Questa è la prima parte di un protocollo di campionamento completo di Xenopus . I tessuti campionati sono il ventricolo cardiaco, il tronco arterioso, il lobo del fegato sinistro, la cistifellea, il polmone, il pancreas, la milza, la laringe, l'esofago, lo stomaco, l'intestino, i testicoli, i corpi adiposi, l'ovidotto, i reni accoppiati, il plesso sciatico, la pelle, il timo e l'intero occhio.
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Articolo metodologico
Tecniche efficienti per il campionamento completo di tessuti accessibili in Xenopus adulto
In questo articolo
Sommario
Abstract
Xenopus è stato a lungo un organismo modello fondamentale per lo studio dello sviluppo e della malattia dei vertebrati, offrendo approfondimenti sui processi cellulari e sulla funzione genica. Nonostante la ricchezza di informazioni sullo Xenopus embrionale, rimane una lacuna significativa nei metodi standardizzati per il campionamento di tessuti adulti, in particolare per approcci moderni come la proteomica quantitativa. Questo studio introduce un protocollo completo per il campionamento rapido, preciso ed efficiente di più tessuti in Xenopus adulto. Il protocollo affronta le sfide associate alle sottili differenze anatomiche rispetto ad altri anuri, garantendo la riproducibilità anche per coloro che hanno un'esperienza limitata nella dissezione delle rane. Questo protocollo è ottimizzato per analisi biochimiche di alta qualità, dando priorità alla freschezza del campione. Stiamo facilitando la raccolta rapida di un massimo di 18 tessuti in un'ora. Inoltre, i metodi si applicano a condizioni perfuse e non perfuse, fornendo flessibilità per una serie di esigenze sperimentali. Questo lavoro non solo colma una lacuna metodologica critica per Xenopus laevis e tropicalis , ma funge anche da risorsa preziosa per i ricercatori che adattano le tecniche a modelli di anfibi simili, migliorando così la portata e l'affidabilità degli studi biologici ed evolutivi comparativi.
Introduzione
Xenopus offre vantaggi unici rispetto a topi, pesci zebra e altri organismi modello per lo studio delle malattie umane, in particolare in contesti di sviluppo ed evolutivi. Il suo sviluppo embrionale esterno e gli embrioni grandi e facilmente manipolabili consentono l'osservazione in tempo reale e gli interventi sperimentali (ad esempio, innesto di tessuti, editing genetico) che sono impegnativi nei topi, che si sviluppano internamente e richiedono procedure invasive. Inoltre, il cuore a tre camere e gli arti tetrapodi di Xenopus forniscono un ponte evolutivo più diretto per lo studio dei difetti congeniti1, della rigenerazione degli arti2 e dello sviluppo cardiaco3. A differenza dei topi, i girini di Xenopus possono rigenerare arti e organi, modellando processi rigenerativi assenti nei mammiferi, mentre il loro stadio di vita acquatica consente lo studio non invasivo degli impatti ambientali o delle tossine. In combinazione con una riproduzione più rapida, costi inferiori e meno vincoli etici, Xenopus è superiore per studi meccanicistici ad alto rendimento dell'organogenesi e delle risposte allo stress che sono difficili da replicare nei sistemi dei mammiferi.
Questo articolo mira a offrire una guida chiara per il campionamento preciso e riproducibile di organi di tessuti adulti di Xenopus, come è disponibile per i girini di Xenopus 4. Sebbene siano disponibili una "dissezione digitale"5 e un "imaging micro-CT"6 di Xenopus adulto, ottenere un campionamento coerente di organi e tessuti in Xenopus adulto rimane difficile senza le istruzioni dettagliate fornite per altri modelli adulti, come i topi 7,8,9.
Sebbene sia disponibile una guida di campionamento per sei tessuti cruciali10, attualmente non è disponibile una guida specifica ed estesa alla dissezione e al campionamento per Xenopus . Esiste una guida completa alla dissezione per Rana sp.11 e vari manuali di dissezione in classe sono disponibili per altri anuri12, Tuttavia, per gli individui che non hanno esperienza nelle tecniche di campionamento o nell'anatomia degli anfibi, le sottili differenze tra Xenopus e altri anuri rendono le risorse esistenti inadeguate per un campionamento coerente e replicabile dei tessuti.
Questa guida è stata sviluppata per dare priorità alla freschezza dei tessuti per la proteomica e l'immunochimica. Per un utente esperto, tutti i tessuti possono essere raccolti da un individuo in meno di un'ora. Si raccomanda che se un utente non ha esperienza, provi questo protocollo su esemplari che sono stati soppressi per altri motivi prima di sacrificare qualsiasi animale che è più difficile da sostituire.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati approvati ed eseguiti in conformità con le norme e i regolamenti della Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee IS 00001365_3). Se si segue il protocollo di perfusione13 prima del campionamento, andare al passaggio 2.3.
1. Preparazione (senza perfusione)
- Assicurarsi che l'istituto di ricerca abbia approvato la tecnica di eutanasia descritta nel presente protocollo.
- Preparare una soluzione di 5 g/L di MS-222 (tricaina metansolfonato) e 5 g/L di bicarbonato di sodio (vedi Tabella dei materiali). Controllare il pH per assicurarsi che sia ≥7.
NOTA: Il volume deve essere superiore al volume necessario per coprire completamente gli animali sottoposti a soppressione. - Eseguire l'eutanasia primaria inserendo lo Xenopus nella soluzione MS-222 (dal passaggio 1.2), mantenendo l'animale immerso per un totale di 1 orae 14.
- Posizionare la superficie di dissezione (vassoio o foglio di schiuma) inclinata all'interno di un contenitore secondario o disporla in altro modo per facilitare il drenaggio del sangue.
- Una volta che la rana è rimasta nella soluzione per 1 ora, l'eutanasia primaria è stata completata. Rimuovere la rana e controllare la perdita di risposta al dolore eseguendo un pizzicamento del piede.
- Registrare l'età (se nota), il sesso e lo stato di salute dell'animale sottoposto a campionamento, nonché se è stato perfuso. Pesare lo Xenopus ed effettuare le misurazioni aggiuntive necessarie prima del campionamento.
- Posiziona la rana sul dorso e fissa gli arti anteriori prossimali al corpo (Figura 1A).
- Usando le forbici da dissezione taglia la pelle, lungo la linea mediana e poi lateralmente, facendo due lembi.
- Identificare la linea alba (Figura 1B). Usa una pinza per afferrare la linea alba ed estrarla dalla cavità celomica. Usa con attenzione le forbici per tagliare verso la testa, attraverso la muscolatura. Fai due lembi dalla parete della cavità e taglia o appunta tutti i lembi in modo che non siano d'intralcio.
- Identifica il cuore, che dovrebbe ancora battere. Se il cuore non è facilmente accessibile, utilizzare le forbici da dissezione per ridurre le ossa coracoidi (Figura 1B).
NOTA: Se il cuore ha smesso di battere prima del prelievo, la freschezza del campione è stata compromessa. - Se lo si desidera, completare il protocollo di perfusione rapida9.
2. Campionamento
NOTA: Se l'animale è stato perfuso, andare al passaggio 2.3. Tutti i margini devono essere di circa 25 mm. Le pinze e le forbici devono essere pulite o sostituite tra i campioni. Tutti i tessuti devono essere prelevati entro 1 ora dall'eutanasia, per la massima freschezza.
- Utilizzando una pipetta di trasferimento, sciacquare la cavità celomica con PBS refrigerato o 0,7x PBS15 per eliminare il sangue e mantenere la visibilità.
- Identificare il pericardio sottile (Figura 2A) e tenderlo con una pinza per tessuti. Utilizzando la punta delle forbici per iridectomia, perforarla delicatamente, facendo attenzione a non tagliare i tessuti sottostanti. Staccare il pericardio dalle tre camere del cuore (Figura 2B).
- Taglia via i padiglioni auricolari tagliandoli dove incontrano il ventricolo e il tronco arterioso.
- Usa una pinza per afferrare il ventricolo per l'apice e taglialo sotto il punto in cui incontra il tronco arterioso, lasciando un margine (Figura 2C).
- Ispezionare visivamente il ventricolo sotto ingrandimento per assicurarsi che non siano attaccati tessuti indesiderati.
NOTA: Il centro del ventricolo può includere tessuto valvolare a spirale di colore chiaro; Questo può essere mantenuto. Negli animali non perfusi, la rimozione del ventricolo può qualificarsi come eutanasia secondaria (chiamata anche anestesia terminale). - Immediatamente dopo il prelievo, sciacquare i campioni di tessuto in PBS refrigerato o PBS 0,7x, a seconda delle esigenze sperimentali15.
NOTA: Negli animali perfusi, ci si aspetta che tutti i tessuti, escluso il fegato, si sciacquino in modo pulito. In caso contrario, è necessario prendere nota. Nei tessuti non perfusi, tutti i mezzi di risciacquo saranno saturi di sangue. I passaggi 2.5-2.6 devono essere seguiti dopo che ogni tessuto è stato campionato. - Si osservi che il tronco arterioso si biforca in due tronchi aortici (chiamati anche aorti laterali) e che ciascuno si divide in tre archi arteriosi (Figura 2D). Tendere il tronco arterioso e tagliare i tronchi aortici subito dopo il punto in cui questi archi si dividono.
- Osservare i tre lobi del fegato (Figura 3A). Afferra il labbro del lobo sinistro (alla destra dell'osservatore) e sollevalo delicatamente in modo che i dotti epatici e cistici siano visibili. Campionare i 2/3 inferiori del lobo, sotto questi attacchi (Figura 3B).
- Identifica la cistifellea, che può variare drasticamente di colore. Afferrare la cistifellea, estrarla dal lobo destro del fegato e recidere il suo attacco (Figura 3C). Se non scoppia, rompilo con le forbici per iridectomia.
- Afferra l'apice del polmone e tiralo teso. Nota la consistenza degli alveoli e determina dove finisce quella consistenza e inizia il bronco. Tagliare in corrispondenza di questo margine (Figura 3D). Se il polmone è fuso con il peritoneo, staccarlo con cura.
- Identificare l'ovaio, che è avvolto da uno strato di peritoneo viscerale chiamato epitelio germinale. Spostare delicatamente i lobi fino a portarli sui rispettivi lati per rendere visibile l'area di attacco (Figura 4A); Questi attacchi sono direttamente ventrali al rene accoppiato. Usando le forbici, rimuovere le ovaie il più vicino possibile ai reni, senza danneggiarli (Figura 4B). Durante questo processo, se gli ovociti fuoriescono, campionali e poi risciacquali.
NOTA: La rimozione dell'ovaio è utile per ottenere un migliore accesso ai tessuti di una rana femmina. - Ispezionare il lobo anteriore (chiamato anche lobo mediano) del fegato e notare come si collega allo stomaco e al duodeno attraverso il mesentere (Figura 3A e Figura 4C). Recidere il mesentere e il legamento epatoduodenale usando le forbici per iridectomia. La restante massa carnosa è costituita dal pancreas e dal dotto biliare comune.
- Recidere la connessione del pancreas e del dotto biliare comune al lobo anteriore del fegato, lasciando un margine. Afferrare lo stomaco con una pinza dentata e un'estremità del pancreas con una pinza per tessuti. Sotto ingrandimento, stuzzicare delicatamente il pancreas dallo stomaco (Figura 4D).
- Se il pancreas non si stacca in modo pulito, rimuovere il tessuto pancreatico rimanente. In alternativa, staccare metodicamente il pancreas usando le forbici per iridectomia e le pinze per tessuti.
NOTA: Oltre al dotto biliare comune, si prevede che in questo campione saranno inclusi alcuni mesenteri e il dotto pancreatico.
- Se il pancreas non si stacca in modo pulito, rimuovere il tessuto pancreatico rimanente. In alternativa, staccare metodicamente il pancreas usando le forbici per iridectomia e le pinze per tessuti.
- Identificare la milza e campionarla tagliando il suo attacco al peritoneo (Figura 4E).
- Rimuovere e smaltire i tessuti epatici rimanenti.
- Rimuovere l'altro polmone e il bronco rimanente nel punto in cui si attaccano alla laringe. Afferrando la laringe per la sua estremità inferiore, inizia a sollevarla dalla cavità, recidendo gli attacchi chiari man mano che diventano evidenti.
- Quando la laringe viene sollevata, il suo attaccamento all'esofago diventerà evidente. Sbucciare e tagliare con cura il tessuto esofageo dalla laringe utilizzando le forbici per iridectomia curve (Figura 5A). Quindi, tira la laringe verso il basso e tagliala lontano dalla cavità orale. Taglia tutti gli allegati chiari che diventano evidenti.
- Si noti la curvatura dello stomaco, che lo differenzia dall'esofago, così come la restrizione pilorica che differenzia lo stomaco dall'intestino (Figura 5B). Tagliare il canale alimentare immediatamente anteriormente alla curvatura dello stomaco, separandolo dall'esofago.
- Aprire la bocca e identificare l'apertura condivisa delle tube di Eustachio sul suo tetto16. Con la bocca aperta, tirare l'esofago per notare il suo attacco (Figura 5C). Solleva l'esofago dalla cavità, recidendo gli attacchi chiari lungo il percorso. Recidere l'esofago dalla cavità buccale immediatamente sotto l'apertura di Eustachio.
- Afferrare lo stomaco e tagliarlo dove incontra il duodeno, in corrispondenza della restrizione pilorica (Figura 5A, B).
- Tendere il colon e tagliarlo il più vicino possibile alla cloaca (Figura 5D). Estrarre l'intestino, recidendo tutti gli attacchi peritoneali chiari.
- Se la rana è maschio, identificare i testicoli e rimuoverne uno utilizzando le forbici per iridectomia, facendo attenzione a non danneggiare il rene sottostante (Figura 6A).
- Separa i corpi grassi in modo che siano sui rispettivi lati; L'area sopra il rene, dove il corpo adiposo si collega al peritoneo, sarà visibile. Afferra la base di uno dei corpi grassi e usa le forbici per tagliarla via dal peritoneo, lasciando un margine (Figura 6B).
- Identificare e rimuovere la vescica urinaria, tagliando il più vicino possibile alla cloaca (Figura 6C).
- Se la rana è femmina o ha un ovidotto vestigiale distinto, afferrare l'estremità inferiore dell'ovidotto, estrarla dalla cloaca e tagliarla il più vicino possibile alla cloaca (Figura 6D). Estrarre l'ovidotto dalla cavità celomica, recidendo tutti gli attacchi peritoneali non appena diventano evidenti (Figura 6E).
- Rimuovere e smaltire i corpi adiposi rimanenti e i testicoli o l'ovidotto.
- Usa una pinza per afferrare i reni alla loro base inferiore e nota che sono coperti dal peritoneo chiaro (retroperitoneale)17. Recidere il peritoneo alla base del rene (Figura 7A) e quindi sollevare i reni dalla cavità celomica (Figura 7B), usando le forbici per recidere il peritoneo secondo necessità.
- Sotto ingrandimento, tagliare via il peritoneo in eccesso e il tessuto adiposo rimanente, l'ovaio o i testicoli.
- Osservare il fascio di nervi periferici che attaccano il termine della colonna vertebrale a ciascuna gamba; Questo è il plesso sciatico. Afferrare il fascio di nervi con una pinza e reciderli nel punto in cui escono dalla cavità celomica (Figura 7C). Sollevare il fascio dalla cavità e tagliarlo nel punto in cui i nervi lasciano la colonna vertebrale (Figura 7D).
- Rimuovi i perni dall'animale, capovolgilo sul suo ventre e riappunta gli arti dell'animale. Seleziona uno degli arti posteriori da cui campionare e appunta il piede di quell'arto.
- Rimuovere un lembo di pelle a forma di mandorla dal gastrocnemio/tibiofibula (Figura 8A, B).
- Afferrare la pelle del dorso e tagliarla lateralmente in modo che ci sia un taglio continuo intorno alla parte centrale dell'animale (Figura 8C).
- Rimuovere i perni, fissare le gambe con una mano e afferrare la pelle dorsale anteriore con una pinza dentata. Scuoiare l'animale tirando la pelle dorsale verso l'alto sopra la testa e le braccia, usando la forza (Figura 8D).
- Identificare la massa grassa che copre l'articolazione della mascella, recidere il margine posteriore della massa da dove è fusa ai tessuti muscolari rosa, quindi utilizzare le forbici per iridectomia per tagliarla via dall'osso sottostante (Figura 9A). A seconda dell'età e della maturità dell'animale, diventerà evidente un gruppo di melanofori (Figura 9B). Taglia la massa in modo che non siano attaccati attacchi muscolari o cartilagine.
- Repin l'animale e seleziona un occhio. Inserire le forbici curve per iridectomia nell'orbita attorno alla curvatura dell'occhio (Figura 9C). Tagliare delicatamente intorno all'occhio, recidendo gli attacchi muscolari.
- Fai scorrere le forbici più in profondità nell'orbita e stacca il nervo ottico, dietro l'occhio. Usa queste forbici per spostare l'occhio fuori dall'orbita e quindi ridurre ulteriormente eventuali attacchi muscolari.
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Risultati
Seguendo tutte le fasi di questo protocollo, il ventricolo cardiaco, il tronco arterioso, il lobo epatico sinistro, la cistifellea, il polmone, il pancreas, la milza, la laringe, l'esofago, lo stomaco, l'intestino, i testicoli, i corpi adiposi, l'ovidotto, i reni accoppiati, il plesso sciatico, la pelle, il timo e l'intero occhio sono stati asportati in modo pulito entro un'ora dall'eutanasia (vedi Figura 1, Figura 2, Figura 3
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Discussione
Il protocollo qui presentato è progettato per fornire flessibilità agli utenti a vari livelli di esperienza, garantendo al contempo la raccolta dei tessuti essenziali in modo tempestivo ed efficiente. Si consiglia ai nuovi utenti di seguire ogni passaggio del protocollo come descritto per garantire la raccolta sistematica dei tessuti. Gli utenti più esperti, tuttavia, possono scegliere di saltare alcuni passaggi e campionare solo i tessuti di cui hanno bisogno. Ad esempio, l'accesso alla...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi concorrenti da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione OD R24 del NIH ODO31956. Vorremmo anche ringraziare Samantha Jalbert e Jill Ralston per la loro assistenza e supporto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Lente d'ingrandimento 5x con luce LED e supporto | amazon.com | B08QJ6J8P1 | luce non deve produrre calore |
| Pipette di trasferimento monouso | VWR | 414004-036 | |
| Pinze da dissezione a punta fine | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Forbici da dissezione affilate piont, dritte 6,5" | VWR | 76457-374 | |
| I | Fisher Scientific | 14-370-284 | sono un'alternativa accettabile |
| Contenitore per eutanasia | Plastica USA | Articolo 2860 | contenitori opachi alternativi accettabili |
| Coperchio del contenitore per eutanasia | US Plastic | Articolo 3047 | |
| Forbici per iridectomia 6" | VWR | 470018-938 | Le forbici per iride sono un'alternativa accettabile |
| MS-222: Sincaina (precedentemente tricaina) | Pentair AES | TRS1 | |
| Forcipe per tessuto dentale di ratto 5,5 pollici, acciaio inossidabile | Fisher Scientific | S08100 | |
| Bicarbonato di sodio, polvere, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Pinza per campioni, perni a T seghettati | VWR | 82027-442 | |
| per la dissezione | di Fisher Scinetific | S99385 |
Riferimenti
- Duncan, A. R., Khokha, M. K. Xenopus as a model organism for birth defects—Congenital heart disease and heterotaxy. Semin Cell Biol. 51, 73(2016).
- Kawasumi-Kita, A., et al. hoxc12/c13 as key regulators for rebooting the developmental program in Xenopus limb regeneration. Nat Commun. 15, 3340(2024).
- Hoppler, S., Conlon, F. L. Xenopus: experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200(2020).
- Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. Xenopus tadpole tissue harvest. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), (2017).
- Porro, L. B., Richards, C. T. Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography. J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).
- Laznovsky, J., et al. Unveiling vertebrate development dynamics in frog Xenopus laevis using micro-CT imaging. Gigascience. 13, giae037(2024).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice—Part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice—Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 413-431 (2004).
- Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice—Part 3. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 433-449 (2004).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult Xenopus. J Vis Exp. (204), (2024).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Dissection of a frog (Rana sp.). Atlas of animal anatomy and histology. , Springer. Cham. 213-263 (2016).
- O'Rourke, D. P. Amphibians used in research and teaching. ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Effective rapid blood perfusion in Xenopus. J Vis Exp. (195), e65287(2023).
- AVMA guidelines for the euthanasia of animals. 37, 2020 edition, AVMA Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
- Balls, M., Worley, R. S. Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cell line isolated from Xenopus. Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).
- Mason, M., Wang, M., Narins, P. Structure and function of the middle ear apparatus of the aquatic frog, Xenopus laevis. Proc Inst Acoust. 31, 13-21 (2009).
- Holz, P. H., Raidal, S. R. Comparative renal anatomy of exotic species. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).
- Adamson, R. H. Permeability of frog mesenteric capillaries after partial pronase digestion of the endothelial glycocalyx. J Physiol. 428, 1-13 (1990).
- O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio Protoc. 6 (4), e1733(2016).
- Vitt, L. J., Caldwell, J. P. Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetology: An Introductory Biology of Amphibians and Reptiles. , Academic Press. 35-81 (2009).
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