS-PAGE e BN-PAGE seguite da immunoblotting. Il diagramma di flusso sperimentale è illustrato nella Figura 1. Con mitocondri e anticorpi di alta qualità, questo metodo descritto in S. pombe può essere applicato anche ad altri organismi per identificare più geni con funzioni nell'espressione e/o nell'assemblaggio di complessi di proteine della catena respiratoria mitocondriale.

1. Preparazione degli sferoplasti di S. pombe

1. Coltivare 1 litro di cellule di S. pombe nel terreno di coltura Estratto di lievito con integratori (YES) (Tabella 1) per un particolare ceppo (WT o Δshy1) da OD₆₀₀ = 0,05 a OD₆₀₀ = 1,0.
   NOTA: Non far crescere le cellule di S. pombe con OD₆₀₀ più di 2,0, poiché sono difficili da digerire dagli enzimi litici per formare sferoplasti. Sia i ceppi wild-type (WT) che quelli mutanti genici possono essere coltivati in parallelo per ottenere risultati comparabili.
2. Raccogliere le celle mediante centrifugazione per 5 minuti a 3.000 x g a 4 °C. Risospendere le cellule pellettate in 500 mL di ddH₂O e le celle pellet mediante centrifugazione per 5 minuti a 3.000 x g a 4 °C. Celle di lavaggio 1x.
3. Misurare il peso umido del pellet della cella (circa 2 g per 1.000 celle OD₆₀₀ ). Risospendere le cellule in 8 mL di tampone 1x S (Tabella 2; 4 mL di tampone S/g cellule). Aggiungere il ditiotreitolo (DTT) a 10 mM e il fluoruro di fenilmetilsulfonile (PMSF) a 1 mM fresco.
4. Aggiungere enzimi litici alla sospensione cellulare per digerire la parete cellulare di S. pombe. Ruotare in agitatore a 30 °C per il tempo che dipende dall'enzima litico utilizzato.
   NOTA: La corretta digestione della parete cellulare è un passaggio cruciale per isolare mitocondri di alta qualità.
   1. Per l'enzima lisingante, aggiungere 100 mg di polvere per g di peso umido di cellule e incubare per circa 2 ore. Per il Lyticase, aggiungere 10 mg di polvere per g di peso umido e incubare per circa 1 ora. Per la Zimoliasi-20T/100T, aggiungere 5 mg/1 mg di polvere per g di peso umido e incubare per circa 1 ora. Per il Lallzyme MMX, aggiungere 1 g di polvere per g di peso umido e incubare per circa 0,5 ore. Per l'enzima Vinotaste, aggiungere 1 g di polvere per g di peso umido e incubare per circa 2 ore.
5. Osservare la formazione degli sferoplasti al microscopio (obiettivo 40x). Prelevare 20 μL di sospensione cellulare nel tampone S e aggiungerli a 1 mL di ddH₂O, vedere che la maggior parte delle cellule è rotta (Figura 2C).
   NOTA: Le normali celle di S. pombe hanno forme a bastoncino (Figura 2A). Più dell'80% degli sferoplasti nel tampone S, dopo una digestione efficiente, dovrebbe diventare rotondo (Figura 2B).
6. Sferoplasti in pellet per centrifugazione per 10 minuti a 1.000 x g a 4 °C. Risospendere gli sferoplasti in 8 mL di tampone ghiacciato 1x S e lavare 2x. Risospendere delicatamente gli sferoplasti utilizzando pipette con punte tagliate.

2. Omogeneizzazione meccanica di sferoplasti di S. pombe

1. Risospendere gli sferoplasti in 8 mL di tampone di omogeneizzazione ghiacciato 1x (Tabella 3; 4 mL di tampone di omogeneizzazione/cellule g) con 1x inibitori della proteasi. Trasferire le cellule in un omogeneizzatore di vetro pre-raffreddato (macina tessuti Dounce con un pestello e una provetta).
2. Omogeneizzare meccanicamente le cellule facendo circa 15 colpi su e giù con il pestello ben aderente. Per prevenire la degradazione delle proteine mitocondriali, evitare la formazione di bolle durante gli ictus e incubare sempre il tampone di omogeneizzazione e l'omogeneizzatore su ghiaccio.
   NOTA: Esistono due tipi di pestelli con un raccordo stretto e largo nella provetta. Se si utilizza un pestello sciolto, potrebbero essere necessari fino a 25 colpi. Il numero di corse dovrebbe essere ottimizzato perché troppi colpi potrebbero danneggiare le membrane mitocondriali e troppo pochi colpi riducono la resa mitocondriale.
3. Controllare la membrana cellulare rotta negli sferoplasti con un microscopio (obiettivo 40x).
   NOTA: La maggior parte degli sferoplasti perde la forma refrattiva e diventa cellule fantasma in un tampone di omogeneizzazione. I mitocondri sono ancora intatti.

3. Isolamento dei mitocondri di S. pombe mediante centrifugazione

1. Trasferire la sospensione omogeneizzata nelle provette da centrifuga e nelle celle intatte e nei detriti del pellet mediante centrifugazione per 5 minuti a 1.000 x g a 4 °C.
2. Centrifugare il surnatante risultante per 5 minuti a 3.000 x g a 4 °C e pellettare i nuclei. Ripetere questo passaggio 1 volta fino a quando non si formano più pellet.
3. Trasferire il surnatante in nuove provette da centrifuga e mitocondri in pellet e altri organelli contaminati mediante centrifugazione per 15 minuti a 12.000 x g a 4 °C.
4. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di tampone ghiacciato 1x Sorbitolo-EDTA-MOPS (SEM) (Tabella 4). Centrifugare per 15 minuti a 12.000 x g a 4 °C per lavare i mitocondri.
5. Risospendere il pellet in 1 mL di tampone SEM ghiacciato 1x e aliquotare i mitocondri per esperimenti futuri.
   NOTA: Questo pellet contiene mitocondri grezzi. Può essere conservato a -80 °C per esperimenti SDS-PAGE e BN-PAGE in un secondo momento. I mitocondri grezzi possono anche essere purificati mediante ultracentrifugazione a gradiente di densità di saccarosio per altri scopi sperimentali.

4. SDS-PAGE e immunoblotting delle proteine della catena respiratoria mitocondriale

1. Misurare la concentrazione proteica totale di un'aliquota mitocondriale utilizzando un kit di quantificazione proteica BCA diluendo la sospensione mitocondriale di circa 25 volte.
2. Aggiungere il tampone di caricamento SDS-PAGE in 40 μL di proteine totali mitocondriali. Denaturare le proteine incubandole per il tempo indicato alla temperatura corretta.
   1. Per rilevare S. pombe Cox1, Cox3, Cob1 e Atp6, denaturare le proteine mitocondriali a 45 °C per 3 minuti. Per rilevare S. pombe Cox2 e Hsp60, denaturare le proteine mitocondriali a 90 °C per 5 minuti.
3. Caricare circa 20 μg (circa 4 μL) di proteine mitocondriali nel gel SDS-PAGE al 12%. Eseguire l'immunoblotting delle proteine della catena respiratoria mitocondriale con anticorpi appropriati come descritto nei passaggi 6,¹⁵.
   NOTA: Le proteine Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 e Atp6 di S. pombe sono codificate dal mtDNA, che è difficile da modificare come l'etichettatura con un epitopo comune anche in S. pombe. Pertanto, sono necessari anticorpi specifici per rilevare queste proteine. Per verificare la purezza e l'integrità dei mitocondri isolati, queste proteine della catena respiratoria possono essere testate contemporaneamente nel surnatante, che dovrebbe contenere proteine citoplasmatiche e nucleari. Al contrario, le proteine citoplasmatiche e nucleari rappresentative come l'actina e l'istone H3 possono essere testate nel campione di mitocondri.

5. Preparazione del campione mitocondriale per BN-PAGE

1. Mitocondri in pellet da aliquote precedenti nella fase 3.5 mediante centrifugazione per 15 minuti a 12.000 x g a 4 °C. Utilizzare 2 mg di proteine mitocondriali (circa 400 μL di aliquote mitocondriali) per l'analisi BN-PAGE.
2. Risospendere i mitocondri in 200 μL di 3 tamponi gel BN-PAGE (1,5 M di acido 6-Aminocaproice; 150 mM di Bis-Tris, pH 7,0, aggiustato con HCl). Aggiungere 2 μl di PMSF 100x e 1 μl di MgCl₂ 1 M. Centrifugare la sospensione per 15 minuti a 12.000 x g a 4 °C.
3. Risospendere il pellet dei mitocondri in 160 μL di digitonina (DG) al 5% (p/v) o 64 μL di n-Dodecil-β-D-maltopiranoside (DDM) al 5% (p/v). Incubare con ghiaccio per 30 minuti mescolando delicatamente ogni 10 minuti.
   1. Per le prime prove su S. pombe, aggiungere 4 mg di detergente DG per mg di proteine mitocondriali per solubilizzare le membrane mitocondriali e mantenere i supercomplessi della catena respiratoria. Aggiungere 1,6 mg di detergente DDM per mg di proteine mitocondriali per separare i singoli complessi della catena respiratoria mitocondriale. Regolare la concentrazione del trattamento DG e DDM aumentando o diminuendo di 2 volte in base ai risultati iniziali di diversi complessi proteici in BN-PAGE.
4. Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 20.000 x g a 4 °C. Trasferire il surnatante e misurare la concentrazione di proteine solubilizzate con il kit di quantificazione BCA.
5. Aggiungere 80 μL (1/2 volume di detergente) di 3 tampone campione BN-PAGE (Tabella 5) a circa 160 μL di surnatante trattato DG o aggiungere 32 μL (1/2 volume di detergente) di 3 tampone campione BN-PAGE a circa 64 μL di surnatante trattato con DDM.
   NOTA: A differenza di SDS-PAGE, i campioni di proteine per BN-PAGE non possono essere denaturati mediante bollitura.

6. BN-PAGE e immunoblotting dei complessi della catena respiratoria mitocondriale

1. Assemblare il gel nativo Bis-Tris prefabbricato (gradiente 3%-12%). In alternativa, preparare il gel nativo Bis-Tris fatto a mano (gradiente 3%-12%) mescolando il gel BN-PAGE 3% e 12% (Tabella 6) in un miscelatore a gradiente.
2. Caricare campioni proteici trattati con DG o DDM e il marcatore proteico ad alto peso molecolare per PAGE nativo.
   1. Per l'analisi BN-PAGE dei complessi della catena respiratoria mitocondriale mitocondriale sono necessari un totale di 100 μg di proteine mitocondriali solubilizzate. Caricare circa 12 μL di campione proteico trattato con DG o 5 μL di campione proteico trattato con DDM nel gel BN-PAGE. Regolare il volume di carico per assicurarsi che le intensità del controllo del caricamento, come la proteina della matrice mitocondriale Mcp60 (Hsp60), siano uguali tra tutti i campioni dopo l'esposizione finale¹⁵.
3. Far funzionare il gel a una tensione/corrente costante di 80 V/6 mA per circa 30 minuti utilizzando un tampone catodico con Coomassie G-250 allo 0,02% (w/v). Successivamente, sostituire il tampone catodico blu con tampone catodico senza Coomassie G-250 e continuare a funzionare a una corrente costante di 10 mA per circa 3 ore fino a quando il fronte del colorante blu Coomassie G-250 raggiunge il fondo del gel.
   1. Per prevenire la degradazione o lo smontaggio dei complessi della catena respiratoria mitocondriale, far scorrere il gel con tamponi pre-raffreddati a 4 °C. Per il gel prefabbricato, utilizzare il buffer di scorrimento prefabbricato. Per il gel fatto a mano, utilizzare il tampone di esecuzione dell'anodo BN-PAGE 1x (50 mM Bis-Tris, pH 7,0, regolato con HCl) e 1 tampone di scorrimento del catodo BN-PAGE (15 mM Bis-Tris, pH 7,0, regolato con HCl; 50 mM Tricine).
4. Taglia la corsia del gel caricata con il marcatore proteico. Colorare il pennarello con il tampone Coomassie R-250 per 15 min. Spuntare fino a quando il marcatore non è visibile.
   NOTA: Il marcatore proteico ad alto peso molecolare per la PAGE nativa non è precolorato. Sarà visibile dopo la colorazione con Coomassie R-250.
5. Immergere l'altra parte del gel nel tampone di trasferimento 1x BN-PAGE (Tabella 7) per il bilanciamento di 30 minuti. Sciacquare la membrana blot in PVDF delle stesse dimensioni da 0,45 μm con metanolo al 100% e immergerla nel tampone di trasferimento BN-PAGE per il bilanciamento per 10 minuti. Trasferire le proteine nel gel su una membrana blot in PVDF da 0,45 μm a una corrente costante di 300 mA per 2 ore.
   NOTA: La membrana in nitrocellulosa (NC) non è consigliata poiché la membrana NC lega molto strettamente il colorante Coomassie G-250.
6. Sciacquare la membrana PVDF con metanolo al 100% per lavare via il colorante blu Coomassie G-250. Incubare la membrana in PVDF nel tampone bloccante a base di 1x TBS (50 mM Tris, pH 8,0, regolato con HCl; 150 mM NaCl) contenente latte scremato al 5% (p/v) per 1 ora a 25 °C.
7. Incubare la membrana in PVDF con gli anticorpi primari indicati contro i complessi della catena respiratoria mitocondriale di S. pombe per una notte a 4 °C.
   NOTA: La concentrazione dell'anticorpo Cob1 per la rilevazione del complesso III è 1: 1.000. La concentrazione dell'anticorpo Cox1 per la rilevazione del complesso IV è 1: 2.000. La concentrazione di anticorpi Atp6 per rilevare il complesso V è 1: 200.
8. Lavare la membrana in PVDF con 1x tampone TBST (Tabella 8). Incubare la membrana in PVDF con l'anticorpo secondario a una concentrazione di 1:10.000 per 1 ora a 25 °C.
9. Lavare la membrana in PVDF con 1x tampone TBST. Esporre e scansionare la membrana in PVDF. Allineare l'immagine esposta del gel BN-PAGE con l'immagine del marcatore proteico nativo per stimare i pesi molecolari dei complessi e dei supercomplessi della catena respiratoria mitocondriale.

In precedenza abbiamo utilizzato questo protocollo per studiare gli effetti della delezione di shy1, l'omologo di S. pombe di SURF1 umano, sull'espressione di proteine della catena respiratoria codificate dal mtDNA e sull'assemblaggio di complessi della catena respiratoria mitocondriale. Abbiamo scoperto che i livelli allo stato stazionario di Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 e Atp6 erano significativamente ridotti nel ceppo Δshy1 (Figura 3), indicando che Shy1 è necessario per l'espressione delle proteine della catena respiratoria codificate dal mtDNA. Inoltre, l'analisi BN-PAGE ha mostrato che l'abbondanza di supercomplessi della catena respiratoria solubilizzati DG III2IV2 e III2IV è stata ridotta dalla delezione shy1 , mentre l'abbondanza dei supercomplessi III2 e V/Vn non è stata significativamente alterata nelle cellule Δshy1 (Figura 4A). Inoltre, l'abbondanza del complesso dimerico III (III2) solubilizzato in DDM è rimasta invariata nel ceppo Δshy1 (Figura 4B). Questi dati BN-PAGE indicano che Shy1 è necessario anche per la formazione di supercomplessi della catena respiratoria che coinvolgono il complesso IV.

Figura 1: Diagramma di flusso sperimentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini microscopiche delle cellule di S. pombe durante l'isolamento dei mitocondri. (A) La normale forma a bastoncello delle cellule di S. pombe prima della digestione della parete cellulare. (B) La forma rotonda degli sferoplasti di S. pombe dopo la digestione della parete cellulare. (C) Gli sferoplasti di S. pombe rotti dopo l'omogeneizzazione cellulare. Barre di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immunoblot delle proteine della catena respiratoria mitocondriale codificate dal mtDNA dopo SDS-PAGE nei ceppi di S. pombe WT e Δshy1. I livelli allo stato stazionario delle proteine della catena respiratoria mitocondriale codificate dal mtDNA sono stati rilevati mediante SDS-PAGE e immunoblotting utilizzando gli anticorpi indicati contro Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 e Atp6. Hsp60 funge da controllo del carico. Questa cifra è stata modificata da Luo et al.15. Le macchie grezze sono incluse nella Figura 1 supplementare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immunoblot dei complessi della catena respiratoria mitocondriale dopo BN-PAGE nei ceppi di S. pombe WT e Δshy1. (A) L'abbondanza di supercomplessi della catena respiratoria mitocondriale solubilizzati dal detergente DG è stata rilevata mediante BN-PAGE e immunoblotting utilizzando gli anticorpi indicati contro Cob1, Cox1 e Atp6. Hsp60 funge da controllo del carico. (B) L'abbondanza del complesso dimerico III della catena respiratoria mitocondriale solubilizzato dal detergente DDM è stata rilevata mediante BN-PAGE e immunoblotting utilizzando l'anticorpo indicato contro Cob1. Hsp60 funge da controllo del carico. Questa cifra è stata modificata da Luo et al.15. Le macchie grezze sono incluse nella Figura 2 supplementare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Componenti del terreno YES per la coltura delle cellule di S. pombe .

Tabella 2: Componenti del tampone 1x S per la sospensione degli sferoplasti di S. pombe .

Tabella 3: Componenti del tampone di omogeneizzazione 1x per la macinazione degli sferoplasti di S. pombe .

Tabella 4: Componenti di 1x tampone SEM per la sospensione dei mitocondri di S. pombe .

Tabella 5: Componenti del tampone campione 3x BN-PAGE per la preparazione del campione proteico utilizzato in BN-PAGE. Coomassie G-250 deve essere completamente sciolto con la sonicazione.

Tabella 6: Componenti del gel BN-PAGE al 3% e al 12% per la preparazione del gel sfumato BN-PAGE fatto a mano.

Tabella 7: Componenti di 1x tampone di trasferimento BN-PAGE per il trasferimento di proteine nel gel BN-PAGE.

Tabella 8: Componenti di 1x tampone TBST per l'immunoblotting.

Figura 1 supplementare: Macchie grezze SDS-PAGE per i ceppi di S. pombe WT e Δshy1. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Macchie BN-PAGE grezze dei ceppi di S. pombe WT e Δshy1. Clicca qui per scaricare questo file.

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