Campionamento efficiente dello spazio di progettazione di biosensori geneticamente codificati grazie alla progettazione di esperimenti e al flusso di lavoro di automazione

Sommario

Questo protocollo fornisce un metodo per l'ottimizzazione globale sistematica di biosensori geneticamente codificati attraverso la generazione e la valutazione di librerie genetiche assistite dall'automazione. A ciò si aggiungono metodologie di progettazione dell'esperimento per semplificare la sperimentazione e consentire la selezione di componenti genetici per regolare i biosensori in base a risultati di progettazione specifici.

Abstract

I biosensori geneticamente codificati sono potenti strumenti per l'elaborazione di informazioni ad alto rendimento, che consentono la trasduzione di segnali di input ambientali o chimici in una varietà di output. Ciò consente il rilevamento dinamico, il controllo diretto e la regolazione fine dell'espressione genica in un'ampia gamma di applicazioni biotecnologiche, tra cui l'ottimizzazione degli enzimi, lo sviluppo di ceppi e il controllo dei processi microbici. Per renderli adatti allo scopo, le prestazioni dei biosensori possono essere perfezionate modificando la stechiometria dei componenti del circuito del biosensore (ad esempio, trasportatori, moduli di input e output) e/o regolando le interazioni intermolecolari host-biosensor associate (ad esempio, DNA-proteina, proteina-proteina). Tuttavia, in questo caso, il vasto numero di possibili permutazioni dei biosensori crea uno spazio di progettazione combinatoria complesso, che richiede un'attenta ottimizzazione delle strategie di screening per identificare le configurazioni che forniscono le prestazioni fenotipiche desiderate. Questa complessità è ulteriormente aggravata dalle caratteristiche prestazionali dei biosensori, come la sintonizzabilità, che richiedono un'analisi della titolazione dell'effettore in condizioni di screening monoclonale. Di conseguenza, la necessità di esplorare diverse sequenze e lo spazio sperimentale rendono i metodi di campionamento frazionato particolarmente adatti a questo scopo. Alla base di questo flusso di lavoro ci sono algoritmi di progettazione dell'esperimento (DoE), che sono ben posizionati per consentire un'efficiente mappatura strutturata su base statistica e il campionamento frazionario di questo spazio di progettazione sperimentale combinatoria.

All'interno è riportato un approccio combinato di automazione ad alto rendimento e computazionale per campionare in modo efficiente lo spazio di progettazione dei biosensori basati su fattori di trascrizione allosterici per offrire configurazioni distinte con curve dose-risposta sia digitali che analogiche. Il protocollo inizia con la creazione e la selezione automatizzata di librerie di siti di legame di promotori e ribosomi. Queste librerie, e i dati di espressione corrispondenti, vengono trasformati in input strutturati adimensionali, consentendo la mappatura computazionale dell'intero spazio di progettazione sperimentale. Il campionamento frazionato viene quindi eseguito utilizzando un algoritmo DoE e accoppiato con l'analisi di titolazione dell'effettore utilizzando una piattaforma di automazione ad alto rendimento. Questo flusso di lavoro fornisce un quadro agnostico per lo sviluppo e l'ottimizzazione dei futuri sistemi di biosensori e circuiti genetici, fornendo un kit di strumenti normativi per la comunità della biologia sintetica.

Introduzione

La capacità di regolare l'espressione dei geni è una funzione essenziale in tutte le forme di vita, facilitando risposte dinamiche e in tempo reale alle influenze sia interne che esterne, che vanno dagli effettori chimici agli^stimoli biofisici. La miriade di sistemi di regolazione trascrizionale presenti in natura ha un enorme potenziale nell'aumento e nell'accelerazione dell'ingegneria metabolica e della ricerca biotecnologica resa possibile dalla biologia sintetica. Nei procarioti, gran parte della regolazione che avviene nella cellula è controllata attraverso meccanismi di regolazione monocomponente guidati dalle interazioni dei fattori di trascrizione allosterica (aTF) con un numero di effettori di piccole molecole². Tipicamente costituiti da un dominio di legame effettore (EBD) e da un dominio di legame del DNA (DBD), gli aTF agiscono come interruttori molecolari quando si legano a specifiche piccole molecole, modulando l'affinità del loro DBD per specifiche sequenze di operatori del DNA situate nelle regioni promotrici del genoma, con conseguente attivazione o repressione della trascrizione³. Questo meccanismo ingannevolmente semplice ha dato origine a una serie di diverse strategie di regolazione, che vanno dai sistemi di repressione/de-repressione agli attivatori in grado di rilevare e rispondere a un numero impressionante di effettori di piccole molecole o stimoli ambientali⁴. Di conseguenza, la biologia sintetica ha sfruttato questa diversità per costruire biosensori geneticamente codificati in grado di accoppiare una pletora di segnali di input in output su misura, ad esempio la produzione di proteine reporter fluorescenti e la regolazione dei percorsi sintetici. Se applicati nei flussi di lavoro biotecnologici, tali sistemi consentono il monitoraggio in tempo reale delle concentrazioni intracellulari di metaboliti, la regolazione dinamica dei percorsi e la facile lettura che aiuta nello sviluppo di percorsi, ceppi e bioprocessi più efficienti 5,6,7,8.

Fondamentalmente, i biosensori sono caratterizzati in base a una serie di parametri, tra cui specificità, intervallo operativo, intervallo dinamico, sensibilità e pendenza, con la curva dose-risposta di un biosensore che descrive questi parametri attraverso il segnale di uscita in funzione della concentrazione del ligando (Figura 1)9,10,11,12 . L'equazione di Hill può essere utilizzata per adattare le caratteristiche prestazionali di un biosensore, fornendo prove semi-empiriche per ciascuno dei parametri sopra descritti, fornendo così un mezzo per caratterizzare il sistema di biosensori e consentendo anche la valutazione degli sforzi necessari per mettere a punto il sistema verso risultati basati sull'applicazione. La specificità può essere definita come le differenze relative nell'uscita del segnale indotta da un effettore rispetto a una serie di altre potenziali molecole effettrici ed è tipicamente modulata a livello EBD dell'aTF. L'intervallo operativo è definito come l'intervallo di concentrazioni di ligandi che il biosensore è in grado di rilevare, determinando l'intervallo di concentrazioni a cui il biosensore sarà in grado di rispondere. L'intervallo dinamico, al contrario, descrive il rapporto tra lo stato di attivazione misurabile (ON) più alto e lo stato inattivato (OFF) ed è un parametro importante per garantire che il biosensore riporti in modo affidabile le concentrazioni degli effettori al di sopra dell'autofluorescenza^{di fondo 10}. La sensibilità per la molecola effettrice è descritta come la concentrazione richiesta per suscitare un certo segnale di uscita, misurata dalla concentrazione semimassima (EC₅₀) dell'effettore¹³. Infine, la pendenza della curva è indicata dalla cooperatività (n_H) dell'aTF per il suo sito operatore presso il promotore e si traduce in un profilo di uscita di risposta più digitale o analogico. La cooperatività deriva dalle interazioni proteina-proteina tra aTF legati al ligando che formano complessi multimerici che rafforzano l'affinità per il sito operatore, con conseguente forte aumento della responsività del circuito con la saturazione delle concentrazioni di ligando e un profilo di risposta più digitale¹⁴.

Le caratteristiche dose-risposta di un biosensore possono influenzare in modo significativo l'idoneità delle sue applicazioni e sono spesso un punto di svolta per qualsiasi applicazione concettuale. Le prestazioni del biosensore possono variare enormemente da sistema a sistema, con l'intervallo operativo che varia tipicamente da 0,1 nM a 10 mM¹³, mentre gli intervalli dinamici possono variare da 1,4 a 2000 volte¹⁵. Inoltre, mentre il numero di composti effettori riportati per gli aTF è ampio (prodotti metabolici, aminoacidi, metalli, antibiotici, quorum sensing, ecc.)¹¹, non è onnicomprensivo, presentando sfide ai ricercatori quando un biosensore adatto per il loro effettore non esiste già in letteratura. La biologia sintetica ha permesso l'ingegnerizzazione di biosensori che affrontano tali sfide, consentendo la regolazione dell'ambito dell'effettore e delle caratteristiche dose-risposta per allinearsi più strettamente con i risultati della ricerca dell'applicazione, ed è stata utilizzata per affrontare entrambi i problemi sopra menzionati, rispettivamente^16,17. Due aree chiave per l'ingegneria sono bersagliabili attraverso la biologia sintetica, la regione promotrice del biosensore e l'aTF stesso, mediando i loro effetti a livello trascrizionale e proteico. Gli approcci che si concentrano sugli elementi genetici del biosensore al fine di modulare le prestazioni a livello di promotore, includono l'ingegnerizzazione dell'RBS, dei siti operatore e -35, -10 (hexbox) al fine di regolare la sensibilità, le gamme operative e dinamiche, e sono il fulcro della metodologia delineata in questo manoscritto (Figura 1). In alternativa, la modifica della selettività e della sensibilità del biosensore attraverso l'analisi del suo dominio di legame dell'effettore e la mutazione dei residui coinvolti nella coordinazione effettrice (utilizzando l'omologia di sequenza e/o la biologia strutturale) può modulare la sua risposta a un effettore affine 18,19,20 o cambiarla completamente verso un effettore di interesse non affine 16,17,21. Tali sforzi di ottimizzazione possono quindi indirizzare i biosensori verso applicazioni specifiche, che sono comunemente controller metabolici (cicli di feedback, circuiti di controllo), strumenti di screening primari (scoperta di enzimi o ceppi), strumenti di screening secondari (screening di varianti enzimatiche, ingegneria metabolica) e bioprospezione di trasportatori 22,23,24. Uno di questi esempi prevede l'uso di un aTF sensibile all'acido muconico, CatM, combinato con una sequenza di promotori ingegnerizzata per migliorare la gamma dinamica e operativa. Questo sistema è stato integrato con la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza per isolare i ceppi più efficaci per la produzione di acido muconico basati sulla fluorescenza GFP dopo l'evoluzione adattativa del laboratorio²⁵.

Sebbene il successo delle strategie ingegneristiche sopra descritte sia evidente, le interdipendenze delle leve a disposizione di un biologo sintetico per mettere a punto i biosensori possono complicare il processo di progettazione e prolungare il periodo trascorso nello sviluppo dei biosensori, il che può dissuadere alcuni ricercatori dall'implementare i biosensori nei propri flussi di lavoro. Come illustrato nella Figura 1, i tentativi di sintonizzare un biosensore verso un particolare risultato attraverso la modifica delle scatole esagonali possono inavvertitamente attenuare altri parametri, essendo questa interdipendenza una sfida riconosciuta nell'ingegneria dei biosensori¹². Gli approcci comuni di messa a punto dei biosensori consistono nella progettazione razionale e nell'ingegneria dell'evoluzione diretta, con la prima che si basa sulla comprensione a priori delle caratteristiche strutturali e meccanicistiche del sistema per concentrare la sperimentazione su componenti con un'alta probabilità di successo; mentre quest'ultimo si basa sulla mutagenesi randomizzata e sull'evoluzione naturale accoppiate a uno screening ad alto rendimento per selezionare le varianti che presentano caratteristiche ottimizzate 26,27,28,29,30. Sebbene efficaci, entrambe le tecniche soffrono anche di alcuni inconvenienti: l'ingegneria mirata, ad esempio, attraverso la sua focalizzazione su specifici elementi strutturali o funzionali, è incline a un'esplorazione limitata dell'intero spazio sperimentale e può ignorare gli effetti allosterici o secondari³⁰. La generazione e lo screening non mirati delle librerie, sebbene ideali per ottimizzare i progetti in modo non guidato, richiedono poco in termini di lavoro di progettazione iniziale (ad esempio, la progettazione e la generazione delle librerie), richiedono una propensione verso una mutazione utile. Senza tale bias, ci si aspetta che una percentuale molto più grande di mutazioni possa essere deleteria, richiedendo un maggiore screening³¹. Pertanto, gli approcci olistici che considerano non solo l'effetto primario delle parti costitutive del biosensore (aTF, RBS, siti operatore ed esagonali), ma anche il modo in cui questi componenti interagiscono tra loro per influenzare i parametri del biosensore sono molto interessanti.

La sperimentazione multivariata strutturata e le metodologie di modellazione statistica sono state ampiamente adottate nei flussi di lavoro dell'ingegneria di processo al fine di interrogare lo spazio sperimentale multidimensionale utilizzando il minor numero possibile di esperimenti. Questo approccio, che combina sperimentazione e modellazione, chiamato progettazione di esperimenti (DoE), consente in modo cruciale ai ricercatori di ottimizzare processi multivariabili complessi verso risultati definiti, senza richiedere un'ampia conoscenza a priori ^23,30. Sebbene tipicamente applicata all'ottimizzazione di variabili continue per le quali l'esplorazione sperimentale strutturata è più facile, la DoE è stata utilizzata anche nell'ottimizzazione delle vie metaboliche a livello genetico 31,32,33. Si tratta di una fase iniziale di screening in cui vengono selezionati i fattori ritenuti più importanti per il risultato desiderato, seguita da una fase di ottimizzazione in cui i fattori selezionati vengono regolati per ottenere l'output desiderato, in questo caso per ottimizzare specifici parametri del biosensore al fine di aumentarne l'ambito di applicazione. In modo critico, questa tecnica può essere accoppiata a piattaforme automatizzate di manipolazione dei liquidi per aumentare la produttività di screening fino a librerie di medie dimensioni di 10³ - 10⁴ per ottimizzare globalmente le prestazioni dei biosensori su base data-driven²³. Di seguito, descriviamo un protocollo per l'implementazione di un approccio all'ottimizzazione dei biosensori basato su DoE, assistito dalla robotica di manipolazione dei liquidi per semplificare la generazione di librerie, lo screening e la raccolta di dati per l'ottimizzazione globale della sensibilità dei biosensori.

Protocollo

1. Progettazione della parte RBS/promotore

1. Identificare gli elementi normativi specifici del biosensore che possono essere regolati sistematicamente come variabili continue nel processo DoE. Raggruppare questi elementi normativi in moduli distinti. Ciò può includere moduli che regolano il trasporto degli effettori, l'espressione del fattore di trascrizione e/o l'espressione genica di output. Assicurarsi che ogni modulo sia regolabile a livello trascrizionale e/o traduzionale da un promotore o da un RBS (ad esempio,_{RBS trans}, P_reg, RBS_out e P_out, rispettivamente).
2. Determinare i siti funzionali chiave all'interno di aree promotrici e RBS selezionate, ad esempio caselle esadecimali, siti operatore e sequenze RBS.
   NOTA: In letteratura esistono molti promotori e RBS caratterizzati per creare biblioteche a partire da 34,35,36. Tuttavia, per le sequenze di promotori non caratterizzate (tipicamente il promotore_{P reg}), vedere di seguito per ulteriori passaggi per individuare gli elementi di sequenza genetica sintonizzabili se non sono disponibili in letteratura.
   1. Localizzare altri operoni contenenti le sequenze del biosensore di interesse tramite ricerche BlastP dell'aTF con l'input di rilevamento desiderato. Estrarre la regione intergenica dell'aTF e i suoi geni regolati per ottenere sequenze di promotori.
      NOTA: La posizione e il numero di sequenze di promotori variano a seconda della classe di aTF utilizzata.
3. Utilizza più strumenti di allineamento delle sequenze e altri software per motivi per cercare nei promotori putativi motivi conservati come scatole esadecimali e siti degli operatori. Sulla base dell'analisi della sequenza del promotore, selezionare le sequenze nucleotidiche per la randomizzazione con basi degeneri, ad esempio, N = qualsiasi cosa, R = qualsiasi purina, Y = qualsiasi pirimidina, ecc.
   NOTA: I lettori sono indirizzati alla pubblicazione di origine per ulteriori dettagli sull'analisi del promotore e sulla randomizzazione delle basi²³.

2. Assemblaggio e convalida della libreria di parti

1. Progettare e ordinare primer che amplifichino in modo specifico il vettore di espressione desiderato per consentire l'inserimento di varianti di sequenza promotore/RBS a monte di un marcatore fluorescente (ad esempio, GFP). Diluire i primer liofilizzati all'arrivo a una concentrazione finale di 100 μM in H₂O deionizzato sterile.
   1. Assemblare la miscela di reazione PCR su ghiaccio in provette PCR secondo i parametri della polimerasi specifica. Assicurarsi che venga utilizzata una polimerasi ad alta fedeltà per prevenire il trasferimento di mutazioni nella spina dorsale del vettore di espressione. Regolare la temperatura di ricottura e il tempo di estensione in base alle esigenze dei primer e alla lunghezza del prodotto PCR desiderato.
   2. Analizza il prodotto PCR tramite elettroforesi su gel e purifica il vettore linearizzato utilizzando la purificazione PCR o un kit di estrazione su gel. Misurare la concentrazione di DNA vettore linearizzato e conservarlo a -20 °C.
2. Ordinare le librerie di varianti progettate (RBS o promotori) per l'inserimento nel vettore linearizzato come oligonucleotidi degeneri a singolo filamento con bracci di omologia plasmidica da 30 bp sia all'estremità 5' che a 3' per una ricombinazione omologa mirata nel vettore di espressione.
   1. All'arrivo, risospendere gli oligonucleotidi liofilizzati a una concentrazione finale di 100 ng/μl in H₂O deionizzato sterile.
3. Determinare i volumi per le quantità equimolari del vettore linearizzato e della libreria di varianti utilizzando calcolatori online. Assicurarsi che il volume finale della reazione ammonti a 20 μl e che venga utilizzato un rapporto molare di 2:1 tra inserto e vettore.
   1. Scongelare un'aliquota di master mix di assemblaggio Gibson commerciale (X2) su ghiaccio e assemblare la reazione in una provetta PCR secondo i volumi forniti dal calcolatore scelto.
      NOTA: Il master mix Gibson può essere preparato anche in laboratorio ^37,38.
   2. Aggiungere 10 μl di 2x Gibson master mix ai frammenti di DNA e incubare per 1 ora a 50 °C in un termociclatore o simile.
   3. Applicare tutti i 20 μL di prodotto di legatura a 200 μL di E. coli competente in una provetta da microcentrifuga. Incubare in ghiaccio per 30 minuti seguito da shock termico per 45 s a 42 °C.
   4. Rimettere le cellule nel ghiaccio per 2 minuti, aggiungere 800 μl di brodo super ottimale con mezzo di repressione dei cataboliti (SOC) alla provetta e lasciare che le cellule si riprendano per 1 ora a 37 °C in un incubatore agitante.
   5. Distribuire 50 μL di cellule trasformate su piastre di Petri per agar Luria-Bertani (LB) multiple da 60 mm con la relativa selezione di antibiotici. Incubare le piastre a 37 °C per 18 ore.
4. Controllare le piastre per i trasformanti, calcolare il numero di colonie che rappresentano 3 volte la diversità teorica della libreria per catturare una rappresentazione sufficiente di ciascuna variante. Ottimizza l'assemblaggio isotermico se il numero di colonie è basso/nullo.
   NOTA: Il sovracampionamento è necessario quando si considera una libreria ideale generata da reagenti o sintesi ad alta fedeltà. In genere è 3 volte maggiore della dimensione totale della libreria. Ad esempio, 4 posizioni di degenerazione (NNNN) = 4⁴ = 256 sequenze uniche. Pertanto, raschiare ~768 colonie.
   1. Raschiare il numero necessario di colonie in un unico pallone sterile da 125 ml contenente 25 ml di terreno LB integrato con antibiotici appropriati. Incubare il matraccio a 37 °C per 18 ore in un'incubatrice vibrante (180 giri/min), assicurandosi che la coltura sia visibilmente densa dopo questo tempo.
   2. Utilizzare un kit di purificazione midi-prep plasmidico per purificare la libreria di varianti dalla coltura trasformante preparata. Determinare la concentrazione del DNA della libreria plasmidica; Per le fasi a valle sono necessari 1-10 μg. Assicurarsi che il DNA della libreria sia eluito utilizzando H₂O deionizzato sterile.
      NOTA: I passaggi successivi a questo punto si concentreranno sulla clonazione e la convalida delle librerie di varianti nell'host di espressione Pseudomonas putida (P. putida); L'adattamento del protocollo ad altri ospiti può richiedere la modifica dei tempi di incubazione, delle temperature di incubazione e dei metodi di trasformazione.
5. Preparare una piastra di agar LB dell'ospite di espressione desiderata P. putida mediante striatura da un stock di glicerolo e incubazione della piastra a 30 °C per 18 ore.
   1. Prelevare una singola colonia di P. putida dalla piastra di agar LB, inoculare 10 ml di terreno LB e crescere a 30 °C per 18 ore, agitando a 180 giri/min.
   2. Preparare le cellule per l'elettrocompetenza centrifugando la coltura coltivata a 4000 x g a 18 °C per 2 minuti. Versare il surnatante, risospendere in 1 mL di H₂O deionizzato sterile e trasferire le cellule risospese in una provetta da microcentrifuga sterile.
      NOTA: Le cellule di P. putida dovrebbero apparire rosate quando pellettate.
   3. Centrifugare le cellule per 1 minuto a 4 x g in una microcentrifuga, versare il surnatante e risospendere in 1 mL di H₂O deionizzato sterile. Ripetere le fasi di centrifugazione e risospensione altre 4 volte.
      NOTA: La perdita di cellule può verificarsi quando si versa il surnatante durante il lavaggio; Questo è normale e non dovrebbe influire sulle rese.
   4. Trasferire 100 μl di cellule lavate in una cuvetta per elettroporazione da 0,2 cm, aggiungere 1-10 μg di DNA della libreria plasmidica alla cuvetta e mescolare.
   5. Accendere l'elettroporatore, assicurarsi che la tensione sia impostata su 2,5 kV per la cuvetta da 0,2 cm, inserire la cuvetta nella camera di elettroporazione e pulsare.
   6. Aggiungere 900 μl di terreno SOC alla cuvetta, miscelare e trasferire le cellule in una provetta sterile per microcentrifuga. Lasciare recuperare le cellule per 2 ore a 30 °C in un incubatore ad agitazione.
6. Distribuire 50 μl di cellule trasformate su grandi piastre di Petri quadrate (230 mm) di agar LB integrate con l'antibiotico pertinente e incubare a 30 °C per 18 ore.
   NOTA: Garantire una densità di colonie moderata sulle piastre della biblioteca (2-3 CFU/cm²). Ciò dipenderà dalla competenza batterica e dal volume di placcatura. Se troppo basso, l'ottimizzazione della trasformazione, o cicli successivi di trasformazione, possono essere utilizzati per aumentare il numero di colonie.
7. Seleziona tra 25-50 colonie da tutte le piastre trasformanti per la convalida della sequenza. Utilizzare primer che amplificano la sequenza degenerata, amplificare la regione mediante PCR e inviarla per il sequenziamento Sanger per valutare la diversità della sequenza e la policlonalità.
   NOTA: Se la policlonalità diventa problematica, la distribuzione delle trasformazioni su più lotti di cuvette con 1 μg di DNA può aiutare a ridurre questo effetto.

3. Screening clonale della libreria di parti - automazione

1. Configurazione del gestore di liquidi
   1. Create 7 programmi su una piattaforma di gestione dei liquidi per garantire che le fasi di pipettaggio intensivo siano banalizzate.
   2. Creare un programma "MTP Liquid Transfer", assicurarsi che il gestore di liquidi sia impostato per pipettare un volume regolabile da un serbatoio preparato in piastre per microtitolazione (MTP) vuote nel suo layout.
   3. Creare un programma "Aggiungere glicerolo a MTP", assicurarsi che il gestore di liquidi sia programmato per pipettare un volume di 100 μL di glicerolo al 50% in piastre, assicurarsi che la velocità di dispensazione e aspirazione sia di 5-20 μL/s.
      NOTA: Viene creato un programma separato per tenere conto della viscosità più elevata del glicerolo al 50%, che può portare alla formazione di bolle, all'aspirazione incompleta o alla contaminazione incrociata dei pozzetti vicini a causa di schizzi se non controllata.
   4. Creare un programma "DWB Liquid Transfer", impostare il gestore di liquidi per pipettare in blocchi di pozzetti profondi (DWB) con un'impostazione del volume regolabile e assicurarsi che il gestore di liquidi pipetta da un serbatoio preriempito.
   5. Creare un programma "Inoculare da MTP scongelato", assicurarsi che il gestore del liquido sia programmato per aspirare 5 μL da MTP scongelato contenente le colonie selezionate e trasferirlo nelle piastre DWB corrispondenti nel layout.
      NOTA: Prestare molta attenzione alla disposizione MTP e DWB nel layout, garantendo un ordine logico degli eventi per evitare doppie inoculazioni accidentali o piastre mancanti.
   6. Creare un programma "Trasferisci al saggio DWB", assicurarsi che il gestore del liquido sia impostato per trasferire 5 μL di cellule da una posizione della piastra DWB a un'altra posizione della piastra DWB. Il programma deve quindi ripetere questa azione 4 volte ad ogni trasferimento inoculando una diversa posizione della piastra, ad esempio P1 -> P2, P1 -> P3, ecc.
      NOTA: Questo programma garantisce la sottocoltura senza soluzione di continuità di 96 varianti in diverse concentrazioni di saggio.
   7. Creare un programma "Assay Setup - PBS Resuspension (DWB)", assicurarsi che il gestore del liquido pipetti ogni DWB nel layout con 500 μL di PBS, il programma deve includere anche una fase di miscelazione per garantire che i pellet cellulari siano correttamente risospesi.
   8. Creare un programma "Assay Setup - Cells and PBS Addition (MTP)", assicurarsi che questo programma includa un passaggio per trasferire 200 μL di cellule risospese da una posizione della piastra DWB a una posizione MTP vuota.
      NOTA: Per tutti i passaggi della versione 3.1, la programmazione e i layout dei gestori di liquidi variano; I ricercatori dovrebbero fare riferimento ai manuali di specifici gestori di liquidi commerciali per modificare i programmi di cui sopra per adattarli alla capacità e alle esigenze dell'esperimento.
2. Selezione di librerie di varianti e codici a barre
   1. Determinare la dimensione teorica della libreria e calcolare il numero di singole varianti per garantire > copertura della libreria del 95% (si consiglia una dimensione della libreria 3x) (vedere la nota per il passaggio 2.5.).
   2. Calcolare il volume richiesto di terreni LB integrati con antibiotici in base al numero di colonie da sottoporre a screening (200 μL per colonia + 10% in più).
   3. Aprire il software di gestione dei liquidi e fare clic su Esegui accanto al programma MTP Liquid Transfer (vedere File supplementare 1). Posizionare il materiale preparato nella posizione del serbatoio corrispondente e riempire il ponte con MTP vuoti secondo il layout. Impostare il programma per erogare 200 μL di terreno. Fare clic su OK per confermare l'avvio del programma.
      NOTA: Assicurarsi sempre che i serbatoi e le punte siano adeguatamente forniti alla piattaforma di erogazione dei liquidi prima di confermare l'avvio del programma per evitare interruzioni.
   4. Ripetere il programma tutte le volte che è necessario, sigillare gli MTP riempiti con una membrana traspirante per mantenere la sterilità.
   5. Trasferire le piastre MTP riempite su una piattaforma di raccolta delle colonie e aprire, trasferire anche le piastre quadrate di P. putida trasformate con il DNA della libreria di varianti plasmidiche alla piattaforma di selezione delle colonie. Utilizzare il raccoglitore di colonie per inoculare ciascuno dei pozzetti preriempiti della piastra di microtitolazione con una singola colonia dalle piastre della libreria dei trasformanti.
      NOTA: Assicurarsi che la profondità minima dell'agar sia di 25 ml per evitare di danneggiare la testa di raccolta delle colonie.
   6. Richiudere e trasferire le piastre inoculate in un incubatore offline con agitazione a 30 °C (800 giri/min), assicurandosi che il controllo dell'umidità sia abilitato al 75% per evitare l'evaporazione della coltura. Lasciarli crescere per 16 ore.
      NOTA: Dopo l'incubazione, le colture appariranno visibilmente dense all'occhio, in caso contrario, ricontrollare i requisiti dei terreni e degli antibiotici.
   7. Dopo 16 ore di crescita, rimettere le piastre coltivate sulla piattaforma di movimentazione dei liquidi e aprirle. Fare clic su Esegui accanto al protocollo Aggiungi glicerolo a MTP (vedere File supplementare 1), assicurarsi che il layout della piastra sullo schermo corrisponda a quello del dock del gestore di liquidi. Fare clic su OK e consentire l'esecuzione del protocollo.
   8. Una volta terminate, sigillare nuovamente le piastre e mescolare brevemente in un'incubatrice ad agitazione offline (800 giri/min) per 5 minuti prima di codificare a barre e conservare a -80 °C.
   9. Ripetere i passaggi 3.2.7. e 3.2.8. fino a quando tutti gli MTP non hanno avuto l'aggiunta di glicerolo, sono stati miscelati, codificati a barre e conservati a -80 °C.
      NOTA: A questo punto è possibile mettere in pausa il protocollo per prepararsi alle fasi di caratterizzazione riportate di seguito. Inoltre, il blocco delle piastre in diverse corse sperimentali può essere pianificato per adattarsi alla capacità della piattaforma di movimentazione dei liquidi in uso o per ridurre il carico di lavoro in una sola seduta.
3. Screening della libreria di varianti
   1. Calcolare il volume richiesto di terreni integrati con antibiotici per il numero di DWB da riempire (~495 μL per pozzetto + 10% in più).
   2. Fare clic su Esegui accanto al programma DWB Liquid Transfer (vedere File supplementare 1), assicurarsi che il fluido sia stato aggiunto al serbatoio corretto nel layout del programma. Assicurarsi che i DWB vuoti vengano aggiunti alle posizioni di layout corrispondenti e che sia disponibile una fornitura adeguata di suggerimenti. Impostare il programma per erogare 495 μL di fluido. Quando si è pronti, fare clic su OK per avviare il programma.
   3. Sigillare i DWB riempiti con una membrana traspirante e trasferirli in un deposito temporaneo a 4 °C, ripetendo il passaggio 3.3.2. fino a quando il numero richiesto di DWB non è stato riempito con i supporti.
   4. Fare clic su Esegui accanto al programma Incoculato da MTP scongelato (vedere File supplementare 1), assicurarsi che le crioscorte MTP e i DWB riempiti vengano trasferiti alla piattaforma di gestione dei liquidi secondo il layout. Assicurarsi che sia fornita una scorta sufficiente di punte. Fare clic su OK per inizializzare il programma.
      NOTA: Scongelare le piastre di riserva sul ghiaccio per 30 minuti, solo dopo che i programmi e le piastre preliminari sono stati preparati per garantire una vitalità ottimale delle cellule.
   5. Al termine del programma, sigillare i DWB inoculati durante la notte con una membrana traspirante e trasferirli in un incubatore con agitatore a piastre offline con controllo dell'umidità del 75% e lasciarli crescere durante la notte per 16 ore a 30 °C (180 giri/min).
   6. Richiudere, miscelare e riportare gli MTP criogenici nel congelatore a -80 °C come indicato al punto 3.2.8.
   7. Ripetere i passaggi 3.3.4. al punto 3.3.6. il numero di volte necessario fino a quando il numero richiesto di DWB durante la notte è stato inoculato e trasferito all'incubatrice.
      NOTA: Si consiglia di registrare quando ogni lotto di piastre viene aggiunto all'incubatrice per tenere conto del ritardo tra le corse durante l'inoculazione e di utilizzare lo stesso ordine per le fasi a valle.
   8. Calcolare il volume richiesto di terreni integrati con diverse concentrazioni di effettore e antibiotico in base al numero di DWB da sottoporre a screening durante la notte (495 μL per pozzetto + 10% in più). Ogni concentrazione dell'effettore richiede il proprio serbatoio separato nel gestore del liquido.
      NOTA: Per la caratterizzazione iniziale, come lo screening ON/OFF, sono sufficienti due concentrazioni di effettori (ad esempio, 0 e 1000 μM di concentrazione finale). Al fine di generare dati dose-risposta per una caratterizzazione più robusta, questo intervallo viene aumentato a un minimo di quattro concentrazioni (ad esempio, 0, 1, 25 e 1000 μM di concentrazione finale). I sistemi repressori non richiedono l'aggiunta di un effettore per accertare la funzione, mentre per gli attivatori, come il sistema delineato, è necessario un effettore.
   9. Fare clic su Esegui accanto al programma DWB Liquid Transfer (vedere File supplementare 1). Assicurarsi che i serbatoi contenenti mezzi integrati con effettore siano nelle posizioni corrette, secondo il layout. Aggiungere DWB vuoti nella piattaforma di gestione dei liquidi. Assicurati che la piattaforma disponga di mance sufficienti. Quando si è pronti, fare clic su OK per avviare il protocollo per generare i DWB del saggio.
   10. Dopo il riempimento, sigillare i DWB del test con una membrana traspirante e trasferirli in uno stoccaggio temporaneo a 4 °C, quindi riempire la piattaforma di movimentazione dei liquidi con altre piastre vuote.
   11. Ripetere i passaggi 3.3.9 e 3.3.10 tutte le volte necessarie fino a riempire il numero richiesto di DWB.
   12. Fare clic su Esegui accanto al programma Trasferisci al saggio DWB (vedere File supplementare 1). Assicurarsi che i DWB del saggio non sigillati contenenti terreni integrati con effettore vengano aggiunti nelle posizioni corrette nel layout del gestore del liquido.
   13. Trasferire e aprire i DWB notturni contenenti P. putida adulta inoculata al punto 3.3.4. alla piattaforma di movimentazione dei liquidi, assicurandosi ancora una volta che il layout sia rigorosamente rispettato. Assicurati che la piattaforma disponga di mance sufficienti. Quando si è pronti, fare clic su OK per avviare il protocollo.
       NOTA: Il trasferimento e l'array delle sottocolture nelle piastre di analisi devono in genere essere eseguiti in lotti a seconda delle dimensioni della piattaforma di gestione dei liquidi.
   14. Al termine del programma, applicare i sigilli e trasferire le piastre di analisi in un incubatore offline a 30 °C, con un'umidità del 75% per 16 ore (180 giri/min), il volume finale del saggio sarà di 500 μl in questa fase.
   15. Scartare i DWB durante la notte dopo l'inoculazione e ripetere i passaggi da 3.3.12 a 3.3.14 come richiesto fino a quando tutti i DWB del test richiesti sono stati inoculati e stanno crescendo in incubatori offline.
   16. Togliere i DWB dall'incubatore, trasferirli in una centrifuga e pellettare le celle a 4000 x g, 18° C per 5 min. Versare il surnatante e posizionare i DWB centrifugati sulla piattaforma di erogazione dei liquidi.
       NOTA: I volumi dei pellet cellulari possono variare a seconda della concentrazione o della variante dell'effettore, inoltre alcuni pellet possono apparire più visibilmente fluorescenti all'occhio rispetto ad altri.
   17. Calcolare il volume di 1x PBS richiesto in base al numero di DWB da vagliare (500 μL per pozzetto + 10% in più).
   18. Fare clic su Esegui accanto al programma Assay Setup - PBS Resuspension (DWB) (vedere File supplementare 1), impostare il volume di dispensazione su 500 μl, assicurarsi che 1x PBS sia aggiunto al serbatoio corretto, quindi disporre le piastre centrifugate in base al layout del gestore del liquido. Assicurarsi che siano disponibili suggerimenti sufficienti. Fare clic su OK per avviare il programma.
       NOTA: Il lavaggio delle cellule viene eseguito per rimuovere i mezzi di crescita residui, che possono produrre una certa autofluorescenza.
   19. Richiudere e rimuovere le piastre risospese dal gestore del liquido. Assicurarsi che i pellet siano completamente risospesi controllando la parte inferiore della piastra. Continuare a trasferire i DWB pellettati al gestore di liquidi e ripetere il passaggio 3.3.18. fino a quando tutte le piastre non sono state risospese.
   20. Fare clic su Esegui accanto al programma Assay Setup - Cells and PBS addition (MTP) (vedere File supplementare 1). Trasferire i DWB risospesi dal passaggio 3.3.18. nel gestore del liquido secondo il layout suggerito. Trasferire gli MTP vuoti nel gestore di liquidi secondo il layout. Assicurarsi che il volume di erogazione sia impostato su 200 μl e che siano disponibili puntali sufficienti. Fare clic su OK per avviare il programma.
   21. Trasferimento di MTP riempiti (volume finale del saggio 200 μL) a un lettore di piastre multimodale offline, misurazione della fluorescenza relativa a una lunghezza d'onda di emissione di eccitazione appropriata (ad esempio, sfGFP lEx/lEm = 488/520) e OD₆₀₀ per ciascun pozzetto nella piastra.
       NOTA: Le impostazioni della lunghezza d'onda dell'emissione di eccitazione dipenderanno dalla scelta del gene fluorescente codificato nel vettore di espressione. Assicurarsi che le impostazioni di guadagno sul lettore di piastre siano coerenti in tutto e consentire la discriminazione tra varianti basse e alte senza saturare il rivelatore.
   22. Ripetere i passaggi 3.3.20. e 3.3.21. fino a quando tutti i DWP dei saggi non saranno stati trasferiti agli MTP e misurati.

4. Elaborazione/trasformazione dei dati e classificazione differenziale

1. Eseguire una normalizzazione dei dati raccolti dividendo la fluorescenza GFP (RFU) registrata per la misurazione OD₆₀₀ registrata per ciascuna variante per ciascuna delle concentrazioni effettrici valutate (0 e 1000 μM).
   NOTA: La maggior parte dei lettori di piastre può essere programmata per normalizzare automaticamente la fluorescenza con OD₆₀₀ durante la raccolta dei dati.
2. Calcolare ON/OFF per ottenere l'intervallo dinamico di ciascuna variante dividendo l'RFU/OD₆₀₀ a 1000 μM (ON) per l'RFU/OD₆₀₀ a 0 μM (OFF). Tracciare tutti i valori ON/OFF delle varianti come grafico a dispersione utilizzando l'ON/OFF del costrutto del biosensore di base per determinare le varianti che mostrano un'attività superiore al livello di base.
   NOTA: L'ON/OFF del costrutto iniziale del biosensore utilizzato nel protocollo è stato determinato essere 3,6 volte in base alla caratterizzazione iniziale della sequenza wild-type²³.
3. Per una caratterizzazione approfondita, adattare i dati dose-risposta utilizzando una funzione Hill con pendenza variabile per estrarre i valori EC50 e/o Hill slope utilizzando il software analitico.
   NOTA: Per stimare la sensibilità e l'EC₅₀, raccogliere almeno quattro punti dati che coprono l'intervallo in cui la risposta passa da un'attivazione bassa a un'attivazione, in genere la parte più ripida della curva. Mentre più punti dati migliorano la risoluzione e l'accuratezza, quattro punti sono sufficienti per stimare la classificazione della sensibilità.
4. Dall'insieme completo di varianti, selezionare un sottoinsieme di varianti (ad esempio, N = 100) garantendo una copertura equilibrata delle classifiche desiderate, in questo caso EC₅₀. A tal fine, identificare le varianti che coprono un ampio intervallo nell'EC₅₀, assicurandosi che le varianti di alto e basso rango siano rappresentate proporzionalmente. Rimuovi le varianti ridondanti (ad esempio, quelle con classifiche simili e con un impatto minimo sulla copertura della distribuzione).
5. Dopo aver selezionato la libreria di campioni di varianti finale (ad esempio, N = 100), trasformare i dati utilizzando la seguente equazione di trasformazione lineare-logaritmica (lin-log) (Eq.1).
   Eq.1:
   
   dove
   
   
   
6. Per i valori EC50, assegnare +1 per il più alto (meno sensibile) e -1 per il più basso (più sensibile). Una media geometrica pari a 0 corrisponde a livelli di espressione intermedi.

5. Generazione definitiva del progetto di vagliatura/DoE

1. Per esplorare sistematicamente lo spazio di progettazione dei biosensori, utilizzare un Definitive Screening Design (DSD). Questo design è preferito per la sua capacità di esplorare lo spazio di progettazione in modo efficiente, adattando lo studio alle specifiche esigenze del sistema.
2. Fare clic sulla categoria DOE e quindi selezionare il pulsante Disegno di screening definitivo nel software statistico (vedere File supplementare 2).
3. Definire i fattori sperimentali (ad esempio, RBS_trans , P_reg , RBS_out e P_out) come variabili continue facendo clic sul pulsante Continuo e denominandoli, assicurandosi di impostare i valori su +1 e -1 (vedere il file supplementare 3).
4. Definire le risposte desiderate (ad esempio, ON , OFF , ON/OFF , EC50 , Pendenza) facendo clic sul pulsante Aggiungi risposta e personalizzando il nome (vedere File supplementare 4).
   NOTA: Imposta l'obiettivo della risposta facendo clic sul menu a discesa dell'obiettivo, seleziona Nessuno o Ingrandisci a seconda dell'obiettivo del progetto (ad esempio, esplorazione o ottimizzazione).
5. Una volta definiti i fattori e le risposte, fare clic su Continua per aprire la scheda delle opzioni di progettazione. Selezionare Nessun blocco richiesto, quindi fare clic sul pulsante Crea disegno (vedere File supplementare 5).
   NOTA: È possibile aggiungere blocchi per isolare il progetto da fattori di disturbo (fattori non di interesse primario). Questo può aggiungere complessità agli esperimenti; tuttavia, viene utilizzato a discrezione del ricercatore.
6. Il software genererà una tabella di progettazione sperimentale che delinea le specifiche combinazioni di fattori da testare. Le parti genetiche delle corrispondenti librerie trasformate lin-log saranno utilizzate per generare i corrispondenti 17 costrutti. Salvare ed esportare la tabella dati facendo clic su Crea tabella (vedi File supplementare 6).

6. Ripetere il passaggio 2 - Progettazione e assemblaggio di disegni genetici informati dal DoE

1. Iniziare a costruire i plasmidi multivariabili secondo il piano Definitive Screening Design (DSD).
   1. Identificare una variabile iniziale (ad esempio, promotore, RBS, ecc.). Progettare e ordinare primer per linearizzare il vettore di espressione, assicurarsi che i primer fiancheggiano la regione variabile mirata, garantendo la rimozione di eventuali elementi di sequenza preesistenti.
   2. Progetta e ordina primer che amplifichino in modo specifico le sequenze di varianti corrispondenti ai livelli di libreria predefiniti (ad esempio, -1, 0, +1) per ciascun nodo regolatorio (P_out P_reg RBS_out RBS_trans). Assicurarsi che ogni primer includa bracci di omologia da 30 bp complementari al sito di inserimento del vettore di espressione.
   3. Purificare il DNA plasmidico dalla coltura criogenica pertinente corrispondente ai livelli di libreria +1, 0 e -1 per la variabile identificata tramite miniprep.
2. Impostare le reazioni PCR per il vettore di espressione linearizzato e i frammenti della libreria su ghiaccio e determinare la concentrazione del prodotto come descritto nelle fasi 2.1.1 e 2.1.2.
   1. Ripetere i passaggi da 2.3 a 2.4 del protocollo per eseguire l'assemblaggio Gibson del vettore di espressione linearizzato e dei frammenti di libreria. Assicurarsi che in questa fase vengano utilizzate piastre di Petri di dimensioni standard.
   2. Esamina le colonie utilizzando il sequenziamento Sanger per confermare il corretto assemblaggio del costrutto per ciascuno dei progetti DSD suggeriti, quindi procedi alla trasformazione di P. putida (passaggi 2.5 - 2.6).
   3. Utilizzando la PCR, confermare la presenza del plasmide corretto nelle colonie trasformate. Prelevare i trasformanti confermati e inoculareli in 10 mL di LB integrati con antibiotico per la crescita notturna a 30 °C per 18 ore (180 giri/min). Creare criostock (25% glicerolo finale) e conservare a -80 °C.

7. Screening e razionalizzazione dei dati

1. Da crio-ceppi, striare la P. putida trasformata con i relativi costrutti di design DSD su agar LB integrato con antibiotico, incubare a 30 °C per 18 ore durante la notte per far crescere le colonie.
   1. Prelevare tre colonie singole da ciascuna piastra corrispondenti ai disegni DSD suggeriti e coltivare per una notte in 10 mL di terreno LB integrato con antibiotico a 30 °C per 18 ore.
   2. Il giorno seguente, caricare un DWB con un gradiente di concentrazione dell'effettore compreso tra 0 mM e 1 mM (concentrazione finale) per riga per un volume totale di 50 μL per pozzetto. Diluire le colture notturne 1/100 in LB fresco e aggiungere 450 μL di coltura al DWB attraverso il gradiente di concentrazione.
   3. Ripetere manualmente i passaggi 3.3.14 e 3.3.16 per ottenere DWB aumentati, quindi passare ai passaggi 3.3.18, 3.3.20 ed eseguire manualmente. e 3.3.21. per ottenere dati RFU/OD per ciascuna variante suggerita.
2. Adattare i dati dose-risposta (RFU/OD) utilizzando una funzione di collina (con pendenza variabile), estraendo i parametri appropriati (fattori) per l'ottimizzazione, come EC₅₀, pendenza collinare, intervallo dinamico o intervallo operativo. Trasforma i dati risultanti in log10 e inserisci i parametri estratti nella tabella DSD per ciascuno dei progetti testati.
   1. Eseguire un'analisi di screening a due livelli per identificare i fattori significativi che influenzano le prestazioni del biosensore. Utilizzare il rapporto t di Lenth e l'analisi del grafico seminormale^{23, 30} per determinare quale fattore si discosta dalla distribuzione prevista e da mantenere nel modello. Mantenere l'effetto dell'ereditarietà, assicurandosi che ogni fattore significativo solo nell'interazione sia incluso anche individualmente.
   2. Condurre la modellazione standard della regressione dei minimi quadrati (SLSR)³⁰ per ciascuna variabile di risposta in modo indipendente, incorporando solo i fattori significativi identificati. Valuta la diagnostica del modello di regressione, inclusi i grafici residui, i test di mancanza di adattamento e i valori R², per garantire il corretto adattamento dei dati.
   3. Utilizzare un profiler di risposta per determinare le impostazioni ottimali dei fattori in base alle caratteristiche desiderate del biosensore. Definire le funzioni obiettivo per ogni risposta (ad esempio, massimizzare la gamma dinamica riducendo al minimo EC₅₀) per generare impostazioni fattoriali che raggiungano il miglior equilibrio tra tutte le risposte, considerando i vincoli e i compromessi del sistema.
3. Torna alle librerie di varianti e costruisci il biosensore ottimizzato secondo i moduli suggeriti dal profiler di risposta, seguendo i passaggi da 6.1 a 6.2 del protocollo. Convalidare le prestazioni del costrutto ottimizzato tramite la caratterizzazione dose-risposta.

Risultati

Inizialmente, i moduli che si pensa abbiano un impatto sulla funzione del biosensore devono essere selezionati per la variazione; ciò può includere la regolazione delle proteine di trasporto, che possono influenzare la concentrazione intracellulare dei ligandi e quindi l'output del biosensore, ma include anche i livelli relativi di trascrizione e traduzione dell'aTF stesso, nonché il reporter fluorescente o il gene di output (Figura 1). La Figura 2 mostra un tipico flusso di lavoro utilizzato nello sviluppo di un esperimento basato su DoE per l'ottimizzazione dei biosensori; a partire dall'organizzazione degli elementi regolatori in moduli distinti suscettibili di manipolazione tramite la biologia sintetica attraverso cambiamenti a livello di sequenza, in particolare nei siti operatori, nelle scatole esadecimali o negli RBS (Figura 2A). Pertanto, il passo successivo nel flusso di lavoro DoE è la randomizzazione dei siti di sequenza al fine di generare librerie di varianti (Figura 2B). Il grado di randomizzazione deve essere attentamente considerato, poiché il numero di colonie sottoposte a screening dovrebbe essere proporzionale al grado di randomizzazione 4^N, dove N è uguale al numero di posizioni di base randomizzate. Trattare ogni promotore unico o sequenza RBS come una variabile categoriale unica in DoE aumenterebbe il numero di costrutti richiesti a livelli sperimentalmente non fattibili, poiché tale conversione in variabili continue attraverso la caratterizzazione delle librerie è un passaggio di triage necessario per misurare l'intervallo di funzioni acquisite attraverso la randomizzazione e per definire il superiore, medio, e limiti inferiori di funzionalità. Ciò si ottiene in primo luogo attraverso l'analisi dell'output delle librerie come misura della forza della variante RBS o del promotore attraverso un gene reporter (Figura 2C). Viene eseguita una trasformazione lin-log, come mostrato, per discretizzare le variabili continue in livelli che possono essere utilizzati da DoE per esplorare diverse combinazioni e sviluppare un modello che descriva gli effetti di queste varianti. Viene quindi implementato un disegno di screening utilizzando 3 livelli che descrivono l'intervallo di attività per ciascun fattore in modo combinatorio (Figura 2D). Attraverso l'assemblaggio e il collaudo dei progetti suggeriti, lo spazio sperimentale viene esplorato in modo efficiente e le interazioni tra i fattori rivelate. L'analisi statistica dei dati risultanti viene utilizzata per determinare quale combinazione di fattori ha l'effetto più significativo sull'output del biosensore, mentre l'SLSR viene utilizzato per prevedere il comportamento del sistema in base a diversi criteri, facilitando l'ottimizzazione del biosensore verso risultati specifici come l'aumento della gamma dinamica o della sensibilità (Figura 2D).

Figura 3 dimostra l'assemblaggio e lo screening di una libreria di promotori regolamentata aTF. L'assemblaggio isotermico utilizzando un oligonucleotide degenere è stato eseguito per creare una libreria codificata in plasmidi, in cui ogni plasmide è randomizzato in modo univoco in posizioni specifiche. Il grado di diversità delle biblioteche determinerà in ultima analisi il numero di colonie da esaminare, con librerie teoriche di dimensioni maggiori che trarranno grandi benefici dall'automazione. L'analisi della sequenza del promotore di operoni omologhi a TphR ha fornito una mappa della conservazione delle basi che è stata utilizzata per informare le posizioni di randomizzazione, in particolare le basi che hanno mostrato un certo grado di variazione e quindi possono modulare l'attività senza essere assolutamente essenziali²³. Tre basi in ciascuna delle scatole esagonali -35 e -10 sono state prese di mira per una randomizzazione completa, oltre a sei basi nel sito dell'operatore (Figura 3A), risultando in una libreria teorica di ~500.000. La libreria plasmidica è stata successivamente utilizzata per trasformare il ceppo ospite. In questa fase, una buona efficienza di trasformazione è fondamentale per ottenere una copertura sufficiente della libreria con gli approcci comuni alla risoluzione dei problemi illustrati in Figura 3B. L'ottimizzazione delle concentrazioni di DNA, il metodo di trasformazione e la progettazione del clonaggio possono migliorare significativamente la resa dei trasformanti. Figura 3C Dimostra un flusso di lavoro tipico Dopo l'ottenimento di trasformanti, le singole colonie corrispondenti a varianti uniche devono essere coltivate in terreni prima di poter iniziare qualsiasi lavoro di caratterizzazione. Al fine di coprire le dimensioni teoriche della libreria, sarà necessario scegliere un vasto numero di varianti e disporle in piastre. L'utilizzo di sistemi automatizzati come i gestori di liquidi e i raccoglitori di colonie può banalizzare questo passaggio ad alta intensità di lavoro. Passaggio 1 di Figura 3C illustra il trasferimento dei terreni di coltura in MTP che sono stati caricati manualmente nella banchina di gestione dei liquidi, seguito dall'inoculazione automatizzata da parte di un raccoglitore di colonie. Alcune fasi, come la sigillatura delle piastre e il loro trasferimento su incubatori offline, sono manuali ma possono anche essere automatizzate se lo si desidera. A seguito della crescita delle colture, i manipolatori di liquidi possono essere utilizzati anche per generare crio-stock attraverso l'aggiunta di glicerolo, come mostrato in Figura 3C. In questa fase, la codifica a barre delle piastre garantirà che ogni variante prelevata sia collegata a una specifica piastra e posizione del pozzo, consentendo una facile referenziazione per un'ulteriore caratterizzazione a valle. Uno dei principali vantaggi degli approcci automatizzati, oltre alla riduzione del lavoro, è la riduzione dell'errore umano, con meno probabilità di riportare avanti gli errori nella fase di preparazione della biblioteca. Passaggio 2 di Figura 3C illustra la fase di caratterizzazione automatizzata della preparazione della libreria. Questo inizia via il riempimento dei DWB con i terreni utilizzando la piattaforma di movimentazione dei liquidi, seguito dall'inoculazione con i crio-stock con codice a barre. L'automazione in questa fase garantisce ancora una volta che gli errori di pipettaggio e la manodopera siano ridotti al minimo. Le piastre vengono quindi sigillate e trasferite manualmente in incubatori offline per la crescita, a quel punto è possibile avviare l'array di composti effettori in piastre a pozzetti profondi fresche. Ai fini di una schermata iniziale delle librerie di parti, può essere auspicabile una semplice schermata ON/OFF in quanto può essere utilizzata per preselezionare le varianti non funzionali che mostrano un'attività uguale o peggiore rispetto al costrutto di base e arricchire il pool di varianti per quelle che mostrano un'attività migliorata. Ciò ha l'ulteriore vantaggio di ridurre i costi dei materiali di puntali e piastre, che possono diventare proibitivi nei protocolli di screening delle grandi librerie. Tuttavia, dove è richiesta l'ottimizzazione di metriche delle prestazioni dei biosensori più complesse (ad esempio, EC₅₀), saranno necessarie ulteriori concentrazioni di effettori. Dopo la crescita delle colture, le piastre vengono rimesse nella piattaforma di gestione dei liquidi, che inizia a inoculare le piastre contenenti i composti effettori prima di essere nuovamente rimesse manualmente nell'incubatore per tutta la durata del saggio. Figura 3D Illustra la fase finale dell'automazione prima della raccolta dei dati. Dopo il periodo trascorso per la crescita e l'attivazione del biosensore, le piastre vengono rimosse dall'incubatore offline e reinserite nella piattaforma di gestione dei liquidi. Per rimuovere i terreni di crescita residui, che possono interferire con la raccolta dei dati di fluorescenza, sono necessari la centrifugazione, la rimozione del surnatante e il lavaggio delle cellule con 1x PBS. L'uso di manipolatori di liquidi può ancora una volta banalizzare questo processo, con la risospensione automatizzata delle colture che consente un rapido trattamento delle piastre, compreso il trasferimento delle cellule lavate in MTP in formato a 96 pozzetti per lo screening. La raccolta dei dati può essere eseguita in modo manuale o automatizzato, con alcuni lettori dotati di pile di piastre in grado di interfacciarsi con i gestori di liquidi per automatizzare ulteriormente il processo di raccolta dei dati. Confrontando il rapporto tra l'attivazione del biosensore in presenza di effettore (ON) e la sua assenza (OFF), sono state valutate 5.000 varianti utilizzando il grado di attivazione del biosensore (fold change) per determinare la funzione del biosensore; Solo le varianti con attività superiore a quella del costrutto di base (3,6 volte) sono state portate avanti per un'ulteriore caratterizzazione, come indicato dalla regione ombreggiata rosso-rosa del grafico a dispersione (Figura 3D). Sulla base della piastra e delle posizioni dei pozzetti del pool di varianti arricchite, è possibile effettuare una caratterizzazione robusta utilizzando repliche biologiche o diverse concentrazioni di effettori facendo riferimento alle piastre criogeniche originali con codice a barre generate nella fase 1 del flusso di lavoro.

La Figura 4 mostra lo screening delle varianti valutate dallo screening iniziale della libreria, con l'obiettivo di sviluppare una libreria di promotori per ottimizzare la sensibilità. Utilizzando i dati delle 5.000 varianti esaminate nel flusso di lavoro precedente, un pool di 226 varianti selezionate dalla schermata iniziale di accensione/spegnimento, determinate per essere più attive della sequenza parentale, sono state ulteriormente caratterizzate e classificate in base alla loro sensibilità, al fine di fungere da livelli attorno ai quali è stato possibile progettare un DSD. Come primo passo le variabili categoriali, in questo caso le varianti P_out top, devono essere convertite in variabili continue che si estendono su un ampio intervallo di sensibilità. Per vagliare la sensibilità, sono necessarie curve dose-risposta per ottenere dati EC₅₀ da una funzione di Hill tracciata; ciò aumenta notevolmente il lavoro di placcatura ed è adatto all'automazione che utilizza manipolatori di liquidi per semplificare il processo di configurazione e screening del saggio, come mostrato nella Figura 4A. Seguendo il flusso di lavoro stabilito nella Fase 2 della Figura 3C, i codici a barre delle piastre e le posizioni dei pozzetti corrispondenti al pool arricchito di varianti sono stati utilizzati per inoculare DWB riempiti con terreni di crescita e antibiotici. Per migliorare la robustezza sperimentale, le varianti sono state sottoposte a screening in triplice copia biologica. Dopo il trasferimento delle piastre all'incubatore offline per la crescita, i DWB freschi sono stati riempiti con terreni di crescita integrati con effettori da 0, 1, 25 e 1000 μM utilizzando i gestori di liquidi per ridurre la manodopera. Per ridurre il numero di piastre necessarie per il saggio, è stato scelto un intervallo di concentrazione che comprendesse la parte inferiore, centrale e superiore della curva, con le concentrazioni del punto medio che rivelavano le sensibilità relative di ciascuna variante, come illustrato nella Figura 4A. Dopo l'inoculazione dei pool di varianti a ciascuna concentrazione dell'effettore e l'analisi della fluorescenza e dell'OD₆₀₀, sono state tracciate le curve dose-risposta, con l'analisi di regressione non lineare utilizzata per determinare l'EC₅₀. In questa fase, è stata generata una libreria grezza di ciascuna variante con un valore EC₅₀ univoco, con le prime 100 varianti più robuste portate avanti, come mostrato nella Figura 4B , al fine di ridurre ulteriormente le dimensioni della libreria. Prima che questa libreria possa essere utilizzata in DoE, tuttavia, è necessario generare la conversione delle varianti univoche in una libreria classificata, che rappresenta l'intervallo di sensibilità contenuto all'interno. Ciò è stato ottenuto eseguendo una trasformazione lin-log dei dati, che classifica e ridimensiona i dati in modo che ogni variante sia classificata da più sensibile (-1) a meno sensibile (+1), oltre a definire un valore medio (0), che rappresenta la media geometrica del set di dati Figura 4C. La trasformazione dei dati grezzi ha prodotto il grafico blu mostrato nella Figura 4D, da cui le sequenze P_out discrete corrispondenti a +1, 0 e -1 sono state portate avanti nel disegno di screening definitivo come livelli di fattore P_out .

Figura 5 dimostra il flusso di lavoro completo dopo la generazione della libreria, dalla generazione DSD alla modellazione e all'ottimizzazione globale di un biosensore basato sull'apprendimento assistito da DoE. Figura 5A presenta una suddivisione di un tipico biosensore in 3 moduli con 1 (moduli di trasporto e regolatore) o 2 (modulo di uscita) nodi di regolazione. Seguendo l'esempio di Figura 4, RBS o librerie promotrici sono state sviluppate e sono stati selezionati livelli compresi tra +1, 0 e -1 per comprendere la variazione massima di ciascun fattore. La dimensione delle librerie selezionate determinerebbe in genere il numero di esperimenti necessari per esplorare completamente lo spazio di progettazione, ad esempio, se ogni libreria fosse di dimensione 22, ciò equivarrebbe a 22⁴ (234.256) combinazioni. Il DoE mira a semplificare il carico di lavoro sperimentale riducendo il numero di combinazioni attraverso disegni di screening strutturati. Sebbene siano possibili molte metodologie, il DSD è ideale per lo sviluppo di biosensori in quanto consente l'identificazione dei fattori principali e delle interazioni tra due fattori, evitando di confondere gli effetti del secondo ordine. Inoltre, poiché i progetti DSD utilizzano 3 livelli, è possibile stimare la curvatura (non linearità). Figura 5A dimostra una tipica uscita DSD in cui ciascuno dei 4 moduli è impostato su livelli diversi; poiché ogni livello corrisponde a un particolare promotore o variante RBS, l'assemblaggio isotermico viene utilizzato per generare i costrutti genetici corrispondenti ai disegni raccomandati del DSD. Dopo aver assemblato e trasformato il ceppo ospite con i costrutti raccomandati, si ottengono curve dose-risposta utilizzando una gamma completa di concentrazioni di effettori per fornire maggiore fiducia nelle prestazioni di ciascuno dei costrutti Figura 5B. Poiché il DSD riduce drasticamente il numero di costrutti, questo passaggio può spesso essere eseguito a mano o utilizzando manipolatori di liquidi automatizzati, se si preferisce. Figura 5C presenta l'output del profilo predittivo ottenuto dopo aver costruito e testato le combinazioni suggerite dallo schermo DSD e aver costruito modelli predittivi basati sul coefficiente di Hill (n_H) e CE₅₀ di ciascuna combinazione testata. Lo scopo dell'esperimento era quello di sviluppare un costrutto di biosensore che fosse globalmente ottimizzato sia per n_H e CE₅₀ attraverso la modulazione dell'espressione dei 4 nodi regolatori per massimizzare entrambi i parametri. Ogni fattore regolatorio è mostrato nella propria colonna con il grado di espressione indicato lungo l'asse delle ascisse corrispondente al promotore trasformato lin-log e alle librerie di parti RBS (da -1 a +1). L'effetto del cambiamento dell'espressione dei nodi su entrambi gli EC₅₀ e n_H è indicato dalle curve nelle sottotrame. I grafici dei profili evidenziano la natura spesso poco intuitiva dell'ottimizzazione dei biosensori, per cui la regolazione di un nodo regolatorio può avere effetti opposti sui parametri di uscita. Ad esempio, Archiviazione BLOB remoti_Trans ha dimostrato di non avere una forte correlazione con n_H,_{tuttavia, è correlato positivamente con EC50} in modo non lineare. Nel caso di RBS sono implicite anche interazioni di ordine superiore (non lineari)_Cambio Un aumento della forza aumenterà la pendenza (maggiore n_H) con un concomitante aumento della sensibilità (EC più bassa₅₀), che si traduce in una curva con una pendenza più digitale e una risposta più netta all'aumento della concentrazione dell'effettore. Da questi modelli, gli aspetti non intuitivi della messa a punto dei biosensori possono essere resi più chiaramente, il che consente l'ottimizzazione dei nodi di regolazione verso un optimum globale. I modelli sono stati utilizzati per prevedere l'optimum globale sia per l'EC₅₀ e n_H , con le linee rosse nel grafico che indicano i livelli ottimali di ciascun nodo di regolamentazione (Figura 5C). Figura 5D dimostra il profilo dose-risposta del costrutto iniziale del biosensore parentale (Blu) rispetto al design DSD più performante (Verde) e al costrutto ottimizzato a livello globale (Lilac). Utilizzo del modello per prevedere le forze del modulo ideali per massimizzare l'EC₅₀ e n_H, una variante corrispondente a RBS_Trans (-1), P_Reg (-0,7), P_Cambio (-0,3) e RBS_Cambio (+1) è stato assemblato e caratterizzato con il costrutto ottimizzato che mostra miglioramenti in EC₅₀ e n_H (Figura 5D). Mentre sia il DSD che i biosensori ottimizzati a livello globale mostrano EC simili₅₀ (0,8 contro 0,7 μM), n_H è stato notevolmente migliorato senza compromettere la CE₅₀ guadagni già raggiunti. I risultati dimostrano chiaramente i vantaggi della progettazione basata sui dati rispetto agli approcci basati sull'intuizione e servono a convalidare il DoE come mezzo per snellire e semplificare il processo di messa a punto dei biosensori.

Figura 1: Messa a punto dei parametri del biosensore geneticamente codificato. Layout dei moduli genetici di un biosensore geneticamente codificato, inclusi aTF, siti operatore (OS), hexbox (-35, -10) e componenti RBS. Le caselle colorate corrispondono alle interazioni che tipicamente influenzano i parametri del biosensore come: affinità ligando-aTF (grigio), operatore aTF (rosa), RNAP-Hexbox (verde) e RBS (arancione). Gli effetti di ciascun parametro sulle caratteristiche dose-risposta sono indicati all'interno dei grafici rappresentativi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Panoramica di un tipico flusso di lavoro di ottimizzazione dei biosensori DoE. (A) Panoramica della modularizzazione dei componenti del biosensore che mostra un modulo di trasporto che codifica una proteina di trasporto per importare l'effettore bersaglio, un modulo regolatore relativo all'aTF e un modulo di uscita che codifica per una proteina reporter come sfGFP. Vengono mostrati anche i nodi di regolazione, come RBS_trans, P_reg, P_out e RBS_out, che corrispondono ai nodi genetici che saranno sottoposti a randomizzazione per esplorare i parametri del biosensore. (B) Una selezione di elementi di sequenza suscettibili di randomizzazione di base, inclusi promotori e RBS. La sequenza parentale del promotore è mostrata nella riga superiore, con la sequenza mutante finalizzata mostrata di seguito, le stelle indicano basi invariate, mentre K, M e N si riferiscono rispettivamente a guanina/timina, adenina/citosina o qualsiasi nucleotide. I promotori offrono un maggiore potenziale di randomizzazione attraverso il targeting di esadecimale o siti operatori e possono anche includere la duplicazione o la modifica della spaziatura delle sequenze. Le librerie RBS offrono opzioni di randomizzazione più limitate, tuttavia, sono significativamente più facili da selezionare a causa della loro minore diversità massima. (C) I livelli di espressione delle varianti sono caratterizzati e quindi convertiti in una libreria lin-log classificata per convertire i fattori di variante categoriali in 3 livelli discreti che sono più suscettibili di analisi tramite DoE. (D) La mappatura dello spazio sperimentale viene eseguita utilizzando combinazioni multiplexate dei tre livelli di ciascun modulo per generare un modello che può essere utilizzato per informare le scelte di progettazione per regolare le prestazioni del biosensore verso i risultati desiderati, questo potrebbe essere verso la gamma dinamica o verso la sensibilità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Modularizzazione del biosensore, costruzione della libreria del promotore e flusso di lavoro automatizzato. (A) Esempio di randomizzazione di sequenze specifiche nel promotore aTF e inserimento nel costrutto del biosensore tramite assemblaggio isotermico. Le lettere in grassetto indicano le posizioni che sono state randomizzate nel sito dell'operatore o nelle caselle esadecimali in base alla chiave fornita durante la sintesi degenerata di oligonucleotidi. (B) Pannello che descrive la trasformazione della libreria di varianti del biosensore risultante in un ospite di clonazione come E. coli e le fasi successive in base alla resa del trasformante. Una bassa efficienza di trasformazione può comportare una scarsa copertura teorica della libreria e un'esplorazione inadeguata dello spazio di progettazione. La risoluzione dei problemi in questa fase è fondamentale per garantire che una parte significativa delle varianti sia disponibile per la caratterizzazione, con le misure comuni di risoluzione dei problemi delineate. (C) Flusso di lavoro delle fasi 1 e 2 come indicato nel protocollo, con il simbolo della mano rossa che indica le fasi manuali e l'ingranaggio che indica le fasi automatizzate. Il flusso di lavoro della fase 1 evidenzia le fasi chiave del protocollo, dalla selezione delle colonie alla generazione del criostock. Il flusso di lavoro della fase 2 dimostra la riattivazione e il riordino delle scorte criogeniche per l'analisi in base alla curva dose-risposta. (D) Il pannello che dimostra la procedura finale prima dello screening, compreso il lavaggio delle cellule e il trasferimento su piastre di saggio prima della misurazione della fluorescenza e dell'OD. Nel pannello viene mostrato un pool di varianti sottoposte a screening di 5000, con le varianti che dimostrano ON/OFF in eccesso rispetto alla sequenza del promotore parentale (3,6 volte) evidenziate nel riquadro arancione. Molte delle varianti possono essere raggruppate intorno a 1, indicando scarse prestazioni e bassa variabilità, probabilmente a causa della randomizzazione a livello di sequenza che causa la perdita di funzione. Le 226 varianti mostrate nel grafico sono state portate avanti per una caratterizzazione robusta. I dati sono stati adattati dalla pubblicazione originale di Alvarez Gonzalez et al²³. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Screening delle varianti superiori della libreria del promotore e discretizzazione tramite trasformazione lin-log. (A) Schema della procedura standard per la generazione di dati di espressione per una RBS o una libreria promotrice. Utilizzando le varianti valutate che rappresentano un buon intervallo di livelli di espressione, i gestori di liquidi vengono utilizzati per generare piastre di saggio preriempite con concentrazione predeterminata di effettore da cui derivare le curve dose-risposta delle 226 varianti sottoposte a triage. (B) Dopo la determinazione dell'EC₅₀ e l'ulteriore riduzione della libreria caratterizzata a 100 varianti, i dati vengono tracciati sotto forma di grafico a barre che mostra il mix di diverse sensibilità generate dalla randomizzazione del promotore. (e)I dati EC₅₀ vengono trasformati utilizzando l'equazione del tasso lin-log per convertire il set di dati continuo in uno categorico più adatto alla fattorizzazione in un DSD. (D) I dati trasformati sulla variante EC₅₀ sono ora ridotti a una scala semplificata e classificati da alta a bassa attività di EC₅₀ . Da questo, vengono selezionati 3 livelli corrispondenti alle varianti superiore (+1) media geometrica (0) e inferiore (-1) e saranno portati avanti nel DSD per esplorare lo spazio sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Progettazione sperimentale DSD, test e risultati dell'apprendimento basato su modelli. (A) Flusso di lavoro schematico che mostra la generazione di una tabella di progettazione DSD basata sulle librerie classificate trasformate lin-log dei moduli RBS_trans, P_reg, P_{out e RBSout} . La tabella di progettazione DSD suggerisce il minor numero di combinazioni per mappare in modo efficiente lo spazio sperimentale. Viene fornito un output di esempio in cui +1, 0 e -1 si riferiscono alle varianti con prestazioni superiori, medie e inferiori per ciascun nodo regolatorio, come descritto dalle trasformazioni lin-log. Questi vengono costruiti tramite assemblaggio isotermico e confermati mediante sequenziamento prima di essere trasformati nell'ospite di espressione per la caratterizzazione. (B) Dopo la trasformazione, le cellule vengono coltivate e analizzate rispetto a un'ampia gamma di concentrazioni di effettori e l'uscita fluorescente viene misurata per generare curve dose-risposta. Vari parametri, come nH e EC50, vengono estratti dalle curve dose-risposta e inseriti nel DSD per generare modelli predittivi per ciascun fattore. (C) Utilizzando i modelli, è possibile effettuare previsioni sull'impatto della modulazione di un parametro del biosensore attraverso la modifica del livello di espressione di qualsiasi modulo regolatore. È importante sottolineare che diventa possibile la messa a punto globale dei nodi regolatori, consentendo la massimizzazione di uno o più parametri del biosensore contemporaneamente, indicati dalle linee rosse tratteggiate in ciascun sottografico. (D) L'ottimizzazione del modello verso la massima sensibilità si traduce nel costrutto ottimizzato a livello globale (lilla), la cui curva dose-risposta è tracciata rispetto al costrutto DSD più performante (verde) e al costrutto del biosensore parentale (blu). I parametri estratti n_H e EC₅₀ sono mostrati sotto il grafico, dimostrando il miglioramento di entrambi i parametri rispetto al costrutto DSD più performante, convalidando l'efficacia dei modelli predittivi generati dal DSD. I dati sono stati adattati dalla pubblicazione originale di Alvarez Gonzalez et al²³. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Passaggi del protocollo di manipolazione automatizzata dei liquidi utilizzati per la preparazione della libreria di biosensori e l'impostazione del saggio. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare alla Figura 6 supplementare: Generazione passo dopo passo di un disegno di screening definitivo (DSD). Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Le librerie di elementi genetici che comprendono un'ampia variabilità genetica sono fondamentali per il successo di una metodologia basata sul DoE. Come dimostrato nella Figura 2A, il numero di varianti teoriche aumenta con il numero di posizioni da mirare per la mutagenesi e con il grado di randomizzazione, con questa dimensione della libreria in continuo aumento che crea significativi colli di bottiglia nello screening. Ridurre il numero di posizioni target o il grado di randomizzazione può ridurre il numero di varianti che devono essere sottoposte a screening ed è un approccio interessante se è richiesto un approccio più mirato alla messa a punto o se esiste una significativa conoscenza a priori del sistema come guida. Nel caso di sistemi come i biosensori, tuttavia, che presentano molte caratteristiche sovrapposte o potrebbero non avere elementi genetici ben caratterizzati, è difficile eludere il requisito della dimensione della libreria. L'uso di manipolatori di liquidi automatizzati può banalizzare il lavoro di prelievo delle colonie e di coltura delle varianti, in particolare quando è necessaria una maggiore raccolta di punti dati per tracciare funzioni più avanzate come le curve dose-risposta rispetto a due comparatori di punti dati, come ON/OFF. Sebbene sia difficile quantificare in modo specifico il tempo risparmiato grazie all'inclusione di flussi di lavoro automatizzati, Il principale vantaggio della sua attuazione risiede nel tempo che può essere dedicato ad altri esperimenti paralleli³⁸.

Nonostante ciò, in molti casi in cui le dimensioni delle librerie superano i 10⁴, anche le metodologie assistite dalla manipolazione dei liquidi diventano impraticabili³⁹. In questi casi, uno screening preliminare delle varianti con citometri a flusso è un approccio molto interessante, con una capacità di selezione molto più ampia, fino a^10-7 cellule all'ora^{e 40}. L'uso della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) con due cicli di selezione positiva e almeno un ciclo di selezione negativa è stato impiegato di routine nel triage delle varianti più performanti dei biosensori prima di una caratterizzazione più ampia 16,26,42. Lo sviluppo e l'esecuzione di tali protocolli che utilizzano il FACS sono stati esaminati in dettaglio altrove³¹. Gli screening di triage iniziali sono possibili utilizzando saggi di manipolazione di liquidi basati su piastra, come descritto nel protocollo di cui sopra; confrontando i dati ON/OFF utilizzando una singola concentrazione di effettore, come mostrato nella Figura 3D, è possibile selezionare solo biosensori varianti con un apprezzabile guadagno di funzione (3,6 volte come previsto nei metodi) per un'ulteriore caratterizzazione dettagliata, semplificando lo sviluppo della libreria e il tempo di esecuzione sperimentale. Sia i FACS che le piattaforme di gestione dei liquidi, tuttavia, comportano un investimento di capitale significativo per il laboratorio e spesso richiedono un livello di competenza tecnica per il funzionamento e la manutenzione. Gli schermi basati su piastre di agar forniscono una barriera tecnica e finanziaria inferiore all'ingresso e sono stati utilizzati in combinazione con gfp o screening di colonie blu-bianche per selezionare varianti di libreria RBS e mutanti enzimatici in base all'intensità di fluorescenza^43,44. Anche queste, tuttavia, sono limitate nel numero di varianti che possono essere efficacemente sottoposte a screening, ma richiedono anche una differenza significativa nella fluorescenza per essere rilevabili⁴⁴. Come compromesso tra la mutazione simultanea completamente combinatoria di più elementi contemporaneamente, una metodologia "divide et impera" mira invece a suddividere grandi librerie di varianti in blocchi di screening più gestibili⁴¹. Sebbene un approccio modularizzato possa essere pragmatico, non esplora efficacemente lo spazio della progettazione combinatoria, poiché è noto che le prestazioni dei componenti biologici dipendono fortemente dal contesto, specialmente nei batteri, dove l'accoppiamento trascrizionale e traduzionale è prevalente. Ciò ha il potenziale per portare a scelte di progettazione che mirano ai massimi locali anziché agli ottimali globali.

Il trasporto e il riconoscimento di specifici induttori rappresentano un'altra importante caratteristica dello sviluppo dei biosensori che merita di essere menzionata, nonostante non sia l'obiettivo principale del protocollo delineato. La mancanza di un aTF appropriato per la molecola bersaglio rappresenta una sfida significativa per i ricercatori. La selezione razionale di un aTF esistente che lega un analogo strutturale dell'effettore bersaglio può fornire un modello ideale su cui applicare la randomizzazione del codone al fine di sintonizzare la specificità dell'aTF sull'effettore desiderato¹⁷. L'allineamento della sequenza target a strutture risolte o predizioni di Alphafold possono consentire l'identificazione di siti di legame effettori con sospetti residui amminoacidici sottoposti a randomizzazione e classificazione semi-razionale, adattabili al protocollo¹⁷. Allo stesso modo, la selezione e la modulazione dei trasportatori responsabili dell'importazione/esportazione degli effettori possono alterare significativamente le caratteristiche dose-risposta dei biosensori. L'espressione genica del trasportatore è risultata essere un attore significativo nella risposta del biosensore, con una libreria diversificata di promotori di P_tac e RBS che controllano l'espressione di un trasportatore MucK utilizzato per stabilizzarne l'espressione su più cicli di FACS, migliorando la robustezza della risposta del biosensore¹⁷. Allo stesso modo, lo screening di diverse proteine trasportatrici può modulare la specificità dei biosensori, con lo screening di un set putativo di trasportatori PcaK utilizzando un biosensore PCA-responsive che porta all'identificazione di due trasportatori in grado di assorbire substrati 3,5-idrossilati, espandendo l'insieme di composti rilevabili da quel sistema²⁴.

Le piattaforme automatizzate possono diventare strumenti ancora più potenti per la caratterizzazione e l'esplorazione quando si accoppiano i principi DoE con i modelli di deep learning^46,47. Dopo aver esplorato per la prima volta lo spazio di progettazione di un biosensore con una piattaforma ad alto rendimento, gli algoritmi di apprendimento automatico sono stati sfruttati per prevedere la funzione di sequenze non caratterizzate con una buona precisione ⁴⁷. I metodi delineati in questo protocollo potrebbero essere facilmente applicati nella sperimentazione di nuovi modelli di apprendimento linguistico per la progettazione del promotore, simili ai modelli che sono stati sviluppati sulla base della predizione di sequenze cross-RBS⁴⁸. Inoltre, l'integrazione di tali modelli può sfruttare i dati sequenza-funzione contenuti all'interno dei progetti di promotori non funzionali e fornire informazioni critiche sulla funzionalità più ampia del biosensore nel suo complesso. In particolare, ciò avrebbe il potenziale per affrontare una limitazione cruciale del flusso di lavoro DoE, ovvero che i falsi positivi, ad esempio un promotore non funzionale, non equivalgono necessariamente a un output misurato pari a zero, con fenomeni come la trascrizione spuria o l'introduzione di un elemento di rumore nei dati DoE, che è difficile da identificare e controllare. Fondamentalmente, al fine di comprendere l'intero spazio di progettazione sperimentale, qualsiasi libreria generata deve esibire un'ampia gamma di attività, poiché un intervallo di attività insufficiente comporterà risultati di progettazione distorti e creerà inaffidabilità in qualsiasi modello statistico generato dal set di dati³⁰. Se la bassa variabilità delle librerie diventa un problema, è possibile implementare l'esplorazione di altri elementi di sequenza o l'aumento del grado di randomizzazione e confrontare la variazione tra le librerie fino a raggiungere un pool di varianti adeguato.

Un aspetto cruciale del processo DoE riguarda la corretta stima e selezione degli effetti primari e secondari ottenuti dal DSD che saranno poi incorporati nell'analisi statistica. Il DoE, essendo un approccio basato sulla modellazione, è altamente incline all'overfitting e ai bias, che possono complicare rapidamente il processo di ottimizzazione guidando gli sforzi di ingegneria iterativa in sezioni non ottimali dello spazio di progettazione⁴⁹. Pertanto, è fondamentale garantire che tutti i progetti siano isolati in modo robusto da tali effetti, sia nella fase di ideazione che nell'analisi dei dati. Nella fase iniziale di progettazione dello screening, le esecuzioni centrate in cui tutti i fattori sono impostati sulla media geometrica (ad esempio, 0,0,0,0) possono aiutare a ridurre le distorsioni del modello tenendo meglio conto delle interazioni non lineari, senza aggiungere un carico sperimentale significativo (1-3 esecuzioni aggiuntive)⁴⁹. Inoltre, l'inclusione di disegni randomizzati può aiutare a tenere conto di variabili estranee che non sono incluse nel disegno sperimentale, ma che potrebbero comunque influenzare le variabili di risposta che vengono misurate. In un contesto biologico, la randomizzazione affronta problemi come gli effetti spaziotemporali, come la posizione della piastra o la variazione da lotto a lotto, impedendo che tali effetti influenzino in modo significativo l'interpretazione dei dati. L'attenzione a tali dettagli in questa fase iniziale può migliorare la robustezza dei modelli e portare a conclusioni più affidabili. Dopo aver eseguito gli esperimenti suggeriti dal DSD, è necessaria un'analisi statistica dei dati per chiarire quei fattori che hanno avuto un impatto significativo sui parametri di output. I grafici seminormali offrono una rappresentazione visiva intuitiva delle grandezze dell'effetto, con gli effetti senza significato che tipicamente cadono lungo una linea retta, mentre gli effetti con un impatto significativo si discostano da questa linea, consentendo una semplice selezione dei fattori più importanti nell'ottimizzazione dei biosensori. Con questo in mente, dovrebbe essere adottato un approccio conservativo alla selezione degli effetti, come per tutti i modelli, per ridurre il rischio di overfitting del modello.

La capacità di progettare e ottimizzare rapidamente biosensori e altri circuiti genetici accelererà notevolmente il ritmo della ricerca nel campo della biotecnologia, come nello sviluppo di ceppi ed enzimi, ma anche nella diagnostica in tempo reale. L'emergere di metodologie di screening basate su DoE in questo campo è particolarmente promettente, in quanto facilita l'uso efficiente di tempo e risorse esplorando il massimo spazio di progettazione possibile, ed è già stato utilizzato con grande efficacia nell'ottimizzazione dei circuiti genetici per le vie metaboliche e per i biosensori 31,33,34,51. DoE è particolarmente adatto a problemi di ottimizzazione multifattoriale in cui sono all'opera molte interazioni del primo, secondo o anche terzo ordine che sarebbero altrimenti difficili da interrogare con il tipico approccio di progettazione sperimentale di un fattore alla volta. Inoltre, gli sforzi per ingegnerizzare un aspetto di un biosensore spesso si traducono inavvertitamente nel sacrificio di un altro parametro, come il miglioramento della sensibilità a scapito della gamma dinamica⁵¹. Grazie alla capacità del DoE di mappare tali interazioni nascoste e di creare modelli che prevedono il comportamento dei biosensori, il ciclo di apprendimento del test di costruzione è notevolmente accelerato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1000 µ Puntali L CO-RE, sterili non filtranti	Hamilton	235939
Piastra Deepwell 96 da 2,2 mL, pozzetti quadrati con fondo a forma di V	Termo	11594754
300 µ Puntali L CO-RE, NT impilati, sterili	Hamilton	235985
Fondo trasparente a 96 pozzetti, piastre per microtitolazione nere	Greiner	655097
Agarosio	Invitrogen	16500100
DNA plasmidico assemblato	Fornito dall'utente	NA
Lettore di micropiastre ClarioStar Plus	BMG	NA
Miscela di soluzioni di dexynucloetide (dNTP)	NEB	N0447L
Dimetilsolfossido (DMSO)	Fisher BioReaggents	BP231-100
Scala DNA 100bp	NEB	N3231L
Scala del DNA 1KB	NEB	N3232L
Sequenziamento del DNA	Fonte Bioscienze	NA
Sintesi del DNA	IDT	NA
Escherichia coli DH5&alfa; Cellule compotenti	NEB	C2987H
Colorante di caricamento in gel, viola x6 senza SDS	NEB	B7025S
Cuvette per elettroporazione Gene Pulser/Micropulser, distanza di 0,2 cm	Biorad	1652082
Blocco grafico Prism 10	GraphPad	NA
Hamilton Star Liquid Handler	Hamilton	NA
Incubatore per agitatore a piastre HT multitron	Infors HT	NA
Suite di analisi statistica JMP	JMP	NA
LB Brodo (Miller)	Miller	L3522
LB Brodo (Miller) con agar	Sigma	L3147
Elettroporatore MicroPulser	Biorad	1652100
NEBuilder HiFi DNA Assemblaggio Master Mix	NEB	E2621S
Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltà	NEB	Codice: M0491S
Kit MIDIPREP per la rotazione QIAprep	QIAGEN	12143
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
Kit di estrazione del gel QIAquick	QIAGEN	Codice 28706X4
Kit di purificazione QIAquick PCR	QIAGEN	28104
Qpix 420 Raccoglitore di colonie	Molecular Devices Regno Unito	NA
Terreno di crescita SOC	NEB	B9020S
SYBR Sicuro DNA Gel Macchia	Invitrogen	S33102
Tampone TAE (Tris-acetato-EDTA, 50X)	Thermo Fisher	B49
Acqua distillata UltraPureTM senza DNASI/RNASI	Invitrogen	10977015