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Articolo metodologico

Istituzione di un sistema di co-coltura di organoidi tumorali colorettali derivati da pazienti e linfociti infiltranti il tumore (TIL)

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DOI:

10.3791/68346

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27 giugno 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Key Laboratory of biomarker high throughput screening and target translation of breast and gastrointestinal tumor, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, 2Department of General Surgery, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University

In questo articolo

Sommario

Il protocollo descrive un metodo per la creazione di un modello di organoide di cancro colorettale (CRC) derivato da pazienti co-coltivato con linfociti infiltranti il tumore (TIL) per studiarne le interazioni e il potenziale terapeutico. Questo modello fornisce una piattaforma preclinica per esplorare le risposte immunitarie nel microambiente tumorale e per prevedere l'efficacia della terapia basata su TIL per il trattamento personalizzato del CRC.

Abstract

Il cancro del colon-retto (CRC) è il terzo tumore più comune al mondo. I linfociti infiltranti il tumore (TIL) sono stati identificati come un importante marcatore prognostico nel CRC. L'applicazione terapeutica dei TIL ha già mostrato risultati promettenti nel melanoma e nel cancro cervicale. Tuttavia, il loro utilizzo nella terapia del CRC rimane in una fase esplorativa. Al momento non è disponibile un modello in vitro adatto per valutare l'efficacia del TIL, il che ostacola ulteriori progressi in questo campo. I modelli di organoidi derivati da pazienti (PDO), che conservano strettamente le caratteristiche del tessuto tumorale originale e riflettono l'eterogeneità tra pazienti, forniscono un'eccellente piattaforma per studiare l'interazione tra CRC e TIL. In questo studio, viene descritto un metodo per stabilire un modello di organoide CRC derivato da paziente da tessuto tumorale appena resecato, seguito dall'isolamento e dall'espansione dei TIL. Questo sistema consente la co-coltura di organoidi CRC e TIL, consentendo la valutazione della citotossicità mediata da TIL e delle risposte immunitarie. Analizzando l'efficacia dell'uccisione del TIL sugli organoidi, è possibile prevedere i potenziali risultati dell'immunoterapia basata su TIL per il trattamento personalizzato del CRC. Inoltre, un'ulteriore ingegnerizzazione dei TIL potrebbe migliorare la loro efficacia antitumorale, offrendo una strategia promettente per lo sviluppo di terapie cellulari più efficaci. Questo modello di co-coltura PDO-TIL fornisce un potente strumento per la valutazione preclinica delle terapie TIL e delle strategie di trattamento personalizzate nel CRC.

Introduzione

Il cancro del colon-retto (CRC) è uno dei tumori più diffusi e letali a livello globale, rappresentando una delle principali sfide per la salute pubblica1. Nonostante i progressi nelle modalità di trattamento, tra cui chirurgia, chemioterapia e immunoterapia, la prognosi per i pazienti con CRC, in particolare quelli con malattia metastatica, rimane sfavorevole. Il microambiente tumorale (TME) svolge un ruolo fondamentale nel plasmare la progressione del cancro e le risposte al trattamento, con i linfociti infiltranti il tumore (TIL) che emergono come componenti chiave che influenzano la risposta immunitaria contro il cancro2. I TIL, una popolazione diversificata di cellule immunitarie presenti all'interno dei tumori, sono stati identificati come marcatori prognostici significativi nel CRC, con alti livelli di infiltrazione di TIL spesso associati a migliori esiti clinici3. Studi recenti hanno anche evidenziato il potenziale terapeutico dei TIL in altri tumori, come il melanoma4 e il cancro cervicale5, dove l'immunoterapia basata su TIL ha dimostrato un'efficacia promettente.

Tuttavia, nonostante il successo dei TIL in alcuni tipi di cancro, la loro applicazione nel CRC rimane un'area di ricerca in corso. La complessità e l'eterogeneità del CRC, insieme al microambiente tumorale immunosoppressivo, presentano sfide per un'efficace immunoterapia basata su TIL6. I tumori CRC spesso presentano una TME7 altamente immunosoppressiva, caratterizzata dalla presenza di cellule T regolatorie (Treg), cellule soppressori di derivazione mieloide (MDSC) e macrofagi associati al tumore (TAM), che inibiscono attivamente la funzione del TIL. Inoltre, le cellule CRC esprimono frequentemente molecole di checkpoint immunitario, come PD-L1, che possono ostacolare ulteriormente l'uccisione mediata da TIL8. Inoltre, l'eterogeneità genetica dei tumori CRC, unita a uno stroma immunosoppressivo, complica la capacità dei TIL di colpire ed eliminare efficacemente le cellule tumorali, rendendo più difficile raggiungere lo stesso livello di successo osservato nel melanoma e nel cancro cervicale9. Una lacuna critica nella ricerca attuale è la mancanza di modelli in vitro adeguati in grado di simulare accuratamente le interazioni tra CRC e TIL. Tali modelli sono essenziali per valutare il potenziale dei TIL nella terapia del CRC e ottimizzare la loro applicazione per strategie di trattamento personalizzate.

Gli organoidi derivati da pazienti (PDO) sono emersi come un potente strumento per modellare i tumori umani10. Queste colture 3D, derivate dai tessuti tumorali dei pazienti, imitano da vicino le caratteristiche istologiche e genetiche dei tumori originali, fornendo una rappresentazione più accurata della biologia dei tumori rispetto alle tradizionali linee cellulari 2D. I modelli PDO mantengono anche l'eterogeneità tra i pazienti, rendendoli ideali per gli approcci di medicina personalizzata11. Nel CRC, le PDO sono state utilizzate per lo screening farmacologico e per lo studio della biologia dei tumori12, ma il loro uso nella valutazione delle risposte immunitarie, in particolare nel contesto dei TIL, rimane limitato. La progettazione di un modello di co-coltura di cellule PDO-cellule immunitarie deve bilanciare la complessità del microambiente con la controllabilità sperimentale. Sebbene componenti come i macrofagi e le cellule dendritiche possano migliorare la biomimetica, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono diventate la scelta principale grazie alla loro accessibilità. Tuttavia, le PBMC hanno una bassa percentuale di cellule T tumore-specifiche e le sottopopolazioni di monociti possono interferire con la stabilità microambientale13. Al contrario, i TIL arricchiscono naturalmente i cloni reattivi al tumore e portano un fenotipo di esaurimento in situ, rendendoli un modello superiore per analizzare con precisione i meccanismi di evasione immunitaria nel cancro del colon-retto.

Lo scopo di questo studio è quello di sviluppare una nuova piattaforma in vitro per valutare le risposte antitumorali mediate da TIL nel CRC stabilendo un sistema di co-coltura di CRC PDO e TIL. Questo modello consente la valutazione diretta della citotossicità del TIL contro i CRC PDO e l'analisi delle risposte immunitarie in un contesto specifico del paziente. L'utilizzo di questo sistema può fornire informazioni più approfondite sul potenziale delle immunoterapie basate su TIL per il CRC e supportare l'esplorazione di strategie per migliorare l'efficacia del TIL attraverso approcci ingegneristici. I metodi precedenti erano limitati dal piccolo numero di TIL14. Nella maggior parte dei casi, le PBMC sono state prima co-coltivate con PDO per due settimane, dopodiché i TIL tumore-specifici potevano essere espansi dalle PBMC e poi ulteriormente co-coltivati con PDO per osservare gli effetti citotossici15. Tuttavia, questo approccio soffre anche di tempi di modellazione prolungati e di una bassa resa complessiva. Al contrario, il metodo descritto consente l'isolamento e la definizione di PDO e TIL da campioni di tessuto tumorale più piccoli, che possono quindi essere direttamente co-coltivati. Questo approccio può offrire una maggiore convenienza sia in termini di metodologia che di efficienza. In definitiva, questo sistema mira a fornire un potente strumento per la valutazione preclinica delle terapie TIL, aprendo la strada a strategie di trattamento personalizzate che possono migliorare i risultati per i pazienti con CRC.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti che coinvolgono materiali di origine umana sono stati condotti in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e sono stati approvati in anticipo dal Comitato Etico dell'Ospedale Zhongshan affiliato all'Università di Dalian (numeri di approvazione: KY2023-206-1). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti che hanno fornito campioni clinici per questo studio. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

I criteri di inclusione includevano tessuto di cancro colorettale primario patologicamente confermato, una dimensione del campione sufficiente (≥1 cm3), nessuna storia di terapia neoadiuvante (chemioradioterapia o terapia mirata) e consenso informato firmato. I criteri di esclusione comprendevano una scarsa qualità del campione con necrosi o fibrosi superiori al 50%, la presenza di concomitanti infezioni gravi o malattie autoimmuni, una storia di altri tumori maligni e il rifiuto del paziente di partecipare.

1. Preparazione dei reagenti per colture cellulari

  1. Terreno di coltura per CRC DOP: preparare il terreno completo CRC DOP secondo la composizione descritta nella Tabella 1.
  2. Terreno completo (CM) per TIL16: Integrare RPMI1640 terreno con il 10% di FBS, l'1% di penicillina-streptomicina, HEPES, 2-mercaptoetanolo e 3000 UI/mL di IL-2.
  3. Terreno di espansione TIL (EM): Integrare RPMI1640 terreno con il 10% di FBS, l'1% di penicillina-streptomicina, HEPES e 600 UI/mL di IL-2.
  4. AdDMEM++++: Integrare Advanced DMEM con l'1% di penicillina-streptomicina, l'1% di HEPES, l'1% di glutammina e 5 mM di Y-27632.
  5. Tampone per la digestione del CRC: aggiungere 50 μL di collagenasi di tipo IV e 10 μL di soluzione di penicillina-streptomicina-amfotericina B ad AdDMEM++++.
  6. Soluzione per il lavaggio dei tessuti: aggiungere il 2% di penicillina-streptomicina al PBS.

2. Processazione tissutale derivata dal paziente

  1. Resecare il tessuto tumorale primario del cancro del colon-retto (da eseguire da chirurghi esperti). Dopo la raccolta, dividere il fazzoletto in due parti. Metti una parte di AdDMEM++++ in una ghiacciaia e trasportala in laboratorio per la dissociazione e la coltura delle cellule tumorali. Mettere l'altra parte in paraformaldeide al 4% per l'analisi istopatologica17.
  2. Scongelare lentamente il Matrigel in frigorifero a 4 °C. Preriscaldare il tampone di lisi eritrocitaria a temperatura ambiente. Preparare le forbici per tessuti, le pinze, il terreno AdDMEM++++ e il tampone per la digestione CRC.
  3. Trasferire il fazzoletto in una capsula di Petri e risciacquare tre volte con 5 ml di PBS. Sostituire con una nuova piastra e risciacquare tre volte con 5 ml di tampone per il lavaggio dei fazzoletti per ridurre al minimo la contaminazione.
  4. Tritare il fazzoletto con le forbici, trasferirlo nel tampone digestivo e incubare in un bagno d'acqua a 37 °C per 30 minuti fino alla completa dissociazione.
  5. Taglia il fazzoletto con le forbici per fazzoletti e trasferiscilo nella soluzione per la digestione dei tessuti. Digerire il tessuto in un bagno d'acqua a 37 °C e monitorare fino al completamento della dissociazione tissutale.
  6. Aggiungi un volume uguale di AdDMEM++++ per neutralizzare la digestione. Centrifugare a 380 × g per 5 min a 25 °C.
  7. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta. Osservare il numero di eritrociti nel pellet. Aggiungere 1-3 mL di lisato eritrocitario e incubare per 10 minuti a 25 °C.
    1. Terminare la lisi con un volume uguale di AdDMEM++++. Centrifugare a 380 × g per 5 min a circa 25 °C.
  8. Scartare il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere il pellet cellulare in un volume appropriato di AdDMEM++++.
  9. Quantificare le cellule vitali utilizzando l'esclusione del blu di tripano per ottenere una sospensione unicellulare di tessuto tumorale.

3. Istituzione del modello DOP e cultura TIL

  1. Dividere la sospensione unicellulare di tessuto tumorale in due porzioni: utilizzarne una per l'istituzione del modello PDO e l'altra per la coltura TILs.
  2. Dopo il conteggio delle cellule, miscelare 80.000 cellule per pozzetto della sospensione cellulare con Matrigel in un rapporto 1:1 per l'instaurazione del modello PDO.
  3. Risospendere la sospensione cellulare rimanente in CM in una piastra a 24 pozzetti a una concentrazione di 1 × 106 cellule/mL per la coltura di TIL.
  4. Osservare quotidianamente. Scatta fotografie per registrare lo stato di PDO e TIL. Cambia il mezzo ogni 2 giorni.

4. Purificazione ed espansione dei TIL

  1. Colture TIL per 10-20 giorni prima della purificazione.
  2. Raccogli i TIL in una provetta da centrifuga. Sciacquare la piastra a pozzetti con terreno fresco e raccogliere eventuali celle rimanenti dalla piastra a pozzetti.
  3. Centrifugare a 125 × g per 5 min a circa 25 °C.
  4. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta. Lavare con 2 mL di PBS e centrifugare nuovamente a 125 × g per 5 minuti a circa 25 °C.
  5. Eseguire il conteggio delle cellule.
  6. Utilizzare microsfere magnetiche CD3+ per lo smistamento per isolare le cellule T CD3+18.
  7. Incubare l'anticorpo con la sospensione cellulare a 4 °C per 10-15 minuti.
  8. Incubare le microsfere magnetiche con la sospensione anticorpo-cellula a 4 °C per 10-15 minuti.
  9. Posizionare la colonna di smistamento nel magnete di smistamento. Aggiungere la sospensione cellulare alla colonna e lasciare che solo le celle positive marcate con microsfere magnetiche vengano trattenute nella colonna di smistamento.
  10. Rimuovere la colonna di smistamento dal campo magnetico. Aggiungere una soluzione tampone per eluire le cellule positive trattenute nella colonna. Risospendere le cellule in 2 mL di PBS e centrifugare a 195 × g per 5 minuti a circa 25 °C.
  11. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta. Risospendere le cellule in una piastra a 12 pozzetti con terreno EM fresco a una concentrazione di 1 × 106 cellule/mL. Aggiungere 5 μg/mL di anticorpo CD3. Far passare le cellule in nuovi palloni di coltura ogni 3 giorni.

5. Istologia e caratterizzazione IHC delle DOP

  1. Aspirare il terreno di coltura dopo che gli organoidi hanno raggiunto una dimensione di 50 μm.
  2. Fissare le sfere dell'organoide direttamente in paraformaldeide al 4%. Aspirare gli organoidi, centrifugare a 195 × g per 5 minuti a circa 25 °C, immergerli in agarosio al 2%, lasciare indurire e trasferire al 4% di paraformaldeide per il fissaggio notturno.
  3. Il giorno seguente, eseguire la disidratazione graduale. Preparare blocchi di cera, tagliare sezioni da 4 μm, reidratare utilizzando un gradiente ed eseguire la colorazione immunoistochimica utilizzando gli anticorpi CK7, CK20, Ki-67 e CDX-2.

6. Caratterizzazione IF dei TIL

  1. Purificare i TIL, coltivarli fino a raggiungere un numero adeguato ed estrarne una porzione per la caratterizzazione.
  2. Caratterizzare le celle di sospensione utilizzando il metodo dello sfaldamento. Impostare la velocità di rotazione della fioccatrice a 343 × g per 4 minuti a circa 25 °C.
  3. Contare e seminare le cellule a 1 × 104 per vetrino.
  4. Fissare saldamente le cellule ai vetrini mediante centrifugazione.
  5. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 15 minuti e lavare tre volte con PBS.
  6. Incubare con soluzione bloccante (PBS contenente il 2% di FBS) per 1 ora.
  7. Incubare con anticorpi primari (CD45, CD3, EpCAM) per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare tre volte con PBS.
  8. Preparare e incubare con l'anticorpo secondario secondo la concentrazione raccomandata dal produttore per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare tre volte con PBS.
    NOTA: Prestare attenzione all'omologia degli anticorpi.
  9. Incubare con DAPI per 15 minuti a circa 25 °C.
  10. Osservare le cellule colorate al microscopio a fluorescenza.

7. Sistema di co-coltura di DOP e TIL

  1. Aggiungere IFN-γ al terreno organoidico per migliorare la presentazione dell'antigene. Incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 24 h15.
  2. Diluire l'anticorpo anti-CD28 con PBS. Rivestire una piastra da 96 pozzetti aggiungendo 50 μl della soluzione di anticorpi a ciascun pozzetto. Sigillare la piastra con pellicola sigillante e incubare a 4 °C per 24 ore.
  3. Dopo 24 ore, dissociare gli organoidi in singole cellule utilizzando TrypLE. Contare le cellule e lavare due volte con PBS.
  4. Raccogli i TIL accoppiati, conta le cellule e lava due volte con PBS.
  5. Inoculare gli organoidi a 1 × 104 cellule per pozzetto e inoculare i TIL a 1 × 105 cellule per pozzetto per ottenere un rapporto effettore-bersaglio (E:T) di 10:1 per la co-coltura.
  6. Eseguire la co-coltura in terreno RPMI 1640 integrato con FBS al 10%, penicillina-streptomicina all'1%, 3000 U/mL di IL-2 e 20 μg/mL di anticorpi bloccanti anti-PD-1. Incubare per 3 giorni e acquisire immagini per l'osservazione e la documentazione.
    NOTA: Impostare gli organoidi senza TIL come gruppo di controllo.

8. Dosaggio funzionale dei TIL mediante citometria a flusso

  1. Raccogli le DOP e i TIL alla fine del periodo di co-coltura.
  2. Lavare le celle due volte con PBS per centrifugazione a 300 × g per 5 minuti ogni volta. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta.
  3. Preparare il cocktail di anticorpi contenente CD3-FITC, CD4-APC/Cianina7, CD8-APC, CD107a-PE-Cianina7, CD279-PE e 7-AAD.
  4. Risospendere le cellule in 100 μL del cocktail di anticorpi e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti, al riparo dalla luce.
  5. Aggiungere 1 ml di PBS per lavare le cellule. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti e scartare il surnatante con una pipetta.
  6. Risospendere le cellule in 500 μL di PBS.
  7. Eseguire l'analisi della citometria a flusso. Fare riferimento alla Figura 1 supplementare per la strategia di analisi dettagliata.

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Risultati

Definizione e caratterizzazione delle DOP CRC
I campioni tumorali sono stati ottenuti da pazienti con CRC. Il tessuto tumorale CRC appena resecato è stato utilizzato per stabilire PDO e TIL, che sono stati successivamente impiegati in esperimenti di co-coltura PDO-TIL (Figura 1).

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Figura 1<...

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Discussione

Questo studio utilizza il tessuto CRC derivato dal paziente per ottenere sia cellule tumorali che TIL, da cui vengono stabiliti i PDO e i TIL vengono espansi. L'interazione tra queste due componenti viene quindi studiata attraverso un sistema di co-coltura.

In studi precedenti, i TIL sono stati estratti utilizzando strumentazione complessa19 o direttamente da sospensioni di tessuto tumorale20. Tuttavia, questi me...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China [82172822]; Programma di supporto all'innovazione dei talenti di alto livello dell'Ufficio per la scienza e la tecnologia di Dalian [2021RD02]; Piano congiunto del programma provinciale di scienza e tecnologia del Liaoning [2024JH2/102600067]; Progetto provinciale di cooperazione scientifica e tecnologica internazionale del Liaoning [2024JH2/101900006].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM/F-12 avanzatoGibco12634028
2-mercaptoetanolosigma63689
4% paraformaldeideBBIE672002-0100
7 AADBioleggenda420403
A83-01Tocris2939
Supplemento B27Gibco17504-44
CD107a-PE-Cianina 7Bioleggenda328618
CD279-PEBioleggenda329906
Anticorpo monoclonale CD3 (OKT3)Invitrogen14-0037-82
CD3-FITCBioleggenda300406
CD45 (dominio intracellulare) (D9M8I) CSTCodice: 13917S
CD4-APC/Cianina7Bioleggenda300518
CD8-APCBioleggenda344722
CDX-2MXBCodice: RMA-0631
CK20MXBKIT-0025
CK7MXBKIT-0021
Dylight 488, IgG anti-coniglio di capraAbbkineCodice: A23220
Dylight 549, IgG anti-topo di capraAbbkineCodice A23310
FEGPeprotechAF-100-15
EpCAMCSTCodice 36746T
Siero fetale bovino (FBS)CellmaxSA211.02
FGF 10Peprotech100-26
Gastrin (Umano)Tocris3006
GlutaMax 100xGibco35050-061
HepesSigmaH4034
HEPESSigmaH4034
Kit di separazione cellulare CD3+ umano (RUO)RWDK1201-10
Proteina ricombinante IFN-gamma umanaPeproTech300-02-20UG
Ki-67CST9449
MatrigelCorning354234
N-acetilcisteinaSigmaCodice: A9165
NicotinammideSigmaN0636
Nivolumab (anti-PD-1)SellerkA2002 
Penicillina/StreptomicinaSigmaV900929
penicillina-streptomicinaNCM BiotechC100C5
PrimocinaInvivogenFormica-pm-1
Tampone di lisi dei globuli rossitermo-innevatore00-4300-54
IL-2 umana ricombinante (senza carrier)Bioleggenda589104
RPMI 1640Gibco
SB202190SellerkEpisodio 1077
Trypan Macchia blu 0,4%termo-innevatoreT10282
Ultra-LEAF Anticorpo CD28 umano purificatoBioleggenda302934
Ultra-LEAF Anticorpo CD3 umano purificatoBioleggenda317325
Y-27632SellerkEpisodio 1049

Riferimenti

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