Biosensori a base di proteine G basati su BRET per la misurazione dell'attività del recettore accoppiato a proteine G in cellule vive

Adeline Cœugnet; Hannes Schihada; Estelle Rascol; Isabel Alves; Marie-Lise Jobin

doi:10.3791/68463

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Articolo metodologico

Biosensori a base di proteine G basati su BRET per la misurazione dell'attività del recettore accoppiato a proteine G in cellule vive

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DOI:

10.3791/68463

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7 novembre 2025

Adeline Cœugnet¹ , Hannes Schihada² , Estelle Rascol¹ , Isabel Alves¹ , Marie-Lise Jobin¹

¹CNRS, Bordeaux INP, CBMN, UMR 5248, University of Bordeaux, ²Department of Pharmaceutical Chemistry, Philipps-University Marburg

In questo articolo

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Sommario

Questo protocollo descrive l'uso di biosensori basati su BRET per la misurazione in tempo reale dell'attivazione della proteina G nelle cellule HEK293 viventi dopo stimolazione del ligando del recettore accoppiato alla proteina G. Qui, il recettore β2-adrenergico e il recettore dei cannabinoidi di tipo 1 servono come esempi per dimostrare l'efficienza dei sensori per diversi sottotipi di proteine G e in vari GPCR.

Abstract

I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) costituiscono la più grande famiglia di recettori transmembrana, svolgendo un ruolo cruciale nella segnalazione cellulare trasducendo gli stimoli extracellulari in risposte intracellulari. L'attivazione dei GPCR porta a cambiamenti conformazionali che consentono interazioni con le proteine G eterotrimeriche. Dopo l'attivazione, la subunità G_α subisce uno scambio GDP-GTP, dissociandosi dal dimero G_βγ e innescando cascate di segnalazione a valle. Per studiare l'attivazione della proteina G mediata da GPCR, i biosensori basati sul trasferimento di energia per risonanza di bioluminescenza (BRET) sono un approccio altamente sensibile e non invasivo. I sensori di attività tricistronica basati su proteine G (biosensori G-CASE), sviluppati da Schihada et al., rilevano la dissociazione eterotrimera come proxy per l'attivazione e consentono il monitoraggio in tempo reale dell'attività di GPCR utilizzando una singola trasfezione plasmidica, superando i limiti degli approcci di co-trasfezione. I saggi BRET offrono diversi vantaggi rispetto alle tecniche basate sulla fluorescenza, come la riduzione del rumore di fondo, la riduzione del fotosbiancamento e una migliore sensibilità. In questo protocollo, i biosensori G-CASE basati su BRET sono stati utilizzati in cellule vive e piastre a 96 pozzetti. In particolare, valutiamo l'attività del recettore β2-adrenergico (β2-AR) e del recettore dei cannabinoidi di tipo 1 (CB1R) in termini di attivazione della proteina G. Utilizzando cellule HEK 293T wild-type trasfettate transitoriamente con β2-AR e cellule HEK293T che esprimono stabilmente CB1R, la robustezza dei biosensori G_s e G_i3 G-CASE è confermata. Questo protocollo supporta l'utilità di questo approccio per gli studi farmacologici e lo screening GPCR ad alto rendimento per comprendere meglio la capacità dei ligandi di attivare percorsi specifici, ad esempio, tramite una segnalazione distorta e quindi facilitare la scoperta di nuovi composti terapeutici.

Introduzione

I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) rappresentano la più grande superfamiglia di recettori transmembrana, responsabili della trasduzione di stimoli extracellulari in cascate di segnalazione intracellulare con conseguenti risposte biologiche specifiche. Sono bersagli farmacologici fondamentali, con circa il 30% dei farmaci commercializzati che agiscono sui GPCR¹. Il legame del ligando GPCR induce cambiamenti conformazionali nel recettore, facilitando le interazioni con le proteine G eterotrimeriche e/o le chinasi GPCR (GRKs) e le β-arrestine, avviando così la segnalazione a valle o l'internalizzazione del....