Produzione riproducibile di SPOT come piattaforma di coltura basata su scaffold ad alta produttività

Ruonan Cao; Nancy T. Li; Chantelle B. Shing; Zoe Kutulakos; Cassidy M. Tan; Alison P. McGuigan

doi:10.3791/68405

Articolo metodologico

Produzione riproducibile di SPOT come piattaforma di coltura basata su scaffold ad alta produttività

DOI:

10.3791/68405

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29 luglio 2025

Ruonan Cao^*¹ , Nancy T. Li^*² , Chantelle B. Shing¹ , Zoe Kutulakos³ , Cassidy M. Tan² , Alison P. McGuigan¹^,²

¹Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, ²Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, University of Toronto, ³Division of Engineering Science, University of Toronto

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo documenta la fabbricazione e l'assemblaggio di SPOT, una piattaforma di coltura basata su scaffold ad alta produttività, nei formati da 96 e 384 pozzetti. Descrive inoltre in dettaglio il processo di semina per SPOT, sia manuale che utilizzando un gestore di liquidi disponibile in commercio.

Abstract

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Gli organoidi derivati da pazienti (PDO) stanno diventando sempre più utilizzati nel campo della ricerca sul cancro per modellare i tumori. Combinano i vantaggi dei modelli in vivo e dei modelli in vitro tradizionali, ricapitolando la complessità e l'eterogeneità dei tessuti pur essendo costituiti da cellule umane. L'ascesa di modelli PDO fisiologicamente rappresentativi ha stimolato la necessità di dispositivi che consentano un'analisi diretta del comportamento degli organoidi. Questo protocollo spiega come assemblare e utilizzare la piattaforma supportata da scaffold per tessuti a base di organoidi (SPOT), un dispositivo di coltura di organoidi tridimensionale (3D) ad alta produttività. Questa piattaforma elimina il menisco tipicamente formato da idrogel seminati per consentire un imaging accurato e rapido, simile al processo di imaging per le colture bidimensionali (2D). Di conseguenza, gli organoidi e le co-colture seminate in SPOT possono essere facilmente visualizzati utilizzando la microscopia ad alto rendimento. Progettato per l'uso immediato, SPOT è accessibile ai ricercatori con esperienza di base nella coltura dei tessuti ed è compatibile con i flussi di lavoro di semina manuali e automatizzati. Questo protocollo descrive in dettaglio la fabbricazione di SPOT nei formati a 96 e 384 pozzetti, comprese le istruzioni dettagliate per l'assemblaggio, la semina, il controllo qualità e la risoluzione dei problemi. Sebbene la fabbricazione richieda 3-4 ore, esclusi i tempi di inattività, è possibile produrre più lastre contemporaneamente, migliorando la scalabilità. Semplificando la coltura e l'analisi delle PDO, SPOT fornisce uno strumento robusto per lo screening dei farmaci ad alto rendimento e la ricerca traslazionale sul cancro.

Introduzione

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Nonostante i progressi nella ricerca biomedica, lo sviluppo di saggi in vitro fisiologicamente rilevanti rimane una sfida. Un test ideale dovrebbe adattarsi a una vasta gamma di tipi di cellule, formulazioni di trattamento, tempistiche, strumentazione commerciale e letture analitiche per soddisfare le esigenze dei ricercatori di varie discipline. Tuttavia, a causa della mancanza di strumenti adeguati, i ricercatori si affidano spesso a modelli semplicistici, come i monostrati 2D di linee cellulari immortalizzate, che non riescono a ricapitolare la complessità e la rilevanza clinica, in particolare nella ricerca sul cancro ^1,2. Per affrontare questo problema, la biobanca dei tumori su larga scala e la collaborazione tra i medici hanno guidato lo sviluppo di modelli in vitro ad alta fedeltà come gli organoidi tumorali derivati da pazienti (PDO), che conservano profili genetici e terapeutici più specifici per il paziente rispetto alle linee cellulari ^3,4,5. Nel frattempo, i progressi nell'automazione di laboratorio e nella scoperta di farmaci richiedono piattaforme che si integrino perfettamente nei flussi di lavoro ad alta produttività. Sebbene le piattaforme esistenti affrontino la fedeltà biologica o la scalabilità, poche sono state in grado di risolvere entrambe le sfide contemporaneamente ^6,7,8. Lo sviluppo di modelli automatizzati e ad alto rendimento che replicano le caratteristiche chiave della malattia è fondamentale per far progredire la ricerca biomedica e accelerare la generazione di dati per le applicazioni traslazionali.

Numerosi modelli emergenti mirano ad affrontare le sfide associate alla coltura di tipi cellulari specializzati, come le PDO, con un'elevata produttività (Figura 1). Le piattaforme standard, in cui gli organoidi vengono miscelati con idrogel in piastre da 96 o 384 pozzetti, presentano diverse limitazioni: (i) un elevato volume di cellule-gel porta a un accesso incoerente ai nutrienti, (ii) la curvatura del menisco del pozzetto crea artefatti di imaging e gradienti cellulari, (iii) la semina dell'idrogel manca di uniformità tra i lotti e il personale, (iv) incompatibilità con la fabbricazione automatizzata e la microscopia automatizzata e (v) l'uso di matrice extracellulare (ECM) che è tipicamente un campione di rischi morbido e fragile distruzione a densità tissutali fisiologiche o incorporazione di tipi cellulari contrattili ^1,9. Attualmente, la maggior parte degli studi PDO basati su piastra sono condotti seminando manualmente il gel cellulare nella piastra^10,11 o con un metodo di sovrapposizione di gel, in cui l'idrogel viene diluito con un mezzo meno viscoso e le cellule vengono centrifugate sul fondo del pozzetto per posizionarle nel piano ottico appropriato ^12,13. Entrambi gli approcci non riescono a fornire un supporto meccanico per la cultura a lungo termine. Sulla base delle nostre precedenti osservazioni (dati non pubblicati), l'idrogel commerciale mescolato con le cellule nelle piastre standard dei pozzetti si contrae dalle superfici del pozzetto per 9 pozzetti su 12 nell'arco di 12 giorni, mentre il metodo gel-overlay manca di interazioni fisiologiche cellula-matrice. Inoltre, le colture risultanti non possono essere mantenute per lunghi periodi a causa delle limitazioni di spazio all'interno del pozzetto e sono incompatibili con i saggi che richiedono un elevato rapporto reagente/mezzo cellulare 14,15,16. Queste barriere pratiche ostacolano l'adozione di modelli 3D e limitano la riproducibilità sperimentale sul campo.

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Figura 1: Valutazione dei modelli colturali basati sulla scalabilità e sulla rilevanza biologica. Il posizionamento relativo di vari sistemi di coltura in vitro e in vivo lungo la scalabilità (asse y), definita dalla produttività su piastra, e la rilevanza biologica (asse x), evidenziando i compromessi tra potenziale di rendimento e fedeltà fisiologica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Motivati da queste sfide, l'elevata porosità e il rinforzo meccanico di un sottile scaffold in cellulosa sono stati sfruttati per sviluppare la piattaforma supportata da scaffold per tessuti a base di organoidi (SPOT), disponibile in entrambi i formati a 96 e 384 pozzetti. SPOT incorpora uno scaffold polimerico pre-modellato utilizzando un metodo di infiltrazione¹⁷ precedentemente sviluppato che corrisponde al layout della piastra, consentendo un posizionamento preciso delle goccioline di cellule-gel e fornendo supporto strutturale per la fase di idrogel (Figura 2A). L'assorbimento capillare nell'impalcatura guida la soluzione cellula-gel, formando una rete di biocompositi forzata meccanicamente (Figura 2B). A causa della struttura porosa dell'impalcatura, il cell-gel si infiltra e forma uno strato sottile (circa 70 μm di spessore), richiedendo una quantità dieci volte inferiore di cellule-gel per coprire il fondo del pozzetto¹⁴. La compatibilità di SPOT con i PDO dell'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è stata dimostrata anche valutando la loro crescita utilizzando saggi metabolici e misurazioni basate su immagini. Sin dal suo sviluppo, SPOT ha dimostrato una notevole versatilità e usabilità per i ricercatori impegnati nella coltura di organoidi. Inoltre, il design di SPOT offre una scalabilità di facile utilizzo, con volumi di reagenti ridotti e capacità di imaging migliorate grazie alla sua geometria in microgel piatta e priva di menisco, garantendo una penetrazione uniforme della luce e un imaging accurato ad alto contenuto¹⁴ (Figura 2C, D). SPOT supporta anche la co-coltura con altri tipi di cellule rilevanti, come i fibroblasti, per ricapitolare meglio il microambiente tumorale¹⁸.

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Figura 2: Panoramica del dispositivo 96-SPOT e del flusso di lavoro di analisi delle immagini. (A) Rappresentazione schematica della fabbricazione di piastre SPOT: il dispositivo viene assemblato raccogliendo una piastra commerciale a pozzetti senza fondo (in alto), un'impalcatura con motivo in PMMA (mostrata in blu) e una pellicola in policarbonato (in basso) utilizzando strati di adesivo poliacrilico biadesivo (mostrato in giallo). (B) Semina cellulare in un pozzetto di scafffold: le cellule vengono sospese in un idrogel non polimerizzato (mostrato in rosa) e pipettate in ciascun pozzetto dove si infiltrano nello scaffold. L'idrogel viene quindi lasciato gelificare per incapsulare le cellule all'interno dell'idrogel supportato da scaffold. (C) Microscopia: il microtessuto risultante può essere visualizzato utilizzando la microscopia automatizzata a campo largo. (D) Analisi basata su immagini: le immagini acquisite di cellule fluorescenti (verdi) sospese in gel possono essere analizzate utilizzando pipeline standard di analisi delle immagini. Immagine rappresentativa al microscopio a epifluorescenza di cellule KP4 che esprimono GFP in un pozzetto 96-SPOT. La barra della scala è di 500 μm. Questa cifra è stata modificata da¹⁴. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Un altro vantaggio di SPOT è che il sistema può essere integrato con un gestore di liquidi open source, facilitando la fabbricazione automatizzata e riproducibile di colture DOP. Questo progresso riduce la variabilità dell'utente e supporta disegni sperimentali complessi, tra cui lo screening dei farmaci ad alto rendimento e gli approcci di medicina personalizzata¹⁸. In precedenza, SPOT si era anche dimostrato compatibile con la caratterizzazione multiplexata basata su singole cellule di fenotipi cellulari in ambienti tumorali eterogenei e con il recupero delle cellule su richiesta da SPOT mediante digestione¹⁸. Queste caratteristiche posizionano SPOT come uno strumento versatile per le applicazioni di screening, in cui i dati longitudinali ad alta risoluzione sono essenziali per valutare l'efficacia dei farmaci e il comportamento cellulare in condizioni fisiologicamente rilevanti^14,18. Combinando queste innovazioni tecniche, SPOT affronta i limiti critici dei tradizionali sistemi di coltura 3D.

Questo protocollo fornisce una guida completa per la fabbricazione di componenti SPOT, l'assemblaggio di piastre e i metodi di semina per colture di organoidi 3D robuste e riproducibili. Include istruzioni dettagliate per la semina manuale su piastra utilizzando una micropipetta e flussi di lavoro di semina automatizzati con un gestore di liquidi, che supporta sia il formato a 96 che a 384 pozzetti. Inoltre, questo protocollo delinea le misure essenziali di controllo della qualità, come la verifica della distribuzione uniforme del gel e dell'integrità dello scaffold, per mantenere elevati standard sperimentali. Vengono inoltre fornite strategie di risoluzione dei problemi per affrontare problemi comuni, come l'infiltrazione incompleta di gel, l'evaporazione durante la semina e il distacco dell'impalcatura, fornendo ai ricercatori soluzioni pratiche per ottimizzare i loro flussi di lavoro e ottenere risultati affidabili.

SPOT è progettato per colmare le lacune che i saggi tradizionali degli organoidi devono affrontare, comprese le sfide relative all'esecuzione dei saggi e al cambio dei terreni, preservando l'integrità del gel 10,11,12,13. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di produrre una piattaforma supportata da scaffold che supporti la coltura di organoidi per un periodo di 12 giorni. Inoltre, questo metodo copre anche la generazione di array di tessuti in SPOT attraverso la semina manuale o assistita dal gestore di liquidi per consentire agli utenti di eseguire qualsiasi perturbazione a valle, compresi i saggi IC50 dei farmaci e lo screening di piccole molecole.

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Protocollo

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In questo protocollo, sono stati utilizzati come esempio organoidi di adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC). Questi organoidi sono stati ottenuti da pazienti con PDAC, acquistati dalla UHN Biobank presso il Princess Margaret Cancer Centre (identificatore PMLB PPTO.46 dalla University Health Network, Canada) secondo un protocollo in conformità con le linee guida del Research Ethics Board dell'Università di Toronto (protocollo #36107). Si prega di consultare tutti i materiali, i reagenti e le attrezzature necessarie nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione della soluzione PMMA-acetone (tempistica: 20 min + ~8-16 h inattivo)

NOTA: La soluzione di polimetilmetacrilato (PMMA)-acetone viene utilizzata in SPOT per delineare i pozzetti e prevenire le perdite tra i pozzetti. La procedura generale consiste nello sciogliere il PMMA solido in acetone. In precedenza, la soluzione di PMMA-acetone veniva utilizzata per modellare un'impalcatura di carta simile per bloccare lo scambio di terreni e gas per ottenere l'ipossia in un diverso modello di coltura 3D¹⁷. Qui, la formula PMMA-acetone è adattata per generare scaffold infiltrati in PMMA per la fabbricazione SPOT.

In una provetta da centrifuga conica da 50 ml etichettata, aggiungere 1,75 g di polvere di PMMA. Quindi, in una cappa aspirante, aggiungere 7,84 ml di acetone e chiudere bene la provetta per evitare l'evaporazione del solvente.
Se è necessaria la visualizzazione del modello polimerico, aggiungere 5-10 gocce di smalto nella soluzione. Chiudere bene la provetta da centrifuga. Agitare manualmente il tubo per iniziare a mescolare lo smalto con la soluzione di PMMA-acetone.
NOTA: Per essere coerenti tra più lotti di tracciatura, diluire una quantità nota di smalto per unghie in acetone, quindi pipettare questa soluzione come 7,84 ml di acetone.
Posizionare la soluzione di PMMA-acetone sul miscelatore a vortice per una notte per assicurarsi che la soluzione si dissolva. Conservare la soluzione di PMMA-acetone a 4 °C per un massimo di 2 settimane, se non aperta.

2. Realizzazione di scaffold infiltrati in PMMA

(Temporizzazione: per la modellazione a 96 punti: 15 minuti di configurazione + 6 minuti per ponteggio; per la modellazione a 384 punti: 15 minuti di configurazione + 10 minuti per ponteggio)

NOTA: La realizzazione di scaffold infiltrati in PMMA per 96-/384-SPOT viene eseguita esclusivamente su un banco di lavoro (ambiente non sterile). Per realizzare scaffold 96/384-SPOT, assicurarsi che sia stato installato il rispettivo software del plotter di editing grafico o la libreria di controllo del plotter vettoriale.Si prega di notare che alcune sottosezioni della procedura si applicano sia al 96-SPOT che al 384-SPOT, mentre altre sono specifiche per una dimensione di lastra. In quest'ultimo caso, verranno presentate le opzioni A (per 96-SPOT) e B (per 384-SPOT). Per il modello (A) 96-SPOT, ci sono tre strati; in primo luogo, le linee di adescamento stabiliscono un flusso costante della soluzione PMMA-acetone; secondo, la schiera di 96 cerchi; infine, un modello di venditore viaggiante (TSP) traccia gli spazi tra i pozzetti. Per il modello (B) 384-SPOT, il primo modulo contiene linee di adescamento; in secondo luogo, il bordo che circonda la piastra del pozzo; Infine, viene tracciata una griglia in modo tale che rimangano 384 regioni. Per entrambi i modelli, le dimensioni dei pozzetti possono essere controllate alterando il codice sorgente, come dimostrato da Li et ^al.14.

Predisposizione per il processo di infiltrazione dello scaffold
1. Lasciare agitare la soluzione di PMMA acetone (conservata a 4 °C) per 10 minuti a temperatura ambiente. Lasciare il supporto del tubo fino all'inizio della tracciatura.
2. Collegare il plotter all'alimentazione utilizzando il cavo di alimentazione. Una luce verde lampeggiante indica che il dispositivo è acceso. Collegare il cavo USB del plotter al computer designato per la stampa.
3. Copri il cavalletto a clip con un pezzo di carta da forno. Assicurarsi che l'intera superficie del cavalletto sia coperta.
  1. Per guidare la stampa dei modelli 96-/384-SPOT, preparare un modello 96-/384-SPOT su un foglio di carta per stampante. Eseguire i passaggi 2.2-2.3 utilizzando una penna invece di una siringa e la carta per stampante al posto della carta da forno e del filtro per il tè. Una volta che il modello è pronto, posizionalo sul cavalletto a clip e coprilo con carta da forno. Procedere al passaggio 2.2 e seguire il protocollo per realizzare scaffold 96-/384-SPOT.
4. Fissare la carta da forno al cavalletto utilizzando le clip per raccoglitore (Figura 3A). Prendi un foglio di impalcatura (cioè carta da filtro per il tè) e taglia lungo i lati dove i due strati sono fusi insieme (Figura 3B).
5. Posizionare il filtro per il tè tagliato - chiamato impalcatura di carta - sul cavalletto a clip, con il lato liscio (lato esterno del filtro per il tè) rivolto verso l'alto. Bloccalo su tre lati . Assicurarsi che l'impalcatura di carta sia completamente appiattita sul cavalletto a clip; Non devono esserci pieghe nell'area di tracciamento.
Tracciatura del modello 96/384-SPOT
1. Per configurare il software del plotter e il file per 96-SPOT, seguire l'opzione 2.2.2; per configurare il software e il file per 384-SPOT, seguire l'opzione 2.2.3.
2. Configurazione del software del plotter e del file di plotting 96-SPOT
  1. Nell'app software, apri il file SVG per 96-SPOT (File supplementare 1; Figura 4A). Sulla barra dei menu, passare a Estensioni > controllo plotter (Figura 4B).
  2. Quando viene visualizzata la nuova finestra, regolare le impostazioni in modo che corrispondano alla Figura 1 supplementare. Tornare alla scheda Stampa della finestra Estensione controllo plotter. Lascia questo aperto per dopo.
3. Impostazione dell'API della libreria di controllo del plotter vettoriale e del file di tracciatura 384-SPOT
  1. Apri la finestra del prompt dei comandi (Windows) o Terminale (Mac). Immettere il comando per avviare il notebook di elaborazione interattivo designato. Assicurarsi che il blocco appunti si apra in un browser.
  2. Selezionare il file del codice 384-SPOT (File supplementare 2) da aprire. Utilizzando un puntale da 20 G (o un puntale da 16 G per il modello 384-SPOT), aspirare 1 mL di soluzione di PMMA-acetone con la siringa da 3 mL (Figura 3C).
    NOTA: La valvola di controllo del flusso tra la siringa di caricamento da 10 ml e il tubo EVA deve essere aperta (parallela al cilindro). Poiché il processo di infiltrazione è guidato dalla gravità, assicurarsi che la siringa di tracciamento da 3 mL sia sempre riempita tra la marcatura di 0,5-1,5 mL per mantenere un volume di erogazione costante durante il plottaggio.
4. Mentre la punta della siringa da 3 mL è ancora all'interno della soluzione PMMA-acetone, chiudere la valvola di controllo del flusso tra la siringa di carico da 10 mL e il tubo in EVA (portarla perpendicolarmente al cilindro).
5. Chiudere rapidamente il tubo della soluzione di PMMA-acetone. Caricare la siringa da 3 ml sul portapenne. Regolare l'altezza della siringa rispetto al supporto per ottenere il seguente allineamento (Figura 3D).
6. Regolare la posizione del cavalletto a clip in modo che la punta della siringa da 3 ml poggi all'origine del modello tracciato (cioè il punto scuro in alto a sinistra del modello di modello). Sollevare il portapenne del plotter con la siringa attaccata ad esso, per far scorrere il cavalletto a clip sotto.
7. Scollegare rapidamente la siringa da 10 ml dal tubo per consentire alla pressione atmosferica di esercitare pressione sulla soluzione di PMMA e acetone conservata nella siringa di tracciatura da 3 ml. Aprire la valvola di controllo del flusso.
8. Per iniziare a tracciare il modello 96-SPOT, seguire i passaggi 2.2.9; per iniziare a tracciare 384-SPOT, seguire il passaggio 2.2.10.
9. Avviare il plottaggio di 96-SPOT nel plotter designato come descritto di seguito.
  1. Nel software, fare clic su Applica in Estensioni di controllo plotter. Il plotter inizierà ora a funzionare, tracciando il modello PMMA. Non sono necessarie ulteriori azioni fino al termine della stampa e il portapenne del plotter ritorna nella posizione iniziale.
  2. Per mettere in pausa il plotter durante la stampa, premere il piccolo pulsante argentato sul lato sinistro del plotter. Quindi, attraverso le estensioni di controllo del plotter > la scheda Riprendi nel software di grafica, scegliere di riprendere la stampa dal punto in cui si era interrotta o di riportare il portapenne nella posizione iniziale (Figura supplementare 1C(iii)).
10. Avviare il tracciamento di 384-SPOT nell'interfaccia di calcolo designata come descritto di seguito.
  1. Nell'interfaccia, fare clic su Riavvia kernel ed esegui nuovamente (doppia freccia sulla barra degli strumenti). Il codice inizierà ora a essere eseguito, tracciando il modello PMMA. Non sono necessarie ulteriori azioni fino a quando il modello non ha terminato la stampa e il portapenne ritorna alla sua posizione iniziale.
  2. Per mettere in pausa il plotter durante la stampa, premere il pulsante Small Silver sul lato sinistro del plotter. Spostare manualmente la testina di stampa completamente indietro e verso sinistra in modo che raggiunga la posizione iniziale. Ricollegare il plotter all'alimentazione. A differenza del tracciato 96-SPOT, non c'è modo di riprendere il plottaggio per 384-SPOT da dove era stato messo in pausa; Sostituisci l'impalcatura di carta e inizia il codice dall'inizio.
Scarico della siringa e pulizia
1. Una volta terminata la tracciatura, ricollegare la siringa da 10 ml al tubo. Rimuovere la siringa da 3 ml dal portapenne del plotter e trasferire l'eventuale soluzione di PMMA-acetone rimanente nel flaconcino di riserva o gettarla se si è verificata un'evaporazione significativa durante i passaggi precedenti.
2. Lavare il cilindro della siringa da 3 ml pipettandolo con acetone. Lasciare asciugare il sistema di tubi della siringa all'aria prima di rimetterlo nel luogo di conservazione.
3. Sganciare con cautela l'impalcatura SPOT dal cavalletto a clip.
4. Ispezionare gli scaffold SPOT tracciati per assicurarsi che possano essere utilizzati per esperimenti (Figura 3E, F). Per indicazioni, fare riferimento alla Tabella 1 per la risoluzione dei problemi e alla Tabella 2 e alla Tabella 3 per la garanzia e il controllo della qualità.
5. Conserva tutte le impalcature con motivo PMMA in un sacchetto con chiusura a zip in un luogo fresco e asciutto.

3. Taglio del nastro a 96/384 pozzetti

(Temporizzazione: per il modello 96-SPOT: 15 minuti per 5 pezzi di nastro; per il modello 384-SPOT: 30 minuti per 5 pezzi di nastro)

NOTA: Questo è uno dei modi più efficienti per tagliare i nastri in modo preciso ed efficiente, in particolare per i modelli di nastro a 384 pozzetti. Questo metodo offre anche la possibilità di incidere al laser uno strato di nastro (plastica del coperchio superiore) per migliorare l'usabilità durante il processo di assemblaggio. In alternativa, i nastri possono anche essere tagliati utilizzando taglierine a una velocità inferiore senza il processo di incisione.

Aprire il file di taglio laser del modello di nastro a 96/384 pozzetti (File supplementare 3, File supplementare 4) e caricare il modello di stampa codificato con tre colori diversi nel software di taglio laser facendo clic su Stampa con le seguenti impostazioni nella Figura 2A supplementare.
Caricare un pezzo di nastro adesivo sulla superficie della taglierina laser e assicurarsi che il nastro sia appiattito uniformemente sulla superficie. Utilizzare nastri di carta o pesi pesanti per tenere premuti i nastri durante il taglio.
NOTA: Assicurarsi che il nastro sia piatto sulla superficie della taglierina laser. Qualsiasi urto potrebbe influire sulla qualità dei nastri tagliati, in particolare dei nastri a 384 pozzetti.
Regolare la posizione del motivo di stampa in modo che si allinei con la posizione del nastro in base al manuale della taglierina laser.
Tagliare entrambi i nastri a 96/384 pozzetti utilizzando la stessa impostazione della taglierina laser, come mostrato nella Figura 2B supplementare. L'ordine delle linee con colori specifici è importante. Taglia la linea rossa prima della linea verde. Taglia il blu alla fine.
Linea rossa: modalità Rast/Vest con potenza laser del 45%, velocità dell'80%, 1000 PPI e asse Z di 0,50 mm.
Linea verde: modalità Rast/Vest con 7% di potenza laser, 100% di velocità, 1000 PPI e asse Z di 0,50 mm.
Linea blu: modalità Rast/Vest con il 50% di potenza laser, l'80% di velocità, 1000 PPI e 0,50 mm di asse Z.
Conservare correttamente i nastri modellati fino all'assemblaggio SPOT.

4. Montaggio 96/384-SPOT (Temporizzazione: 1 h)

NOTA: Questa sezione descrive in dettaglio la procedura per l'assemblaggio dei dispositivi 96-/384-SPOT in un ambiente sterile come una cabina di biosicurezza (BSC). In alternativa, i dispositivi 96-/384-SPOT possono essere preassemblati in un ambiente non sterile e quindi sterilizzati tramite processo di sterilizzazione con gas etilene.

Preparazione del ponteggio SPOT per il montaggio
1. Prendi un'impalcatura con motivo PMMA per 96 o 384 punti. Taglia la carta in eccesso attorno alla regione blu dell'impalcatura. Lasciare 5 mm di spazio bianco attorno al perimetro della regione blu. Il foglio risultante sarà di circa 760 mm x 1300 mm.
  NOTA: Non tagliare la linea di adescamento. È utile per determinare quale lato dell'impalcatura è ruvido/liscio (Figura 3E, F).
2. Per preparare un'impalcatura 96-SPOT per il montaggio, seguire il passaggio 4.1.3. Per preparare uno scaffold 384-SPOT, seguire il passaggio 4.1.4.
3. Eseguire la perforazione degli spazi tra i pozzetti sul ponteggio 96-SPOT.
  1. Stendere un pezzo di pellicola di polietilene (1000 mm x 1500 mm) su un supporto acrilico rigido (2700 mm x 2700 mm). Posizionare il supporto rivestito con pellicola di polietilene sul piano di lavoro e posare l'impalcatura sopra la pellicola di polietilene (Figura 5A).
  2. Allineare un bordo del righello tra le prime due righe in modo che il tracciato lungo questo bordo non si tracci in un pozzetto.
  3. Posizionare la ruota di tracciamento contro il righello nella parte inferiore dell'impalcatura. Far rotolare la rotella di inseguimento verso l'alto fino alla sommità dell'impalcatura, utilizzando il righello per guidare il percorso della lama. Ripetere l'operazione per tutti gli spazi tra le file sull'impalcatura (ad esempio, 7x).
  4. Ripetere i passaggi 4.1.3.2 e 4.1.3.3 per ogni altro spazio tra colonne, iniziando dallo spazio tra le prime due colonne.
4. Non eseguire alcuna perforazione degli spazi tra i pozzetti sullo scaffold 384-SPOT seguendo i passaggi seguenti.
  1. Non perforare gli spazi tra i pozzetti del ponteggio 384-SPOT. Procedere direttamente al passaggio 4.2.
Sterilizzazione di materiali SPOT e attrezzature di assemblaggio
1. Posizionare l'impalcatura stampata, due nastri da 96 pozzetti (o nastri da 384 pozzetti), la piastra senza fondo da 96 pozzetti (o la piastra senza fondo da 384 pozzetti), il coperchio della piastra da 96 pozzetti (o il coperchio della piastra da 384 pozzetti), la pellicola in policarbonato, la lastra di polidimetilsilossano (PDMS), il sacchetto di plastica richiudibile, le pinzette e il coltello di precisione nel BSC, UV per 20 minuti su un lato (Figura 5B).
2. Capovolgere tutti i materiali e le attrezzature di montaggio sull'altro lato e UV per altri 20 minuti.
Fissaggio dello scaffold al primo nastro da 96/384 pozzetti
1. Posare l'impalcatura con il lato ruvido rivolto verso l'alto (Figura 3F) sulla soletta PDMS, in modo che le file scorrano orizzontalmente. Utilizzare la linea di adescamento per determinare quale lato è ruvido (la linea di adescamento allineata a destra indica il lato ruvido rivolto verso l'alto).
2. Lisciare l'impalcatura sulla soletta PDMS in modo che non vi siano pieghe o bolle sopra (o sotto) l'impalcatura. Rimuovere lo strato protettivo dal lato non inciso del nastro biadesivo. Allacciare leggermente la parte centrale del nastro e allineare le due colonne centrali del nastro con l'impalcatura.
3. Una volta allineato, premere il centro del nastro verso il basso. Stendere il nastro sull'impalcatura, partendo dal centro e spostandosi verso l'esterno.
  NOTA: Un'impalcatura allineata in modo errato avrà un evidente modello di PMMA che si sovrappone alla regione di semina del pozzo.
4. Utilizzare le pinzette per rimuovere con cura l'impalcatura dalla soletta PDMS e conservare la lastra per future fabbricazioni.
Fissaggio dello scaffold al secondo nastro da 96/384 pozzetti
1. Posizionare l'impalcatura sul banco di lavoro. Capovolgere l'impalcatura in modo che il lato liscio (lato non nastrato) sia rivolto verso l'alto.
2. Rimuovere lo strato protettivo centrale dal lato inciso del secondo nastro. Assicurarsi che le due colonne centrali del nastro siano esposte. Se si utilizza il design del nastro non inciso, rimuovere completamente lo strato protettivo da un lato.
3. Allacciare leggermente la parte centrale del nastro e allineare le due colonne centrali del nastro con l'impalcatura.
4. Una volta che il nastro è allineato all'impalcatura, premere il centro del nastro verso il basso. Se si utilizza il design del nastro inciso, rimuovere gli altri due strati protettivi adiacenti alla sezione centrale esposta del nastro. Stendere il nastro sull'impalcatura, partendo dal centro e spostandosi verso l'esterno.
Fissaggio dell'impalcatura alla piastra senza fondo
1. Rimuovere lo strato protettivo del nastro dal lato ruvido dell'impalcatura. Se si utilizza il design del nastro inciso, rimuovere solo lo strato protettivo intermedio.
2. Allineare l'impalcatura alla parte inferiore della piastra senza fondo (con un coperchio). Una volta allineato, premere il centro dell'impalcatura sul lato inferiore della piastra. Se si utilizza il disegno inciso, rimuovere gli strati protettivi adiacenti al centro esposto. Lisciare l'impalcatura sulla piastra dal centro verso l'esterno.
Fissaggio del ponteggio al film in policarbonato
1. Utilizzando una pinzetta, allentare con cura lo strato protettivo della pellicola in policarbonato. Una volta sciolto, staccare lentamente lo strato protettivo dalla pellicola. Non creare rientranze nella pellicola, poiché ciò influirà sulle sue proprietà ottiche per l'imaging al microscopio.
2. Ripetere il passaggio 4.6.1 con l'altro lato della pellicola in policarbonato. Una volta rimossi entrambi gli strati protettivi, mettere da parte la pellicola sul banco di lavoro.
3. Rimuovere lo strato protettivo dal nastro attaccato al fondo della piastra. Premere il film di policarbonato sull'impalcatura, partendo dal centro verso l'esterno.
4. Premere con decisione la pellicola di policarbonato sul fondo della piastra in modo che tutti i pozzetti ottengano un bordo ben pronunciato.
5. Utilizzando un coltello di precisione, tagliare con cura il materiale in eccesso dal fondo della piastra.
  NOTA: Prestare particolare attenzione a non tagliare la piastra o nessuno dei pozzetti. Se il coltello non taglia facilmente, controlla se sta tagliando la piastra.
Stoccaggio del 96/384-SPOT dopo il montaggio
1. Dopo aver assemblato completamente 96-SPOT, mettilo in un sacchetto di plastica trasparente richiudibile. Porta la borsa fuori dalla BSC.
2. Posizionare un supporto acrilico rigido sul lato inferiore della piastra. Fissare il supporto acrilico alla piastra sugli angoli opposti (Figura 5C). Tenere clamped per almeno 30 minuti su ogni angolo prima dell'uso.
3. Conservare la piastra in un luogo pulito e asciutto fino al momento dell'uso.

5. 96/384-SPOT seeding (Durata: 2 h 45 min)

NOTA: Questa sezione descrive in dettaglio la procedura per la semina dei dispositivi 96-/384-SPOT per creare microtessuti 3D uniformi. Il processo di semina prevede un'attenta erogazione di un volume definito di gel cellulare (ad esempio, 5 μL per 96-SPOT o 2 μL per 384-SPOT) sullo scaffold SPOT preassemblato. Per garantire un'infiltrazione e una distribuzione uniformi del gel, la gocciolina di gel cellulare viene guidata lungo la struttura porosa dell'impalcatura attraverso l'assorbimento capillare. Questo passaggio può essere eseguito manualmente utilizzando una micropipetta o automatizzato con la manipolazione dei liquidi. Dopo la semina, le piastre vengono incubate a 37 °C per consentire la polimerizzazione su gel e l'incapsulamento cellulare.

Preparazione della piastra 96/384-SPOT
1. Sganciare 96-/384-SPOT e rimuovere il supporto acrilico dal fondo.
2. In un BSC, rimuovere SPOT dal sacchetto di plastica. Accendi l'UV per sterilizzare l'interno della piastra e coprire per 20 minuti prima di chiudere il coperchio e capovolgere la piastra sul fondo della piastra per altri 20 minuti di trattamento UV.
3. Pipettare 70 μl di PBS in ogni spazio tra i pozzetti della piastra 96-SPOT. Non pipettare PBS nella piastra 384-SPOT. Raffreddare la piastra a 4 °C per almeno 30 minuti prima della semina.
Preparazione delle cellule
1. Staccare le cellule dai palloni di coltura o gli organoidi dalle cupole di gel in base alla manipolazione consigliata e contare la quantità di cellule utilizzando l'emocitometro secondo le istruzioni del produttore. Annotare la densità cellulare della sospensione cellulare (cioè il numero di cellule per mL) per calcolare il volume di sospensione cellulare richiesto per i passaggi 5.4.1-5.4.2 in base alla densità di semina desiderata.
Preparazione del gel
1. Seguendo le istruzioni per la preparazione dell'idrogel ottimizzate in precedenza 17,19,20,21, creare l'idrogel dispensando 1 mL di collagene bovino di tipo 1 da 3 mg/mL in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
  NOTA: I componenti e la miscela risultante devono essere mantenuti in ghiaccio per tutta la durata della preparazione.
2. Erogare 125 μl di terreno essenziale minimo (MEM) concentrato 10x nel collagene bovino. Pipettare lentamente su e giù per mescolare fino a quando la miscela non passa dal rosa al giallo.
3. Erogare 8 μl di bicarbonato di sodio 0,8 M nella miscela di collagene bovino. Pipettare lentamente su e giù per mescolare fino a quando il composto diventa rosa pallido. Utilizzare la soluzione miscelata entro 30 minuti dalla preparazione per garantire una gelificazione uniforme in più esperimenti.
  NOTA: Se la miscela rimane gialla, titolare la soluzione a pH 7 aggiungendo 0,8 M in aliquote da 0,5 μl fino a ottenere un colore rosa pallido. OPZIONALE: Seguendo la stessa procedura, il gel può essere preparato per colture che richiedono una maggiore concentrazione di collagene. Per la coltura di organoidi, utilizzare la miscela di idrogel caratterizzata da Landon-Brace et ^al.17.
Sospensione di cellule in gel
1. Erogare il volume di sospensione cellulare necessario per la densità del gel cellulare target in una provetta da microcentrifuga e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
2. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in gel (il volume varia in base alla concentrazione target)
Semina manuale della piastra 96-/384-SPOT
1. Posizionare la piastra 96-/384-SPOT su un impacco di ghiaccio congelato. Per seminare 96-SPOT, segui i passaggi 5.5.2. Per seminare 384-SPOT, segui i passaggi 5.5.3.
2. Semina manuale 96-SPOT
  1. Pre-rivestire un puntale per pipetta da 10 μl con la miscela di gel cellulare. Aspirare 5 μl di gel utilizzando una pipetta da 20 μl ed espellere fino al primo arresto fino a formare una gocciolina sulla punta. Tocca la goccia al centro di un pozzo.
    NOTA: L'espulsione del gel premendo la pipetta fino al secondo arresto può introdurre bolle d'aria. Tutti i pozzetti devono essere seminati entro 5 minuti per una gelificazione costante tra i pozzetti.
  2. Dopo aver seminato tutti i pozzetti desiderati, coprire la piastra e incubare a 37 °C per 45 minuti secondo le istruzioni del produttore per polimerizzare il gel. Erogare 200 μL di terreno in ciascun pozzetto seminato e incubare per almeno 1 ora ininterrotta prima di qualsiasi imaging o perturbazione richiesta.
3. Semina manuale 384-SPOT
  1. Pre-rivestire un puntale per pipetta da 10 μl con la miscela di gel cellulare. Aspirare 2 μl di gel utilizzando una pipetta da 10 μl ed espellere fino al primo arresto fino a formare una gocciolina sulla punta.
    NOTA: Si consiglia vivamente di utilizzare una pipetta multicanale da 10 μl.
  2. Tocca la goccia al centro di un pozzo. Dopo aver seminato tutti i pozzetti desiderati, coprire la piastra e incubare a 37 °C per 45 minuti secondo le istruzioni del produttore per polimerizzare il gel.
  3. Erogare 60 μL di terreno in ciascun pozzetto seminato e incubare per almeno 1 ora ininterrottamente prima di qualsiasi imaging o perturbazione richiesta.
4. Semina 96/384-SPOT con un manipolatore di liquidi
  1. Durante la preparazione della miscela di gel cellulare, accendere il gestore del liquido e il relativo modulo filtro HEPA al massimo. Spruzzare con cura etanolo al 70% all'interno del dissipatore di liquidi e pulirlo con salviette di carta imbevute di etanolo.
  2. Caricare il protocollo di semina 96-SPOT o 384-SPOT (File supplementare 5 o File supplementare 6) prima di eseguire la calibrazione della testa della pipetta. Installare i moduli di temperatura negli slot 1 e 4 (Figura 6A).
  3. Ai fini della calibrazione, utilizzare le apposite scatole di puntali dei filtri P20 e P200. Caricarli rispettivamente negli slot 5 e 6 (Figura 6B). Calibrare la testa della pipetta in base alle istruzioni visualizzate sul software. Dopo la calibrazione, passare alla scatola sterile dei puntali con filtro P20 e P200 per la semina sulle fessure 5 e 6. Rispruzzare la superficie con etanolo al 70% e chiudere lo sportello fino alla semina.
    NOTA: È essenziale calibrare accuratamente le punte sulla parte superiore della piastra 96-/384-SPOT. Si consiglia di utilizzare del nastro sigillante per piastre per facilitare la visualizzazione dell'asse z delle punte rispetto alla parte superiore della piastra. La posizione ideale è quando le punte sulla testa multicanale toccano tutte il nastro sigillante per lastre e creano una piccola ammaccatura.
5. Accendere entrambi i moduli di temperatura e impostarli a 4 °C mentre le celle sono nell'ultima fase di rotazione durante la preparazione della miscela di cellule-gel. Dopo aver completato il passaggio 5.4, caricare la quantità desiderata di miscela di gel cellulare in ciascuna provetta delle provette PCR da 8 strisce da 0,2 mL all'interno del BSC.
  NOTA: Il volume minimo di miscela cellula-gel da caricare in ciascuna provetta è: 96-SPOT: 5 μL moltiplicato per il numero di colonne che dovevano essere seminate più il volume morto; 384-SPOT: 2 volte 2 μL moltiplicato per il numero di colonne che dovevano essere seminate per volte e poi più il volume morto. Si consiglia che il volume morto sia di circa 10 - 20 μl per provetta per evitare bolle e colonne incomplete verso la fine.
6. Chiudere le provette PCR da 8 strisce da 0,2 mL utilizzando i tappi piatti a 8 strisce prima di trasferire la miscela di gel cellulare fuori dal BSC con ghiaccio.
7. Caricare la piastra SPOT pre-raffreddata sul modulo di temperatura nello slot 4 con il blocco di formato della piastra a fondo piatto (Figura 6B).
8. Caricare le provette PCR da 8 strisce da 0,2 mL con la miscela di gel cellulare sul modulo di temperatura nello slot 3 con il blocco di formato a 96 pozzetti.
9. Aprire i tappi piatti e il coperchio della piastra SPOT e riporli all'interno del dispositivo di movimentazione dei liquidi, ma lontano dalle fessure utilizzate. Aprire il coperchio della scatola dell'ugello del filtro P20 e P200.
10. Eseguire il protocollo. Dopo aver seminato tutti i pozzetti desiderati, coprire la piastra e incubare a 37 °C per 45 minuti secondo le istruzioni del produttore per polimerizzare il gel.
11. Erogare 200 μl o 60 μl (96-/384-SPOT) di terreno in ciascun pozzetto seminato e incubare per almeno 1 ora ininterrottamente prima di qualsiasi imaging o perturbazione richiesta.

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Risultati

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Il modello in PMMA dell'impalcatura di carta funge da barriera fisica per impedire lo scambio di contenuti tra i pozzi. Questo design è fondamentale per garantire che i pozzetti adiacenti rimangano chimicamente e biologicamente isolati, impedendo la diffusione involontaria di terreni, farmaci, fattori secreti o persino cellule¹⁴. L'incorporazione del PMMA consente una compartimentazione precisa, rendendo SPOT una piattaforma affidabile per lo screening ad alto rendimento e gli studi di co-coltura ...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo protocollo, viene fornita una guida dettagliata per la fabbricazione e l'uso di SPOT a 96 e 384 pozzetti, che copre l'assemblaggio, la semina manuale e assistita da gel cellulare con gestore di liquidi. A differenza dei tradizionali sistemi di tappi in idrogel, SPOT elimina gli artefatti correlati al menisco, facilitando l'imaging non distruttivo in situ degli organoidi come descritto in precedenza 14,16,22.

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano Jennifer Lam per l'acquisizione delle immagini. La Figura 1, la Figura 2 e la Figura 7A sono state create con BioRender.com. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione Discovery del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (sovvenzione #RGPIN-2021-03488) all'APM; il programma Canada First Research Excellence (CFREF) Medicine by Design Grand Questions all'APM; le borse di studio per laureati NSERC Canada - Programma di dottorato a R.C.; il Peterborough K.M. Hunter Charitable Foundation Award a R.C.; la borsa di studio CRAFT del Consiglio Nazionale delle Ricerche (NRC) assegnata a N.T.L.; il NSERC CREA TOeP a N.T.L.; il premio NSERC per la ricerca degli studenti universitari a Z. K.; e il premio di eccellenza dell'Università di Toronto a C.M.T.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette PCR da 0,2 ml (strisce da 8)	Sarstedt	72.985.002
Provetta da centrifuga da 1,5 ml	FroggaBio	LMCT1.7B
1000-μ L puntali per pipette	Eclissi	4-1019-260-000
Pipette sierologiche da 10 mL	FroggaBio	394010
Siringa da 10 ml	BD, Canada	302995
10x Medium essenziale minimo (MEM 10x)	Gibco	11430030
Piatto da 150 mm	Corning	430599
Puntali di erogazione calibro 16 con connessione Luer lock	McMaster-Carr, Illinois, Stati Uniti	Codice 6699A2
20µ L rack per puntali filtranti	Opentrons	999-00099
200µ L rack per puntali filtranti	Opentrons	999-00081
200-μ L puntali per pipette	Eclissi	4-1030-260-000
Puntali di erogazione calibro 20 con connessione Luer lock	McMaster-Carr, Illinois, Stati Uniti	Codice 6699A4
Piastra a 384 pozzetti senza pozzetto (nera)	Greiner	82051-544
Siringa da 3 ml	BD, Canada	309657
Provetta da centrifuga conica in polipropilene da 50 mL	VWR	CA21008-940
Provetta da centrifuga conica in polipropilene da 50 mL	VWR	CA21008-940
Piastra a 96 pozzetti senza pozzetti (nera)	Greiner	82050-714
Acetone	Fisher Scientifico	A18-1
Bilancia analitica	N/A	N/A
Estensione AxiDraw per Inkscape (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)	N/A	N/A
API Python di AxiDraw (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation)	N/A	N/A
AxiDraw V3 Macchina per scrivere e disegnare personale ad alte prestazioni	Scienziati pazzi malvagi, Stati Uniti	N/A
Collagene bovino (PureCol 3 mg/ml)	BioMatrix avanzato	5005
Linea cellulare di scelta	N/A	N/A
Cavalletto a clip (incluso nella confezione AxiDraw V3)	Scienziati pazzi malvagi, Stati Uniti	N/A
Terreni colturali di scelta	N/A	N/A
Nastro di protezione antisporco	3M	6851 PN36851
Nastro biadesivo poliacrilico (800 mm x 1200 mm)	Ricerca adesiva, ARcare	Codice 90106NB
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	12483-020
Filtri per tè Finum XL	Riensch & Held GmbH & Co. KG, Amburgo, Germania	420.69.00
Tappi piatti per provette PCR da 0,2 ml (strisce da 8)	Sarstedt	65.989.002
Morsetti a molla in plastica per impieghi gravosi	BENCHMARK	1024-554
Modulo HEPA – Modello 110-130V 60Hz	Opentrons	999-00109
Impacco di ghiaccio (congelato, 1400 mm x 1800 mm)	N/A	N/A
Software Inkscape	N/A	N/A
Taglio laser	Sistema laser universale	VLS3.75
Tubo miniaturizzato in acetato di etile vinile (EVA) con diametro esterno di 0,07 pollici	McMaster-Carr, Illinois, Stati Uniti	1883T3
Pipetta elettronica multicanale P20 (Gen2)	Opentrons	999-00005
Pipetta elettronica multicanale P300 (Gen2)	Opentrons	999-00006
Smalto per unghie	Sally Hansen	SBS-006861	Opzionale, per la pigmentazione dell'inchiostro PMMA
Opentrons OT-2	Opentrons	999-00111
Pipetta P1000	Gilson	FA10006M
Pipetta a 8 canali P200	Gilson	F144072
Pipetta P200	Gilson	FA10005M
Asciugamani di carta	N/A	N/A
Parafilm	Azienda Bemis, Inc.	52859-079
Carta pergamena	N/A	N/A
Pipette Pasteur	VWR	14672-380
Penicillina-streptomicina (P/S)	Sigma-Aldrich	P4333
Poli(metacrilato di metile) (PMMA)	Sigma-Aldrich	182230
Pellicola in policarbonato (760 mm x 1300 mm)	McMaster-Carr	Codice 85585K102
Polidimetilsilossano monomero e reticolante (PDMS, 1500 mm x 2700 mm)	Adesivi Ellsworth	4019862
Coltello di precisione	N/A	N/A
Supporto acrilico rigido (dimensioni adattate al fondo della piastra a pozzetti)	McMaster-Carr	Codice 8560K239
Supporto in cartone rigido	N/A	N/A
Righello	N/A	N/A
Forbici	N/A	N/A
Bicarbonato di sodio (0,8 M in acqua distillata)	Sigma-Aldrich	S6014
Deck di temperatura con blocchi di alluminio (Gen2)	Opentrons	999-00097
Ruota di tracciamento	HEEPDD (Amazon)	B07YQWB284
Nastro trasparente	N/A	N/A
Tripan blu	Gibco	15250-061
Tripsina	Gibco	25200-056
Pinzetta	N/A	N/A
Miscelatore a vortice	N/A	N/A

Riferimenti

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Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16 (3), 5517-5527 (2015).
Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).
Done, A. J., Birkeland, A. C. Organoids as a tool in drug discovery and patient-specific therapy for head and neck cancer. CR Med. 4 (6), 101087(2023).
Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
Schuster, B., et al. Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids. Nat Commun. 11 (1), 5271(2020).
Bozal, S. B., et al. Development of an automated 3D high content cell screening platform for organoid phenotyping. SLAS Disc. 29 (7), 100182(2024).
Seiler, S. T., et al. Modular automated microfluidic cell culture platform reduces glycolytic stress in cerebral cortex organoids. Sci Rep. 12 (1), 20173(2022).
Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnol Adv. 34 (8), 1427-1441 (2016).
Pinho, D., Santos, D., Vila, A., Carvalho, S. Establishment of Colorectal Cancer Organoids in Microfluidic-Based System. Micromachines. 12 (5), 497(2021).
Töpfer, E., et al. Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms. Toxicol in Vitro. 61, 104606(2019).
Tong, Z., et al. Towards a defined ECM and small molecule based monolayer culture system for the expansion of mouse and human intestinal stem cells. Biomaterials. 154, 60-73 (2018).
Krebs, J., et al. Carrageenan-Based Crowding and Confinement Combination Approach to Increase Collagen Deposition for In Vitro Tissue Development. Gels. 9 (9), 705(2023).
Li, N. T., et al. An off-the-shelf multi-well scaffold-supported platform for tumour organoid-based tissues. Biomaterials. 291, 121883(2022).
Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Commun Biol. 2 (1), 78(2019).
Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
Landon-Brace, N., et al. An Engineered Patient-Derived Tumor Organoid Model That Can Be Disassembled to Study Cellular Responses in a Graded 3D Microenvironment. Adv Func Mater. 31 (41), 2105349(2021).
Cao, R., et al. An Automation Workflow for High-Throughput Manufacturing and Analysis of Scaffold-Supported 3D Tissue Arrays. Adv Healthcare Mater. 12 (19), 2202422(2023).
Rodenhizer, D., Dean, T., Xu, B., Cojocari, D., McGuigan, A. P. A three-dimensional engineered heterogeneous tumor model for assessing cellular environment and response. Nat Protoc. 13 (9), 1917-1957 (2018).
Young, M., et al. A TRACER 3D Co-Culture tumour model for head and neck cancer. Biomaterials. 164, 54-69 (2018).
Dean, T., Li, N. T., Cadavid, J. L., Ailles, L., McGuigan, A. P. A TRACER culture invasion assay to probe the impact of cancer associated fibroblasts on head and neck squamous cell carcinoma cell invasiveness. Biomater Sci. 8 (11), 3078-3094 (2020).
Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. J Mol Cell Biol. 12 (8), 630-643 (2020).
Shing, C. B. Automating the Generation of a High-Throughput Three- Dimensional Human Adipocyte Model. , University of Toronto. (2009).

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