Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'impianto automatizzato di xenotrapianto tumorale in larve di zebrafish utilizzando un sistema di iniezione robotica all'avanguardia. Inoltre, presentiamo video di iniezione e dati di convalida che dimostrano le prestazioni di successo del sistema.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Automazione dell'impianto tumorale nelle larve di pesce zebra per la ricerca e la medicina sul cancro
* These authors contributed equally
In questo articolo
Avviso di errata corrige
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Sommario
Abstract
Le iniezioni larvali di zebrafish, compreso lo xenotrapianto di tumore sottocutaneo e cerebrale-ortotopico e la somministrazione di farmaci per via endovenosa, sono diventate tecniche centrali nella ricerca basata sul pesce zebra. Queste procedure, tuttavia, rimangono noiose, tecnicamente impegnative e dipendono fortemente dall'abilità dell'operatore, limitando la produttività e la riproducibilità. Per affrontare queste limitazioni, introduciamo un sistema robotico avanzato che automatizza le microiniezioni nelle larve di zebrafish, migliorando significativamente l'efficienza, la precisione e la riproducibilità rispetto alle iniezioni manuali. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per il funzionamento dell'iniettore automatico, un sistema ad alta produttività in grado di erogare liquidi, particelle o cellule tumorali in tre diversi siti anatomici con precisione e velocità superiori rispetto ai ricercatori addestrati del pesce zebra. Descriviamo i passaggi essenziali, tra cui la configurazione, le calibrazioni, le procedure di iniezione e la risoluzione dei problemi, per garantire prestazioni ottimali. Inoltre, forniamo esempi rappresentativi dei risultati dell'utilizzo del robot e discutiamo il suo potenziale per facilitare le iniezioni larvali su larga scala, anche per gli screening dei farmaci e la medicina di precisione. Integrando un iniettore automatizzato nei flussi di lavoro, i ricercatori possono superare i limiti delle iniezioni manuali e accelerare la scoperta preclinica di farmaci e la selezione personalizzata del trattamento.
Introduzione
Man mano che la nostra comprensione del comportamento del cancro e della resistenza ai farmaci migliora, è diventato sempre più chiaro che è necessario migliorare la diagnosi, la caratterizzazione e il targeting terapeutico dei sottotipi di cancro. Negli ultimi vent'anni, le pubblicazioni nel campo della medicina personalizzata (nota anche come medicina di precisione) sono aumentate 1,2. Infatti, la medicina di precisione è definita come la pratica di personalizzare il trattamento medico in base alle caratteristiche della malattia del singolo paziente3. Ciò fa seguito alla nostra attuale comprensione che non esiste un approccio unico per tutti, che è diventato particolarmente chiaro e pertinente nella terapia del cancro. Attualmente, tuttavia, la mancanza di approcci di medicina di precisione clinicamente rilevanti per la maggior parte dei pazienti oncologici significa che il processo di selezione della strategia di trattamento più adatta avviene per tentativi ed errori. Ciò si traduce in ritardi significativi e disagi inutili con una ridotta qualità della vita e una sopravvivenza ridotta. È importante sottolineare che un paziente con una ridotta qualità della vita dopo diversi regimi chemioterapici inefficaci può scegliere di passare al trattamento palliativo4. Con un metodo di screening adeguato e personalizzato, la selezione dei farmaci può essere eseguita con maggiore precisione e senza ritardi. Sebbene sia possibile eseguire il sequenziamento genetico e proteomico su cellule tumorali5, tali dati molecolari sono complessivamente scarsamente predittivi dell'esito del paziente e spesso hanno scarso valore clinico6. Nell'ambito dello sviluppo di farmaci, avere un approccio di medicina di precisione il prima possibile migliora notevolmente le percentuali di successo nelle varie tappe della pipeline di sviluppo dei farmaci. Infatti, capire fin dall'inizio quali farmaci candidati hanno il più ampio profilo di efficacia interindividuale, o quali sottotipi di cancro sono particolarmente sensibili a ciascun farmaco candidato, riduce i rischi e migliora l'efficienza dei test preclinici e degli studi clinici tardivi7. Con l'aumento dei costi di ricerca e sviluppo farmaceutico8, la crescente pressione politica per abbassare i prezzi dei farmaci 9,10 e i progressi nella convalida degli obiettivi guidata dall'intelligenza artificiale11, la necessità di un metodo di screening su larga scala, efficiente e incentrato sulla medicina di precisione nello sviluppo dei farmaci non è mai stata così grande.
Qui, entrano in scena i pesci zebra, in particolare le larve di pesce zebra a 48 ore dopo la fecondazione (hpf). I modelli di xenotrapianto tumorale basati su larve di zebrafish come ospiti costituiscono una piattaforma di screening rapido in vivo per prevedere le risposte cliniche alla chemioterapia 6,12,13,14. I modelli di xenotrapianto tumorale di zebrafish sono emersi come una potente alternativa sia alla medicina molecolare di precisione (ad esempio, approcci genomici o di patologia molecolare per guidare la scelta del trattamento per i pazienti oncologici), sia agli studi di xenotrapianto di organoidi e topi per lo sviluppo preclinico di farmaci15,16. Con gli xenotrapianti tumorali di zebrafish, le cellule tumorali fluorescenti (geneticamente o chimicamente marcate) vengono innestate in larve di zebrafish con alta efficienza13. I farmaci o i candidati farmaci con una modalità d'azione relativamente rapida (ad esempio, tale da mirare direttamente o indirettamente alla vitalità delle cellule tumorali attraverso, ad esempio, l'attivazione della citotossicità delle cellule T) possono quindi essere sottoposti a screening in soli tre giorni, portando a letture rapide e funzionali dell'efficacia dei farmaci antitumorali e antimetastatici. Successivamente, è possibile effettuare una selezione informata della terapia che mostra una buona efficacia, con studi che dimostrano che ciò dovrebbe tradursi in un forte risultato del trattamento per il paziente o in una possibilità di successo in un progetto di sviluppo di farmaci rispettivamente 12,17,18,19. Inoltre, questo processo di screening è molto importante per la selezione dei composti da portare avanti nella pipeline di sviluppo dei farmaci.
Tuttavia, per diventare uno strumento diagnostico praticabile in ambito clinico e per consentire screening farmacologici su larga scala nell'ambito della ricerca sul cancro e dello sviluppo di farmaci, il modello di xenotrapianto tumorale di pesce zebra (ZTX) deve essere veloce, affidabile, riproducibile ed economico. L'automazione è essenziale per raggiungere questi obiettivi, in quanto riduce al minimo la variabilità dell'operatore, aumentando al contempo la produttività e migliorando la precisione nell'iniezione e nell'analisi delle cellule tumorali. Standardizzando queste procedure, possiamo migliorare la riproducibilità dei dati ed eliminare l'errore umano, mentre i flussi di lavoro automatizzati offrono opportunità per lo screening ad alto rendimento e per rendere fattibili studi su larga scala20,21. Recentemente, abbiamo sviluppato un iniettore automatizzato che inietta liquidi, particelle o cellule di varia origine in tre diversi siti anatomici con velocità, precisione e riproducibilità uguali o superiori rispetto ai ricercatori addestrati di zebrafish22. Qui presentiamo un protocollo per l'iniezione automatizzata di cellule tumorali in larve di zebrafish in modo preciso e controllato. Utilizzando il riconoscimento avanzato delle immagini, le larve di zebrafish si trovano sulla piastra di iniezione, viene determinato l'orientamento e viene identificato il sito target per l'iniezione. L'ago viene quindi guidato automaticamente e il software determina l'avvenuta puntura. Con una formazione minima, gli operatori possono utilizzare questo sistema per eseguire iniezioni complesse, ad esempio creando microtumori in larve di zebrafish vive, consentendo così uno screening efficiente delle strategie di trattamento.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Le linee di zebrafish sono state mantenute secondo protocolli standard (https://zfin.org) e gestite in conformità con le normative locali sul benessere degli animali. Questi regolamenti attuano le linee guida del Consiglio d'Europa per la protezione degli animali da esperimento (Direttiva 86/609/CEE), che consentono l'uso di larve di pesce zebra fino all'inizio dell'alimentazione libera (5 giorni dopo la fecondazione). Poiché tutte le larve utilizzate in questo studio non avevano più di 5 giorni di vita, non era richiesta alcuna licenza etica ai sensi della direttiva 86/609/CEE.
NOTA: Le larve di zebrafish dechorionate da 48 hpf e il materiale da iniettare in queste larve devono essere preparati prima di iniziare la procedura utilizzando l'iniettore automatico. I protocolli per questo possono essere trovati nei metodi supplementari (File supplementare 1) associati a questo articolo. Una presentazione schematica del flusso di lavoro del protocollo è mostrata nella Figura 1. La Figura 1 supplementare mostra una rappresentazione schematica delle fasi di sviluppo degli embrioni di zebrafish.
1. Preparazione del microago
NOTA: I microaghi sono necessari per le iniezioni e sono un elemento essenziale del processo di iniezione per risolvere i problemi e mettere a punto questo scopo. Nell'iniettore automatico possono essere utilizzati sia aghi commerciali che aghi fatti manualmente. Di seguito è riportata la procedura per estrarre manualmente i microaghi utilizzando lo strumento Sutter P-1000 o PC-10, sebbene la maggior parte degli estrattori di microaghi abbia un funzionamento simile. La morfologia dell'ago preferita è una conicità graduale di 6-8 mm, con una dimensione della punta di 0,3-0,7 μm, che viene aperta manualmente prima dell'iniezione utilizzando una pinza affilata.
- Preparare capillari in vetro borosilicato adatti: diametro esterno 1,0 mm, diametro interno (ID) 0,78 mm. Assicurarsi che siano puliti e privi di polvere e detriti.
- Verificare che la serpentina di riscaldamento sia integra e in buone condizioni.
- Inserire il capillare di vetro nei morsetti e fissarlo saldamente utilizzando le viti di fissaggio, ma non così saldamente da rompere il tubo.
- Regola le impostazioni: impostazione del calore, forza di trazione e tempo di rampa. Quando si utilizza un estrattore per aghi PC-10, la corretta morfologia dell'ago si ottiene utilizzando un tiro a stadio singolo con l'impostazione di riscaldamento 68 e pesi pieni.
NOTA: Queste impostazioni influenzeranno la lunghezza e la larghezza della conicità della punta e possono variare a seconda dello spessore della parete del capillare. Qui sono necessari tentativi ed errori per produrre il miglior risultato. - Rimuovere gli aghi dai morsetti con attenzione, per non danneggiare la punta. Ispezionare la punta per garantire una conicità uniforme.
- Conservare con cura i microaghi sul nastro adesivo, assicurandosi che la punta delicata non entri in contatto con alcuna superficie.
2. Preparazione della piastra in gel di agarosio per iniezione robotica
- Pesare 0,6 g di agarosio e trasferirlo in una bottiglia di vetro da 100 ml.
- Utilizzando un cilindro graduato, misurare 40 mL di soluzione E3. Mettilo nella bottiglia di vetro con l'agarosio per preparare una soluzione di agarosio all'1,5%.
- Mettere la bottiglia di vetro nel microonde e scaldare per 30 s a 900 W. Quindi, continuare il riscaldamento con incrementi di 30 secondi, facendo roteare il contenuto (indossando guanti) tra ogni intervallo fino a quando l'agarosio non si è completamente sciolto.
NOTA: Attenzione, poiché l'ebollizione può iniziare anche a causa del vortice. - Una volta sciolto, raffreddare l'agarosio sciacquando l'esterno della bottiglia di vetro sotto l'acqua corrente fino a quando non risulta caldo ma non caldo al tatto (circa 60 °C).
- Pulire e asciugare accuratamente il portatarga riutilizzabile e il vetrino in vetro. Montare facendo scorrere il vetrino nella fessura sul lato del portatarga (Figura supplementare 2A) e posizionarlo su una superficie piana.
NOTA: Verificare che la lastra di vetro non sporga dal lato del supporto. - Versare circa 40 ml della miscela di agarosio sulla lastra di vetro, assicurandosi che si diffonda fino a coprire l'intera superficie. Se necessario, inclinare in modo tale da raggiungere tutti i bordi.
- Lasciare solidificare l'agarosio per circa 5 minuti. La piastra è quindi pronta per l'uso.
NOTA: L'aggiunta di una soluzione E3 sulla superficie della piastra di agarosio solida può prevenire l'essiccazione. Tuttavia, deve essere rimosso prima del suo utilizzo per iniezioni.
3. Posizionamento delle larve di pesce zebra sulla piastra in gel di agarosio
- Inumidire la piastra in gel di agarosio con una soluzione E3.
- Tenere la piastra inclinata, in modo da raccogliere la soluzione E3 in eccesso.
- Preparare una soluzione E3 contenente 40 μg/mL di tricaina in una piastra di Petri. Mettere circa 20 larve nella soluzione e lasciarle anestetizzare per 2 minuti.
- Posizionare con cura 10-20 larve anestetizzate sulla piastra (Figura 2B supplementare), assicurandosi che l'acqua in eccesso defluisca naturalmente.
- Assicurarsi che le larve siano distese, non toccandosi l'una con l'altra, ed evitare di posizionarle troppo vicino (5-10 mm) al bordo della piastra (Figura supplementare 2B).
- Rimuovere il liquido in eccesso dal piatto assicurandosi che le larve rimangano umide.
NOTA: Un eccesso di liquido può indurre movimenti larvali involontari durante l'iniezione, mentre livelli di umidità inadeguati possono aumentare i tassi di mortalità.
4. Caricamento del microago
NOTA: Caricare il microago con cellule fluorescenti ad alta densità appena prima di eseguire un'iniezione. Le cellule possono esprimere geneticamente un marcatore fluorescente o può essere utilizzata un'etichetta chimica23. Sebbene il numero di cellule iniettate in ciascuna larva sia relativamente basso, in genere da 700 a 900 cellule, la densità cellulare deve essere elevata nella fase di iniezione; circa 300.000-500.000 cellule per μL, dovute principalmente al volume minuto (circa 2 nL) che viene iniettato.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 200 × g per 5 minuti e rimuovere il terreno cellulare.
- Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule, quindi risospendere il pellet in PBS sterile a temperatura ambiente (RT) per ottenere una densità finale di 300.000 cellule/μl.
- Prendi un microago preparato e tienilo con cura tra il pollice e l'indice. Quindi, utilizzando la punta di una pipetta per microcaricatore, caricare il microago con 1-10 μL di sospensione cellulare, a seconda del numero di cellule.
NOTA: Inserire la punta all'estremità del microago ed estrarla lentamente mentre viene riempita. - Utilizzando uno stereomicroscopio con ingrandimento 4x e un paio di pinze sottili, rompere con cura la punta sigillata del microago per produrre un'apertura. Questo passaggio può essere eseguito anche prima di caricare una sospensione a iniezione.
NOTA: Una punta dell'ago smussata facilita la puntura e può essere creata utilizzando una smerigliatrice ad ago. Se si utilizza una smerigliatrice ad ago, smussare la punta dell'ago prima di caricare le sospensioni per iniezione. In questo caso, l'ago è già aperto prima che le celle vengano caricate.
5. Funzionamento del robot per la microiniezione
- Eseguire la procedura di avvio.
- Assicurarsi che sia collegata e attivata un'adeguata alimentazione del gas.
NOTA: La pressione di ingresso consigliata da un compressore d'aria o da una valvola dell'aria in un ambiente di laboratorio con aria pressurizzata centralizzata è di 0,6 MPa (6 bar). Il compressore d'aria o la valvola possono rimanere continuamente accesi e aperti senza la necessità di frequenti spegnimenti. Per la pressione di ingresso è possibile utilizzare aria compressa, azoto o CO2 . - Inserire un'unità USB in una delle porte sul retro del robot (opzionale).
NOTA: Un'unità USB deve essere inserita nella macchina prima di accendere il robot e viene rimossa solo dopo che il robot è stato spento. - Premere il pulsante di accensione verde accanto allo schermo per accendere il robot (Figura 2C supplementare). Attendere fino a quando non viene visualizzato il pannello di controllo (circa 1 min).
- Controllare se ci sono 15 cm di spazio libero sui lati sinistro e destro del robot e premere OK sul popup (Figura supplementare 2D).
- Premere OK nel popup successivo (Figura 2E supplementare) relativa all'unità USB.
NOTA: Questo popup non viene visualizzato se non è inserita alcuna unità USB.
- Assicurarsi che sia collegata e attivata un'adeguata alimentazione del gas.
- Impostare la connessione per il telecomando (opzionale).
NOTA: Un telecomando viene utilizzato per visualizzare e azionare la macchina a distanza. Questa funzione è utile per dimostrazioni, sessioni di formazione, aggiornamenti software e risoluzione dei problemi.- Inserire un cavo Ethernet nella porta sul retro della macchina. Per la configurazione iniziale, contattare il reparto IT per assistenza.
- Toccare l'icona del menu situata nell'angolo in alto a sinistra dello schermo (Figura 2F supplementare).
- Toccare l'icona delle impostazioni in basso al centro del menu (Figura supplementare 2F).
- Selezionare Modalità di manutenzione dal menu delle impostazioni (Figura supplementare 2G).
- Toccare Connetti a LSM per avviare una connessione remota (Figura 2H supplementare).
- Eseguire le impostazioni di iniezione.
- Toccare le impostazioni di iniezione nel menu (Figura supplementare 2F).
- Scegliere lo stadio di sviluppo appropriato delle larve di pesce zebra per l'iniezione (Figura supplementare 3A).
NOTA: Per le iniezioni nel dotto di Cuvier, nello spazio perivitellino e nel ventricolo rombencefalico, si raccomandano larve di 48 hpf mantenute a 28,5 °C. - Selezionare il sito di iniezione preferito tra le opzioni fornite per l'esecuzione delle iniezioni (Figura supplementare 3B).
- Selezionare la posizione di iniezione sul diagramma schematico di una larva di pesce zebra. Regolare la posizione del diagramma larvale, la punta dell'ago e l'orientamento dell'ago per allinearsi con il sito di iniezione selezionato (Figura supplementare 3C).
NOTA: I posizionamenti suggeriti per i diversi siti di iniezione sono forniti in un articolo precedentemente pubblicato22. Per l'iniezione del dotto di Cuvier (DoC), in genere, l'ago viene posizionato al centro della DoC a causa del flusso sanguigno più elevato in quella regione. L'orientamento dell'ago può essere dorsale o ventrale. Per l'iniezione nello spazio perivitellino (PVS), si raccomanda di iniziare l'inserimento dell'ago al bordo dello spazio e di posizionarlo con un angolo di circa 30-45° rispetto alla notocorda. Per l'iniezione del ventricolo posteriore, si consiglia di iniziare l'inserimento dell'ago all'esterno del rombencefalo per evitare che scivoli. L'angolo dell'ago deve essere allineato tra gli occhi e la vescicola otica. - Selezionare la macro di iniezione, che offre opzioni sia per la modalità automatica che manuale (Figura supplementare 3D).
NOTA: Per la modalità automatica, il nome del sito di iniezione indica che il processo di iniezione viene eseguito autonomamente dal sistema. La selezione manuale prevede che il robot localizzi e si avvicini autonomamente alle larve. Una volta identificate le larve, apparirà un'interfaccia di controllo per gli utenti per eseguire il processo di iniezione. - Una volta finalizzate le impostazioni dell'iniezione, toccare Continua con la calibrazione dell'ago per procedere con la calibrazione dell'ago.
- Eseguire la calibrazione dell'ago.
NOTA: Poiché ogni ago è diverso, la posizione della punta dell'ago deve essere calibrata. L'interfaccia iniziale della calibrazione dell'ago è mostrata nella Figura 3E supplementare.- Afferrare saldamente il portaaghi e ruotare la parte metallica in senso antiorario per staccare il portaago dal robot.
- Inserire il lato smussato di un ago pieno nel lato frustoconico del portaago.
- Toccare Sposta fase per montare il needle visualizzato sullo schermo (Figura supplementare 3E). Il tavolino si sposterà in una posizione sicura per il montaggio dell'ago e verrà visualizzato un righello (Figura supplementare 3F). Misurare la lunghezza dell'ago all'esterno del porta-aghi utilizzando il righello. Dovrebbe essere di circa 22 mm.
- Afferrare il supporto dell'ago contenente l'ago riempito e ruotare la parte metallica in senso orario per serrare saldamente la connessione (Figura supplementare 3G). Premere OK per procedere.
- Nella schermata popup, posizionare l'ago al centro del cerchio (Figura supplementare 3H) regolando le due viti sulla macchina (Figura supplementare 3I). Una volta centrato, tocca il segno di spunta verde.
- Nella schermata popup successiva (Figura supplementare 3J), regolare la messa a fuoco sulla punta dell'ago ruotando la vite situata nella parte posteriore della testa del robot (Figura supplementare 3K). Quando sei a fuoco, tocca il segno di spunta verde. Il robot calibrerà quindi automaticamente l'altezza dell'ago. Successivamente, il robot ruoterà l'ago e visualizzerà le posizioni di iniezione come punti rossi ad ogni rotazione (Figura supplementare 3L).
- Al termine, tocca OK e Continua con la calibrazione delle gocce in basso a destra dello schermo.
- Eseguire la calibrazione delle goccioline.
NOTA: La dimensione delle gocce viene calibrata mediante un'iniezione in olio minerale.- Preparare una piastra a 6 pozzetti con un pozzetto riempito con 10 mL di olio minerale e un altro pozzetto con 10 mL di tampone di pulizia (ad es. PBS o acqua). Posizionare la piastra a 6 pozzetti nella posizione sinistra del supporto della piastra.
NOTA: Rimuovere il coperchio della piastra a 6 pozzetti durante l'esperimento (intero) in modo che possa essere riutilizzata quando un ago è ostruito o viene posizionato un nuovo ago. - Toccare l'icona accanto a Calibra utilizzando una piastra a pozzetti (Figura 4A supplementare).
- Selezionare le posizioni del pozzo dell'olio e del pozzo di pulizia (Figura supplementare 4B).
- Toccare Crea droplet per generare un droplet con le impostazioni mostrate sul lato sinistro dello schermo (Figura 4C supplementare). Regolare la pressione di iniezione, la contropressione e la durata dell'impulso d'aria secondo necessità per raggiungere il volume target. In alternativa, tocca il pulsante Miglioramento automatico per ottimizzare automaticamente le impostazioni e ottenere il volume desiderato.
- Se l'ago è ostruito, premere il pulsante blu Pulisci ago (Figura supplementare 4C) per attivare un impulso di pulizia ad alta pressione nel pozzetto contenente acqua o fluido.
- Se l'ago e la gocciolina appaiono sfocati, regolare la messa a fuoco dell'ago e della gocciolina utilizzando il terzo pulsante in alto sul lato destro dello schermo (Figura 4C supplementare).
- Tocca il segno di spunta verde per chiudere lo schermo.
- Preparare una piastra a 6 pozzetti con un pozzetto riempito con 10 mL di olio minerale e un altro pozzetto con 10 mL di tampone di pulizia (ad es. PBS o acqua). Posizionare la piastra a 6 pozzetti nella posizione sinistra del supporto della piastra.
- Eseguire la selezione della targa.
- Fare clic su Sposta tavolino per posizionare la piastra e il robot sposterà automaticamente il tavolino in una posizione appropriata per posizionare la piastra.
- Verificare che la piastra in gel di agarosio sia asciutta sotto e posizionare la piastra con le larve anestetizzate nella giusta posizione del portapiatti.
- Quindi, fare clic su OK e toccare Continua con l'iniezione per procedere con il processo di iniezione (Figura supplementare 4D).
- Eseguire l'iniezione.
- Nell'interfaccia di iniezione, fare clic sul pulsante Avvia per avviare il processo di iniezione (Figura 4E supplementare). Il processo inizia con lo stadio del robot in movimento mentre il sistema scansiona la piastra di agarosio, alla ricerca di un pesce (Figura supplementare 4F). Dopo aver identificato una larva, l'ago naviga automaticamente verso il sito di iniezione designato e regola automaticamente la sua direzione all'angolo predeterminato.
- Se si sceglie la modalità automatica , il robot somministra senza problemi le iniezioni nel sito selezionato (Figura supplementare 4G). Dopo aver completato l'iniezione in corso, il robot continuerà a scansionare la larva successiva sulla piastra per eseguire le iniezioni.
- Se è selezionata la modalità manuale , quando l'ago si avvicina alla larva apparirà un'interfaccia di controllo manuale (Figura supplementare 4H). Usa le frecce blu e gialle per spostare l'ago e ruota l'ago usando il pulsante di rotazione circolare sul lato sinistro dello schermo. Una volta posizionato l'ago all'interno della larva, tocca il pulsante rosso della goccia per eseguire l'iniezione. In alternativa, toccare il tasto m per avviare la sequenza macro per eseguire automaticamente l'iniezione.
- Quando tutte le larve sono state iniettate, chiudere l'interfaccia di iniezione facendo clic sul pulsante di arresto. L'ago verrà posizionato automaticamente nel pozzetto dell'olio.
- Rimuovere con cautela la piastra contenente le larve iniettate.
- Trasferire le larve di pesce zebra iniettate.
- Per trasferire le larve iniettate, inclinare la piastra su una capsula di Petri e utilizzare una pipetta o un flacone da spremere per sciacquare delicatamente le larve con un flusso d'acqua controllato.
- Inizia dall'alto e spostati verso il basso per un risciacquo efficace.
- Rimuovere eventuali larve morte, sostituire l'acqua con una soluzione fresca di E3 e posizionare la capsula di Petri nell'incubatrice.
NOTA: Se vengono iniettate cellule tumorali umane o campioni clinici, incubare la capsula di Petri a 33-36 °C; in caso contrario, incubare a 28,5 °C.
6. Spegnimento del robot
- Al termine dell'iniezione, rimuovere l'ago visitando il menu di calibrazione dell'ago e premendo Sposta fase per rimuovere l'ago (Figura supplementare 3E). Se si intende tenere l'ago nella macchina per un uso successivo, saltare questo passaggio.
- Vai al menu e tocca il pulsante di accensione , situato in basso a sinistra (Figura supplementare 2D).
- Premere il pulsante di parcheggio dell'ago per preservare l'ago (Figura supplementare 4I).
- In caso contrario, fare clic su OK. La macchina si spegnerà e la spia verde del pulsante di accensione si spegnerà una volta completato lo spegnimento.
NOTA: Quando il robot è inattivo, posizionare le piastre multipozzetto vuote in entrambi i portapiastre multipozzetto per evitare che la polvere penetri nella macchina.
7. Rimozione del gel di agarosio e pulizia
- Rimuovere il gel di agarosio dalla piastra e con cautela (indossare occhiali e guanti) rimuovere la lastra di vetro dal supporto.
- Pulire accuratamente la lastra di vetro e il supporto con acqua tiepida ed etanolo, assicurandosi che si asciughi prima di riutilizzarli.
NOTA: Pulire tutte le piastre in gel subito dopo l'uso, poiché il gel di agarosio è più facile da rimuovere quando è ancora bagnato.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Qui presentiamo il processo di iniezione automatizzato per i tre siti di iniezione più utilizzati per gli xenotrapianti di cellule tumorali.
Il video 1 mostra l'iniezione automatica del condotto di Cuvier (DoC) utilizzando il sistema robotizzato. Il robot prima scansiona sistematicamente la piastra, muovendosi dall'alto verso il basso e da sinistra a destra, per individuare una larva di pesce zebra. Una volta identificata una larva, l'ago si a...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Lo sviluppo e l'implementazione dell'iniettore automatizzato rappresentano un progresso significativo nel campo dello xenotrapianto tumorale del pesce zebra per lo screening di farmaci antitumorali e la medicina di precisione. Questo è, per quanto ne sappiamo, il primo robot disponibile in commercio per l'iniezione automatizzata di sospensioni cellulari in larve di zebrafish, e questo protocollo è quindi rilevante per tutte le ricerche che coinvolgono tali iniezioni ad alta produttività....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Y.D., K.J.v.d.K. e J.d.S. lavorano per Life Science Methods, che sfrutta commercialmente il sistema robotico utilizzato in questa pubblicazione. Gli altri autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo sinceramente il programma Eurostars per aver sostenuto la nostra ricerca attraverso la sovvenzione ROBO-FISH (numero di sovvenzione: E! 114899) e il programma EIC-PATHFINDER attraverso la sovvenzione ALADDIN (numero di sovvenzione: 101130574).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra a 6 pozzi | Greiner bio-one cellstar | Rif. 657160 | |
| Agarose | VWR | #N605-100G | |
| Sistema di iniezione automatica + consumabili | Metodi delle Scienze della Vita | https://www.lifesciencemethods.com/microinjection_system_for_zebrafish_larvae.html?nocache=1752058717774 | |
| Capillari in vetro borosilicato | Strumenti di Precisione Mondiale | N/A | 1,0 mm diametro esterno, 0,78 mm diametro diametrale |
| Contatore cellulare | ThermoFisher | Contessa 3 | |
| Aghi commerciali | Clunbury Scientific LLC | #B100-58-20 | |
| DNasi tipo I | Roche | #11284932001 | |
| Filtro per le cellule tumorali | Sysmex CellTricsTM | 04-0042-2316 | 30 & micro; m |
| Olio minerale | Diapharma | #330779-1L | |
| Smerriferitore a aghi () | Narishige | EG-401 | |
| Polivinilpiroldone 40 | Sigma | #102420477 | |
| Dissociatore Octo GentleMACS | Miltenyi Biotec | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/gentlemacs-octo-dissociator-with-heaters.html |
Riferimenti
- Goetz, L. H., Schork, N. J. Personalized medicine: motivation, challenges, and progress. Fertil Steril. 109 (6), 952-963 (2018).
- Jorgensen, J. T. Twenty years with personalized medicine: Past, present, and future of individualized pharmacotherapy. Oncologist. 24 (7), e432-e440 (2019).
- Ashley, E. A. Towards precision medicine. Nat Rev Genet. 17 (19), 507-522 (2016).
- Binotto, M., Reinert, T., Werutsky, G., Zaffaroni, F., Schwartsmann, G. Health-related quality of life before and during chemotherapy in patients with early-stage breast cancer. Ecancermedicalscience. 14, 1007(2020).
- Nalla, L. V., Kanukolanu, A., Yeduvaka, M., Gajula, S. N. R. Advancements in single-cell proteomics and mass spectrometry-based techniques for unmasking cellular diversity in triple negative breast cancer. Proteomics Clin Appl. 19 (1), e202400101(2025).
- Lindahl, G., et al. Zebrafish tumour xenograft models: a prognostic approach to epithelial ovarian cancer. NPJ Precis Oncol. 8 (1), 53(2024).
- Duan, X. P., et al. New clinical trial design in precision medicine: discovery, development and direction. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 57(2024).
- Research and development in the pharmaceutical industry. , Congressional Budget Office. https://www.cbo.gov/publication/57126 (2021).
- Dusetzina, S. B., Oberlander, J. The price of progress: Managing prescription drug spending. J Health Polit Policy Law. 47 (6), 621-628 (2022).
- Nagar, S., Rand, L. Z., Kesselheim, A. S. What should US policymakers learn from international drug pricing transparency strategies. AMA J Ethics. 24 (11), E1083-E1090 (2022).
- You, Y., et al. Artificial intelligence in cancer target identification and drug discovery. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 156(2022).
- Costa, B., et al. Zebrafish Avatar-test forecasts clinical response to chemotherapy in patients with colorectal cancer. Nat Commun. 15 (1), 4771(2024).
- Ali, Z., et al. Zebrafish patient-derived xenograft models predict lymph node involvement and treatment outcome in non-small cell lung cancer. J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 58(2022).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-X(L) inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028(2023).
- Pascoal, S., et al. Using zebrafish larvae as a xenotransplantation model to study Ewing sarcoma. Methods Mol Biol. 2226, 243-255 (2021).
- Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. Zebrafish avatars towards personalized medicine-A comparative review between avatar models. Cells. 9 (2), 293(2020).
- Costa, B., et al. Zebrafish Avatars of rectal cancer patients validate the radiosensitive effect of metformin. Front Oncol. 12, 862889(2022).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077(2021).
- Holland, I., Davies, J. A. Automation in the life science research laboratory. Front Bioeng Biotechnol. 8, 571777(2020).
- Brito, J. J., et al. Recommendations to enhance rigor and reproducibility in biomedical research. Gigascience. 9 (6), giaa056(2020).
- Ding, Y., et al. Automated microinjection for zebrafish xenograft models. NPJ Biomed Innov. 2, 13(2025).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).
- Martinez-Lopez, M., Povoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373(2021).
- Groenewoud, A., Yin, J., Snaar-Jagalska, B. E. Ortho- and ectopic zebrafish xeno-engraftment of ocular melanoma to recapitulate primary tumor and experimental metastasis development. J Vis Exp. (175), e62356(2021).
- Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459(2017).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Automating Tumor Implantation in Zebrafish Larvae for Cancer Research and Medicine
Posted by JoVE Editors on 11/03/2025. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/68441
