Questo articolo presenta un protocollo per la somministrazione precisa di cellule staminali vascolari guidate da ultrasuoni alla parete del vaso aortico. La tecnica si rivolge efficacemente alla parete del vaso e promuove la riparazione vascolare negli aneurismi e nelle dissezioni aortiche.
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Articolo metodologico
Somministrazione di cellule staminali ecoguidate di precisione per la riparazione vascolare nelle malattie aortiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli aneurismi aortici e la rottura delle dissezioni sono emergenze cardiovascolari pericolose per la vita. La prevenzione precoce e il controllo della progressione della malattia sono essenziali per migliorare gli esiti dei pazienti. Le cellule staminali vascolari svolgono un ruolo cruciale nella riparazione delle lesioni vascolari in varie malattie vascolari. Tuttavia, le terapie iniettive intravascolari di cellule staminali incontrano sfide nel garantire un attecchimento efficiente delle cellule staminali esogene all'interno della parete vascolare.
Per esplorare un approccio più efficace e minimamente invasivo per la somministrazione di cellule staminali nelle malattie aortiche, abbiamo sviluppato una tecnologia di somministrazione di cellule staminali mirata di precisione guidata da ultrasuoni. In particolare, la tecnica ha utilizzato un sistema di imaging a ultrasuoni color Doppler ad altissima risoluzione per piccoli animali per localizzare con precisione la parete vascolare dell'aorta ascendente in modelli murini di malattia aortica. Successivamente, 1 × 10 cellule staminali vascolari marcate con6 mCherry mescolate in 25 μL di Matrigel sono state iniettate utilizzando un ago da 29 G. La progressione della malattia è stata monitorata mediante ecografia di piccoli animali. Infine, l'aorta è stata raccolta e analizzata utilizzando l'imaging 3D con un microscopio a foglio ottico per tracciare le cellule staminali vascolari iniettate.
I risultati di cui sopra dimostrano che le cellule staminali vascolari iniettate sono state somministrate con precisione alla parete vascolare dell'aorta ascendente con un'invasività minima, promuovendo così efficacemente la riparazione vascolare negli aneurismi e nelle dissezioni aortiche. Questa tecnologia di somministrazione di cellule staminali ecoguidata offre un metodo promettente e minimamente invasivo per il trapianto di cellule staminali, in grado di controllare potenzialmente la progressione degli aneurismi e delle dissezioni aortiche e di altre malattie cardiovascolari correlate nelle cliniche in futuro.
Introduzione
Gli aneurismi e le dissezioni aortiche (AAD) sono malattie cardiovascolari comuni e altamente letali, tipicamente caratterizzate da insorgenza insidiosa e rapida progressione. L'incidenza dell'AAD varia dall'1,3% all'8%, con una stima di 150.000-200.000 decessi a livello globale ogni anno 1,2. A causa dell'insorgenza acuta e dei sintomi clinici sottili, molti pazienti sono in condizioni critiche al momento della diagnosi, mancando la finestra ottimale per il trattamento. Sebbene i trattamenti farmacologici, come i bloccanti β-adrenergici e i bloccanti del recettore dell'angiotensina, possano rallentare in una certa misura l'espansione dell'aneurisma, queste terapie forniscono principalmente un sollievo sintomatico e non hanno dimostrato di prevenire efficacemente l'insorgenza o la progressione dell'AAD3.
Attualmente, la gestione clinica si basa principalmente su interventi chirurgici, tra cui la ricostruzione della radice aortica, la sostituzione dell'aorta ascendente, la chirurgia di Bentall e la riparazione endovascolare degli aneurismi aortici 4,5. Tuttavia, per i pazienti con AAD genetica, in particolare quelli che non hanno ancora raggiunto le indicazioni chirurgiche, mancano trattamenti eziologici efficaci e gli approcci farmacologici faticano a controllare la progressione della malattia a lungo termine. Nei pazienti con sindrome di Marfan (MFS), sebbene il trattamento medico possa ritardare la dilatazione aortica, gli studi indicano che alcuni individui sperimentano un tasso più rapido di espansione aortica e affrontano un rischio più elevato di dissezione aortica5. Pertanto, fornire interventi efficaci per questi pazienti, che non soddisfano ancora i criteri chirurgici, rimane una sfida clinica significativa. Lo sviluppo di strategie terapeutiche più mirate è diventato un problema chiave che deve essere affrontato nel trattamento delle malattie aortiche.
La patogenesi dell'AAD comporta principalmente un'estesa apoptosi delle cellule muscolari lisce (SMC) e l'assottigliamento dei media, con conseguente fragilità strutturale della parete aortica. In particolare, la progressiva perdita di SMC aortiche è un segno distintivo dell'AAD, che si manifesta con l'apoptosi delle SMC, la degradazione della matrice extracellulare (ECM), l'infiltrazione di cellule immunitarie e l'aumento dello stress ossidativo2. Le cellule staminali vascolari sono un tipo di cellula staminale adulta che risiede nella parete del vaso, in grado di differenziarsi in SMC o cellule endoteliali. In condizioni fisiologiche normali, le cellule staminali rimangono quiescenti, ma in condizioni patologiche si attivano, andando incontro ad autorinnovamento e differenziazione per contribuire alla riparazione dei tessuti6. Studi recenti hanno sottolineato il ruolo critico delle cellule staminali della parete vascolare nel danno vascolare, in particolare nel rimodellamento degli innesti venosi, nell'aterosclerosi, nella restenosi, nell'ipertensione e in malattie o condizioni patologiche come AAD 7,8,9,10,11,12,13.
Mentre le tecnologie esistenti per la somministrazione di cellule staminali, come l'iniezione locale tessuto-specifica e l'infusione endovenosa sistemica, sono relativamente avanzate, la somministrazione di cellule staminali alla parete aortica presenta sfide significative14,15. Il rapido flusso sanguigno nell'aorta, unito alla contrazione dinamica e al rilassamento della parete vascolare, rende difficile ottenere una consegna cellulare efficiente e garantire la sopravvivenza a lungo termine delle cellule trapiantate nel tessuto vascolare.
In questo studio, descriviamo una nuova tecnica di iniezione di epimembrana a parete chiusa che consente la somministrazione minimamente invasiva e mirata di cellule staminali della parete vascolare sotto guida ecografica. Questo approccio offre il vantaggio di essere facile da eseguire, senza la necessità di toracotomia o laparotomia, ed evita le complicanze associate. Consente inoltre una maggiore flessibilità durante il processo di iniezione, consentendo la concentrazione mirata di cellule staminali nell'area desiderata e riducendo al minimo le risposte immunitarie e altri effetti collaterali. Inoltre, i progressi nella tecnologia di chiarificazione ottica dei tessuti consentono ora l'imaging a risoluzione subcellulare dell'intero corpo dei topi, offrendo ampie applicazioni nella ricostruzione tridimensionale ad alta risoluzione delle strutture tissutali, nello studio dei meccanismi patologici, nella modellazione delle malattie e nello screening dei farmaci. Se combinata con la microscopia a foglio luminoso, questa tecnologia fornisce immagini 3D con un'elevata risoluzione spaziale16. Utilizzando questo approccio, possiamo tracciare le cellule staminali vascolari iniettate e osservare la loro capacità migratoria. Pertanto, la somministrazione di cellule staminali ecoguidata rappresenta un promettente metodo minimamente invasivo per il trapianto di cellule staminali.
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono condotte in conformità con i regolamenti del Comitato per la Ricerca Animale della Capital Medical University e sono approvate dal Comitato per il Benessere e l'Etica degli Animali della Capital Medical University.
1. Preparazione di cellule staminali vascolari iniettate
NOTA: Per verificare lo stato e gli effetti post-iniezione delle cellule staminali vascolari, le cellule Sca1+ vengono isolate utilizzando la selezione di biglie immunomagnetiche come precedentemente descritto 17,18,19, trasfettate con un lentivirus che trasporta il reporter mCherry per la successiva osservazione della posizione e della distribuzione cellulare e quindi coltivate. Per gli esperimenti successivi vengono utilizzate cellule provenienti da passaggi 5 o precedenti con buone condizioni di crescita ed espressione di Sca1+ marcata con mCherry20.
- Prelevare l'aorta da topi C57BL/6J di 6-8 settimane, separare il tessuto avventiziale al microscopio e tritare a circa 0,5 mm. Applicare gelatina allo 0,04% sul fondo del pallone di coltura a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per favorire l'adesione e la proliferazione cellulare. Dopo 20 minuti, aspirare la gelatina e posizionare il fazzoletto tritato sul fondo del pallone di coltura17,21, con il fondo rivolto verso l'alto per 2-3 ore. Dopo che il tessuto è stato saldamente attaccato al fondo del pallone di coltura, posizionare il fondo del pallone di coltura verso il basso, aggiungere il terreno di coltura al pallone e incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2.
- Dopo 3 ore, rimuovere il pallone di coltura e aggiungere il terreno DMEM contenente il 20% di siero fetale bovino, 10 ng/mL LIF, 100 U/mL di penicillina/streptomicina.
- Dopo 3 giorni, una volta che le cellule sono migrate dal tessuto e hanno raggiunto l'80%-90% di confluenza, aggiungere lo 0,05% di tripsina e subcolturarle in un rapporto 1:3.
- Per il passaggio 3, sostituire il terreno con DMEM contenente il 15% di siero fetale bovino; per il passaggio 5, sostituire il terreno con DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino (gli altri componenti rimangono invariati).
- Digerire le cellule vascolari avventiziali e incubarle su ghiaccio con microsfere anti-Sca1+ . Aggiungere la sospensione cellulare in una colonna dotata di un sistema di smistamento magnetico delle celle e raccoglierle18. Utilizzare cellule con buone condizioni di crescita dai passaggi 5 o precedenti per gli esperimenti successivi.
NOTA: Per garantire la vitalità cellulare, si raccomanda che le cellule per l'iniezione in vivo abbiano una vitalità del ≥90%, come determinato dalla colorazione con blu di tripano. - Un'ora prima dell'iniezione, aggiungere lo 0,05% di tripsina alle cellule, contarle con un emocitometro e rimuovere il surnatante centrifugando a temperatura ambiente a 200 × g per 5 minuti.
- Risospendere le cellule in Matrigel (prescongelato a 4 °C) a una concentrazione di 4 × 107 cellule/mL come vettore per il trapianto di cellule staminali, per imitare l'ambiente di crescita in vivo. Agitare delicatamente la miscela e tenerla in ghiaccio fino al momento dell'iniezione.
2. Preparazione preoperatoria dei topi
- Sottoporre i topi a digiuno 12 ore prima dell'iniezione senza limitare l'acqua.
- Pulire accuratamente la camera di induzione dell'anestesia e la piattaforma ecografica con etanolo al 75%.
- Applicare un unguento per gli occhi e posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestesia, con il flusso di ossigeno impostato a 1 L/min e la concentrazione di isoflurano regolata al 2-3%. Attendere che il riflesso del dolore scompaia, indicando l'avvenuta anestesia, quindi rimuovere con cura il topo dalla camera.
- Posizionare il naso e la bocca del topo sotto una maschera per anestesia e regolare la concentrazione di isoflurano all'1,5-2%. Posizionare il mouse dorsalmente su una piattaforma a 37 °C per massimizzare l'esposizione addominale.
- Applicare il gel conduttivo ai quattro elettrodi sulla piattaforma e utilizzare del nastro adesivo medico per fissare le quattro zampe del topo agli elettrodi per monitorare lo stato fisiologico.
NOTA: L'operatore indossa guanti sterili, una maschera, un cappuccio chirurgico e un camice chirurgico sterile. - Utilizzare un batuffolo di cotone sterile per applicare la crema depilatoria sul sito di iniezione, lasciare agire per 1 minuto, quindi pulire delicatamente con un nuovo tampone. Disinfettare il sito di iniezione con tintura di iodio 3x.
- Coprire il sito chirurgico, preparare asetticamente una siringa sterile e mantenere il campo sterile.
3. Iniezione ecoguidata di cellule della parete vascolare
NOTA: Tutte le procedure ecografiche vengono eseguite utilizzando un sistema di imaging a ultrasuoni e un software (fare riferimento alla Tabella dei materiali). Utilizzare sonde con una frequenza centrale di 40 MHz e aghi da 29 G .
- Regolare la piattaforma ecografica a un angolo di circa 30° rispetto al pavimento. Chiedi all'operatore di rivolgere la mano verso il lato destro dell'animale, con la testa dell'animale orientata a sinistra. Applicare il gel per ultrasuoni sulla zona depilata e disinfettata.
- Posizionare la sonda sul lato destro dello sterno per visualizzare l'asse lungo dell'arco aortico.
- Caricare 25 μl della sospensione di 1 × 106 cellule staminali della parete vascolare in Matrigel nell'ago da 29 G. Pulire la punta dell'ago con alcool sterile prima dell'iniezione per ridurre al minimo l'impianto ectopico di cellule staminali.
- Fissare la siringa contenente la sospensione cellulare all'apparecchio per iniezione ecoguidata, assicurandosi che la direzione dell'ago sia allineata con la sonda e con un angolo di 45° rispetto alla parete toracica.
- Guidare lentamente l'ago per iniezione nel campo visivo degli ultrasuoni, regolarlo sul piano focale e allinearlo con la linea di marcatura del percorso di iniezione.
- Quando l'ago si avvicina al bordo della pelle, utilizzare una pinza smussata per afferrare la pelle e la parete addominale e far avanzare rapidamente l'ago attraverso la parete toracica.
- Sotto guida ecografica, dirigere l'ago verso la regione avventiziale tra l'arteria anonima e l'arco aortico. Rimuovere delicatamente la siringa su e giù per confermare la posizione dell'ago.
- Premere la siringa per iniettare la sospensione cellulare nell'area target.
- Estrarre lentamente l'ago per iniezione e disinfettare il sito di puntura secondo le procedure standard.
NOTA: Dopo le procedure chirurgiche, i topi devono essere posizionati su un termoforo a 37 °C fino a quando non sono completamente coscienti e in grado di mantenere la decubito sternale, e devono essere continuamente monitorati mentre si trovano sul termoforo. Successivamente, trasferisci gli animali in gabbie pulite con lettiera fresca. Il monitoraggio continuo deve essere condotto ogni ora per 24 ore per valutare la presenza di potenziali complicanze postoperatorie, tra cui postura curva e diminuzione dell'attività.
4. Chiarificazione del tessuto vascolare
- Iniettare cellule staminali Sca1+ marcate con mCherry nella regione avventiziale alla giunzione dell'arteria anonima e dell'arco aortico. Dopo 4 settimane, sopprimere i topi usando CO2, quindi raccogliere il tessuto aortico dopo la perfusione.
- Fissare il tessuto aortico in paraformaldeide al 4% per 4 ore a temperatura ambiente, quindi eseguire lavaggi PBS per 3 x 1 ora. Trasferire il tessuto in una soluzione di pulizia dei tessuti e incubare su una piattaforma di agitazione a 37 °C per 2 giorni per ottenere la trasparenza.
NOTA: La soluzione di chiarificazione tissutale di riferimento è una miscela di 10% di N-butildietanolammina e 10% di Triton-X-100 disciolta in ddH2O11. - Lavare il fazzoletto per 3 x 2 h con PBS a temperatura ambiente. Trasferire il tessuto in PBS contenente l'anticorpo primario CD31 (1:100) e incubare a 4 °C per 24 ore.
- Dopo il lavaggio per 3 x 1 h con PBS, incubare il fazzoletto con l'asino anti-capra (1:800) a temperatura ambiente per 3-4 h, seguito dal lavaggio PBS per 3 x 1 h.
- Trasferire il tessuto in una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione e incubare per almeno altri 2 giorni per una trasparenza continua.
NOTA: La soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione di riferimento è una miscela di antipirina al 45%, nicotinammide al 30% e N-butildietanolammina allo 0,5% disciolta in ddH2O11. - Preparare un gel di agarosio al 2%, scaldarlo e scioglierlo, incorporare il fazzoletto trasparente nel gel di agarosio e lasciarlo raffreddare per mantenere la sua forma di cilindro con un diametro di 5 mm. Fissalo sul tavolino di un microscopio a foglio luminoso e scansionalo in 3D. Secondo le seguenti specifiche: Obiettivo di illuminazione: 2 unità di lenti ad immersione in acqua 10x 0,3 ad apertura numerica (NA); Obiettivo di rilevamento: 1 unità di obiettivo multi-immersione 10x 0,5 NA; Cambio di ingrandimento: 1x/0,75x, è stata eseguita l'imaging.
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Risultati
Rilascio ecoguidato di cellule staminali vascolari
In questo studio, l'iniezione ecoguidata è stata eseguita utilizzando un sistema di imaging ecografico color Doppler per piccoli animali (Figura 1A, B). Durante la procedura, i topi sono stati immobilizzati su una piattaforma ecografica riscaldata, con regolazioni apportate alla piattaforma e alla sonda ecografica secondo necessità (Figura 1C).
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Discussione
Gli AAD causati da mutazioni genetiche sono classificati come AAD ereditari, tra i quali la MFS è la più diffusa. L'AAD rappresenta la complicanza più pericolosa per la vita di MFS22. Per studiare questa condizione, abbiamo utilizzato un modello murino consolidato di MFS (topi Fbn1C1041G/+), che sviluppa spontaneamente aneurismi aortici, rendendolo ideale per studi di intervento precoce. Questo modello elude anche il danno tissutale aggiuntivo ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del National Science and Technology Major Project (2023ZD0503304), della National Natural Science Foundation of China (32271231) e del National Key Research and Development Program of China (2023YFC3606500). Ringraziamo il Dr. Chao Zheng per il supporto tecnico nell'imaging 3D.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di gelatina allo 0,1% | OriCell | GLT-11301 | |
| Microprovette da 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 μ L puntali per pipette | Selezione del laboratorio | T-001-10 | |
| 1000 μ L puntali per pipette | Selezione del laboratorio | T-001-1000 | |
| Provetta da centrifuga da 15 mL | Selezione del laboratorio | CT-002-15A | |
| 200 μ L puntali per pipette | Selezione del laboratorio | T-001-200 | |
| Provetta per microcentrifuga da 5 mL | Biosharp | BS-50-M | |
| Provetta da centrifuga da 50 mL | Selezione del laboratorio | CT-002-50A | |
| Antipirina | Macklin | A800873 | |
| Kit Microbeads Anti-Sca-1 | Miltenyi Biotec | 130-123-124 | |
| Sistema Bruker Luxendo MuVi -SPIM | |||
| CD31 | R& D | AF3628 | Rapporto di diluizione 1:100 |
| CUBIC-L | soluzione per la pulizia dei tessuti | ||
| CUBIC-RA | Soluzione per la corrispondenza dell'indice di rifrazione | ||
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| anticorpo secondario anti-capra dell'asino, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | Codice A11055 | Rapporto di diluizione 1:800 |
| FBS | Corning | 35-076-CV | |
| HBLV-ciliegia-BORRA | HANBIO | ||
| Tubi omogeneizzatori | Selezione del laboratorio | HGT-003-200 | |
| Apparecchio per iniezione con ago guidato da immagini | Visualsonics | ||
| Siringa da insulina | BD | 328421 | |
| Isoflurano | Ameixin | LAT-YFW | |
| Microscopi a foglio luminoso | Bruker Luxendo | MuVi-SPIM | |
| Matrigel | Corning | 356234 | |
| Trasduttore Microscan MS400 | Visualsonics | ||
| Piattaforma per la manipolazione dei mouse e il monitoraggio fisiologico | Visualsonics | ||
| N-butildietanolammina | Macklin | N802391 | |
| Nicotinammide | Macklin | N814605 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| Unguento oftalmico Puralube | EQUL | 1703321138 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Soluzione per macchie blu Trypan | Distretto di Solarbio | Codice: C0040 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| Sistema di maging Vevo 2100 | yiswelsonics | ||
| Sistema di binari integrato Vevo II | Yiswelsanics |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
