Biosensori a base di proteine G basati su BRET per la misurazione dell'attività del recettore accoppiato a proteine G in cellule vive

I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) rappresentano la più grande superfamiglia di recettori transmembrana, responsabili della trasduzione di stimoli extracellulari in cascate di segnalazione intracellulare con conseguenti risposte biologiche specifiche. Sono bersagli farmacologici fondamentali, con circa il 30% dei farmaci commercializzati che agiscono sui GPCR¹. Il legame del ligando GPCR induce cambiamenti conformazionali nel recettore, facilitando le interazioni con le proteine G eterotrimeriche e/o le chinasi GPCR (GRKs) e le β-arrestine, avviando così la segnalazione a valle o l'internalizzazione del recettore².

Le proteine G eterotrimeriche fungono da trasduttori intracellulari primari della segnalazione GPCR e sono costituite da tre subunità: G_α, G_β e G_γ. Questi eterotrimeri sono classificati in quattro famiglie - G_i/o, G_s, G_q e G_12/13 - in base al sottotipo G_α , ognuna delle quali attiva vie di segnalazione distinte: il sottotipo G_i/o inibisce l'adenilato ciclasi mentre G_s la stimola, G_q attiva la fosfolipasi C-β e G_12/13 regola le GTPasi della famiglia Rho.

L'attivazione dei GPCR porta ai loro riarrangiamenti conformazionali, consentendo un rapido coinvolgimento della proteina G entro cinetiche inferiori al secondo. Questo processo induce cambiamenti conformazionali della proteina G, promuovendo lo scambio GDP-GTP nella subunità G_α. Il legame con il GTP altera ulteriormente la conformazione della subunità G_α, determinando la sua dissociazione dal dimero_{G βγ}, consentendo la propagazione del segnale. Le proteine G sono quindi cruciali nel modulare la specificità e la dinamica temporale delle risposte cellulari regolando diverse proteine effettrici come l'adenilato ciclasi o i canali ionici ^3,4,5.

Questo protocollo delinea la misurazione dell'attivazione o dell'inattivazione della proteina G utilizzando biosensori basati sul trasferimento di energia della risonanza di bioluminescenza (BRET) dopo la stimolazione del ligando GPCR in cellule vive. Ispirato dal lavoro pionieristico sui biosensori delle proteine G 6,7,8,9, il sistema G-CASE (G protein tri-cistronic activity sensors), introdotto da Schihada et ^al.10, si basa su BRET tra le subunità G_α marcate e G _βγ e offre un approccio semplificato che richiede solo una singola trasfezione plasmidica. Questa caratteristica migliora la sensibilità e mitiga le sfide associate alla co-trasfezione di più plasmidi che codificano per le tre subunità (G_α, G_β e G_γ) della proteina G eterotrimerica. Questi sensori sono stati messi a disposizione di gruppi di ricerca accademici in commercio (vedi Tabella dei materiali).

BRET offre vantaggi significativi rispetto al trasferimento di energia di risonanza (FRET) Förster. In BRET, il trasferimento di energia avviene tra un donatore bioluminescente e un accettore fluorescente senza la necessità di sorgenti luminose esterne. Questa bioluminescenza intrinseca riduce i problemi associati alla FRET, come l'autofluorescenza e la diffusione della luce, con conseguente riduzione del segnale di fondo e miglioramento della sensibilità del saggio ^6,7,11.

Questa assenza di eccitazione esterna in BRET riduce al minimo il fotobleaching e gli effetti fototossici, portando a segnali di fondo inferiori rispetto a FRET. Di conseguenza, i saggi BRET mostrano più spesso una maggiore sensibilità, consentendo la misurazione dell'attivazione della proteina G di GPCR costitutivamente attivi. La maggiore sensibilità dei dosaggi BRET facilita il rilevamento di sottili interazioni biologiche, il che è particolarmente prezioso negli studi farmacologici in cui la misurazione precisa dell'attività del recettore è fondamentale.

Questi biosensori possono essere tradotti in screening ad alto rendimento in piastre da 96 pozzetti o 384 pozzetti, come recentemente dimostrato da Scott-Dennis et al., dove è stato sviluppato un metodo che utilizza questi biosensori in un saggio a 384 pozzetti basato su membrana per analizzare l'attività dei recettori dei cannabinoidi CB1R e CB2R¹². Questo articolo descrive l'uso di questi biosensori in piastre a 96 pozzetti in cellule viventi misurando l'attività del β2-AR come GPCR prototipico di classe A, che lega la proteina_{G s} e il CB1R che appartiene ai GPCR di classe A e attiva la proteina della famiglia G_i/o . L'uso di due biosensori G-CASE è convalidato: G_s e G_i3 in cellule HEK 293T con il GPCR espresso in modo transitorio (con il β2-AR) o stabilmente espresso (con il CB1R).

È importante notare che questo esperimento può essere eseguito in varie linee cellulari, dimostrando la versatilità e la robustezza di questa tecnica in vari contesti cellulari. Ciò garantisce che il metodo possa essere applicato a diversi modelli sperimentali, rendendolo uno strumento prezioso per lo studio della segnalazione GPCR in diversi contesti fisiologici e farmacologici. La Figura 1 illustra il principio dei sensori di attività della proteina G basati su BRET.

Figura 1: Principio dei sensori di attività della proteina G basati su BRET. I sensori di proteine G sono costituiti da tre subunità: G_α, G_{nativo β} e G_γ. La subunità G_α è fusa con la piccola e luminosa NanoLuciferasi (Nluc), mentre la subunità G_γ è marcata N-terminale con Venere permutata circolarmente (cpVenus¹⁷³). I geni che codificano per queste subunità proteiche G ingegnerizzate sono combinati in un unico plasmide. Il legame del ligando ai GPCR induce cambiamenti conformazionali dei GPCR, promuovendo il reclutamento della proteina G e la successiva dissociazione seguita dall'idrolisi del GTP. Questa dissociazione interrompe il trasferimento di energia tra i partner, con conseguente diminuzione del segnale BRET. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Semina su piastra a pozzetti (giorno 1)

NOTA: Seguire tutti i protocolli di coltura cellulare in una cappa a flusso laminare sterile per mantenere le condizioni di sterilità. Le piastre a pozzetti bianchi con fondo piatto trasparente vengono utilizzate per seguire la crescita e la vitalità cellulare. Utilizzare la piastra a pozzetti completamente bianca per evitare di utilizzare un adesivo nel passaggio 3.2.1.

1. Rivestimento della piastra del pozzetto
   NOTA: Le piastre preverniciate possono essere utilizzate per bypassare questo passaggio.
   1. Versare in un serbatoio multicanale circa 6 mL di soluzione di poli-L-lisina (PLL) filtrata sterile (0,01%). Con una pipetta multicanale, riempire ogni pozzetto di una micropiastra a 96 pozzetti bianchi con 60 μl di PLL.
   2. Posizionare la micropiastra in un luogo buio e incubare per 20 minuti.
   3. Durante l'incubazione, procedere con la preparazione delle cellule come descritto nei passaggi 1.2.1-1.2.3.
   4. Aspirare la soluzione PLL con la pipetta multicanale e conservarla a 4 °C in una provetta da 15 mL.
   5. Lavare la piastra tre volte con DPBS per rimuovere il PLL libero che potrebbe causare la degradazione delle celle.
2. Preparazione e placcatura delle celle
   1. Coltura di cellule HEK293 nel terreno Eagle modificato di Dulbecco con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina a 37 °C in CO₂ al 5%.
      NOTA: FBS viene aggiunto al terreno di coltura per fornire i nutrienti necessari e i fattori di crescita necessari per una corretta vitalità cellulare.
   2. Rimuovere il terreno e sciacquare le cellule con 2 ml di DPBS.
   3. Aggiungere 0,5 mL di tripsina e incubare per 3-5 minuti a 37 °C in modo da staccare le cellule.
   4. Aggiungere 4,5 mL di DMEM al pallone per neutralizzare la tripsina, quindi pipettare ripetutamente su e giù per staccare le cellule e risospenderle.
   5. Trasferire le cellule staccate in una provetta da 15 mL e centrifugare per 5 minuti a 1000 x g (a temperatura ambiente, RT).
   6. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 2 mL di DMEM.
   7. Contare le cellule con una camera di conteggio Malassez e preparare 9 mL a 300.000 cellule/mL. Metterli in un serbatoio multicanale e seminare la micropiastra a 96 pozzetti versando 100 μl per pozzetto con la pipetta multicanale (densità finale di 30.000 cellule/pozzetto).
   8. Incubare la micropiastra a 37 °C, 5% CO₂ per circa 24 ore.
      NOTA: Le celle dovrebbero raggiungere circa il 70%-80% di confluenza per una trasfezione efficiente.

2. Trasfezione plasmidica (Giorno 2)

NOTA: La trasfezione cellulare può essere eseguita il primo giorno su celle sospese prima della piastra, durante la fase 1.2.7, e l'acquisizione dei dati il giorno 3.

1. Diluire 10 μg dei plasmidi DNA desiderati (ad esempio, 5 μg di recettore β2-adrenergico e 5 μg di G_s(short)-CASE nelle cellule HEK wt o solo 10 μg di G_i3-CASE nelle cellule HEK CB1) e 20 μL di lipofectamina nelle provette contenenti 500 μL di terreno Opti-MEM. Incubare a RT per 5 min.
   1. Per un controllo negativo, sostituire il recettore β2-adrenergico con un plasmide vuoto pcDNA 3.1 alla stessa concentrazione. Unire le soluzioni in una provetta e mescolare per ottenere una miscela di trasfezione (1 mL).
2. Incubare la miscela di trasfezione a RT per 20 minuti.
3. Aggiungere 10 μl di miscela di trasfezione dal passaggio 2.2 goccia a ciascun pozzetto e far oscillare delicatamente la piastra avanti e indietro per garantire una miscelazione completa.
   NOTA: Si ottiene una concentrazione finale di 100 ng di DNA per pozzetto.
4. Incubare la micropiastra in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO₂ per 24 ore.

3. Acquisizione dati (Giorno 3)

1. Preparazione del legante
   NOTA: Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS): NaCl 140 mM, Cloruro di potassio 5 mM, Cloruro di calcio 1 mM, Solfato di magnesio eptaidrato 0,4 mM, Cloruro di magnesio esaidrato 0,5 mM, Fosfato di sodio bibasico diidrato 0,3 mM, Fosfato di potassio monobasico 0,4 mM, D-glucosio (destrosio) 6 mM, Bicarbonato di sodio 4 mM, pH 7,4, filtrato 0,22 μm.
   1. Preparare una soluzione madre alla massima concentrazione possibile nel solvente di solubilizzazione appropriato per i diversi ligandi (in questo protocollo, l'isoproterenolo viene preparato in H₂0 mQ e WIN-55.212-2 in DMSO).
      NOTA: La concentrazione della soluzione madre del ligando deve essere regolata in base alla solubilità e alla costante di dissociazione nota (K_d) del ligando.
   2. Da questo stock, preparare una diluizione seriale del ligando che si aggira intorno al K_d del ligando, di 10 μl nel solvente di solubilizzazione appropriato. Conservare questa diluizione seriale a -20 °C.
      NOTA: A seconda del ligando, l'intervallo di diluizione seriale può essere congelato e scongelato fino a dieci volte prima che si verifichi la degradazione. Preparare una soluzione contenente solo il solvente utilizzato per la dissoluzione del ligando per includere una condizione del veicolo (in questo protocollo, H₂0 o DMSO).
   3. Per ogni concentrazione di ligando e veicolo, eseguire una diluizione di 1/100 in HBSS aggiungendo 1,3 μL di ciascuna concentrazione a un volume totale di 130 μL. Ciò si traduce in una concentrazione finale dell'1% del veicolo in HBSS.
      NOTA: Questo intervallo di diluizione finale è quello utilizzato per gli esperimenti aggiungendo 10 μl per ottenere 100 μl di volume totale per pozzetto. Ciò si traduce in una concentrazione finale dello 0,1% di veicolo in tutti i pozzi. Il volume di 130 μl corrisponde alla quantità necessaria per riempire una fila di una piastra a 96 pozzetti: (10 x 12) ± 10%. Ogni fila corrisponde a una diversa concentrazione di ligando, con l'ultima fila che funge da controllo del veicolo.
   4. Preparare 980 μL di diluizione di Furimazina 1/100 dalla soluzione madre (9,8 μL in 970,2 μL di HBSS per ottenere un volume totale di 980 μL).
      NOTA: Preparare una soluzione fresca di furimazina e lasciarla incubare per almeno 3 minuti. Quindi, aggiungilo immediatamente prima dell'acquisizione. Non deve essere preparato troppo presto, poiché il segnale ha un'emivita di circa 120 minuti a temperatura ambiente. Per superare questa limitazione, possono essere utilizzati derivati della furimazina a lunga durata d'azione, come vivazine ed endurazine. Questi substrati mantengono un segnale BRET stabile fino a 48 ore.
2. Letture delle targhe
   NOTA: Utilizzare un lettore di piastre multimodale. Regolare la misurazione in base alle condizioni studiate e al numero di repliche. Qui, l'acquisizione dei dati è suddivisa in tre letture di 4 colonne, che corrispondono a 32 pozzetti. Tutte le letture vengono effettuate con ottiche superiori con coperchio trasparente per evitare l'evaporazione del tampone. Prima di tutte le letture, regolare il guadagno di misurazione. In questo studio, il guadagno è stato fissato a 3600. È possibile evitare l'aggiunta manuale di ligandi utilizzando un iniettore automatizzato o un sistema di siringhe, disponibile in molti lettori di piastre.
   1. Rimuovere il fluido dalle prime 4 colonne della piastra a 96 pozzetti. Sciacquare ogni pozzetto con 100 μl di HBSS e aggiungere 80 μl di HBSS. Attacca un adesivo bianco sul lato inferiore della targa. Ciò migliora le misure di fluorescenza e/o bioluminescenza.
   2. Registrazione degli spettri di luminescenza della proteina G: inserire la piastra a 96 pozzetti nel lettore di piastre. Registra l'emissione di cpVenus¹⁷³ utilizzando un monocromatore da 535/30 nm e misura l'emissione di luminescenza tra 500 e 600 nm con risoluzione di 2 nm.
      NOTA: Questa registrazione è un controllo per garantire che la fluorescenza venga emessa dopo l'eccitazione di cpVenus¹⁷³ .
   3. Registrazione degli spettri di luminescenza della proteina G: Registrare l'intensità di emissione di Nluc utilizzando un monocromatore da 450/40 nm e misurare l'emissione di luminescenza tra 400 nm e 600 nm con risoluzione di 5 nm.
      NOTA: Questa registrazione è un controllo per garantire che non venga emessa bioluminescenza prima dell'aggiunta del substrato Nluc, la furimazina.
   4. Rimuovere la piastra dal lettore di piastre e aggiungere 10 μl della soluzione di furimazina precedentemente preparata (passaggio 3.1.4.) in ciascun pozzetto con l'aiuto di una pipetta multicanale.
   5. Ripetere il passaggio 3.2.3.
      NOTA: Questa registrazione è un controllo per garantire che la bioluminescenza venga emessa dopo l'aggiunta di furimazina. Procedere direttamente con il passaggio 3.2.6 dopo questa misurazione per evitare variazioni del segnale dovute al consumo e/o alla degradazione della furimazina. La variazione del segnale BRET può verificarsi a causa del consumo e/o della degradazione della furimazina e i processi regolatori che interrompono la risposta indotta dalla stimolazione dell'agonista. Per superare questa limitazione, potrebbero essere utilizzati inibitori della GRK (CMPD101) e inibitori dell'internalizzazione (dinasori) o cellule geneticamente modificate prive di GRK o arrestine.
   6. Registrazione della proteina G BRET basale: Prima di aggiungere il ligando GPCRs, registrare l'intensità di emissione di Nluc e cpVenus¹⁷³ utilizzando rispettivamente un monocromatore a 450/40 nm e uno a 535/30 nm. Misura 3 cicli di 60 s con un intervallo di misurazione di 0,30 s (tempo di lettura totale di 3 min).
      NOTA: L'aumento del tempo dell'intervallo di misurazione a 0,90 s di solito migliora significativamente il rapporto segnale/rumore, ma si traduce in un tempo di lettura molto più lungo. Lo sperimentatore dovrebbe decidere se la risoluzione temporale più elevata o il miglioramento del rapporto segnale/rumore sono più importanti per la loro applicazione.
   7. Rimuovere la piastra dal lettore di piastre e aggiungere rispettivamente 10 μl dell'intervallo di diluizione precedentemente preparato del ligando GPCR (fase 3.1) in ciascun pozzetto di una colonna con l'aiuto di una pipetta multicanale. Seguire la stessa procedura per le altre 3 colonne.
   8. Registrazione del BRET indotto dal ligando della proteina G: registrare l'intensità di emissione di Nluc e cpVenus¹⁷³ utilizzando rispettivamente un monocromatore da 450/40 nm e uno da 535/30 nm. Misura 16 cicli di 60 s con un intervallo di misurazione di 0,30 s (tempo di lettura totale di 16 min).
      NOTA: Impostare i parametri di misurazione per misurare i pozzetti in colonne. I duplicati vengono letti con una differenza di fuso orario di 2,4 s.
   9. Ripetere il passaggio 3.2. per le successive quattro colonne 2 volte.

4. Analisi dei dati

NOTA: Raccogli i dati di ciascuna lettura in file di fogli di calcolo separati.

1. Letture di controllo
   1. Tracciare l'intensità dell'emissione rispetto alla lunghezza d'onda.
2. Letture BRET basali
   1. Per ogni pozzo, calcolare il rapporto BRET delle tre letture. Il rapporto BRET è definito come emissione accettore/emissione donatore.
      
   2. Per ogni pozzetto, calcolare la media dei tre rapporti BRET prima dell'aggiunta del ligando. Questo valore è chiamato rapporto BRET basale prima della stimolazione del ligando: Rapporto_basale.
   3. Per normalizzare i precedenti rapporti BRET di tutti i pozzi, per ciascuna delle tre misurazioni, sottrarre rispettivamente il valore del rapporto BRET calcolato dai pozzetti di controllo del veicolo dal rapporto BRET al momento della misurazione corrispondente.
      NOTA: I dati analizzati corrispondono ai punti temporali prima dell'aggiunta del ligando. Poiché i pozzetti in cui viene aggiunto il legante sono noti, i pozzetti di controllo del veicolo possono essere identificati di conseguenza.
3. Letture BRET indotte dal ligando della proteina G
   1. Per ogni pozzetto, calcolare il rapporto BRET di ogni lettura, come descritto nella sezione 4.2.1. Questi valori sono chiamati Ratio_stim.
   2. Per quantificare i cambiamenti indotti dal ligando, calcolare il ΔBRET per ogni_stimolo del rapporto di ciascun pozzetto come percentuale rispetto al basale. A tal fine, utilizzare il corrispondente Rapporto_basale precedentemente calcolato nella sezione 4.2.2.
      
   3. Calcola il ΔBRET(%) per normalizzare i valori ΔBRET di ciascun pozzetto. A tal fine, sottrarre i rispettivi valori ΔBRET del veicolo.
   4. Per visualizzare la cinetica ΔBRET in un foglio di calcolo dei dati, aggiungere le tre letture BRET basali normalizzate al punto 4.2.3. davanti ai corrispondenti valori di ΔBRET(%) calcolati per ciascun pozzetto nella sezione 4.3.3.
   5. Traccia i dati precedenti rispetto al tempo di lettura per ottenere un grafico cinetico.
   6. Quando viene raggiunto un plateau, prendere i valori di ΔBRET(%) in un momento scelto e tracciarli rispetto alla concentrazione del ligando utilizzato, poiché ogni pozzetto corrisponde a una diversa concentrazione di ligando. Si ottiene una curva dose-risposta.
      NOTA: Il plateau viene solitamente raggiunto circa 5 minuti dopo la stimolazione del ligando. In questo protocollo, vengono tracciati i valori ottenuti dopo 15 minuti di stimolazione del ligando. Per confrontare i dati di diversi esperimenti, regolare il tempo in base alla cinetica di attivazione.
   7. Tracciare i dati precedenti nel software di analisi e adattarli utilizzando un adattamento sigmoidale dose-risposta a tre parametri basato sulla seguente equazione:
      
      dove, X è la concentrazione del legante utilizzato, Y è i valori di ΔBRET (%), Top e Bottom rappresentano i plateau e EC₅₀ è la concentrazione del ligando richiesta per raggiungere il 50% dell'effetto massimo. Questo permette di ottenere la E_max e l'EC₅₀.
   8. Confronta i dati della condizione di controllo utilizzando un test di Mann-Whitney non parametrico. I risultati sono considerati significativi a p < 0,05.

Figura 2: Passaggi chiave per l'esecuzione del test BRET. Panoramica delle tre principali fasi sperimentali delineate in questo protocollo (semina cellulare, trasfezione cellulare e acquisizione del segnale BRET) e guida dettagliata passo passo per l'acquisizione dei dati. Configurazione sperimentale: il giorno 1, le cellule vengono seminate in una piastra bianca a 96 pozzetti prerivestita PLL con un fondo piatto e chiaro a una densità di 30.000 cellule/pozzetto. Il giorno 2, le cellule vengono trasfettate con il sensore di proteina G selezionato insieme ai plasmidi GPCR o pcDNA3.1 studiati. Dopo 24 ore di incubazione, l'attività del sensore di proteina G viene misurata attraverso letture di bioluminescenza e fluorescenza dopo l'aggiunta del ligando. Acquisizione dei dati: Dopo il lavaggio HBSS delle celle, 80 μL di HBSS vengono aggiunti ai pozzetti e l'emissione di fluorescenza di cpVenus¹⁷³ viene misurata tra 500 nm e 600 nm utilizzando un monocromatore da 535/30 nm (1). Successivamente, la bioluminescenza Nluc viene misurata tra 400 nm e 600 nm utilizzando un monocromatore da 450/40 nm, sia prima ( 2) che dopo (3) l'aggiunta di furimazina. Infine, il segnale BRET per l'attività della proteina G indotta dal basale e dal ligando viene misurato utilizzando monocromatori a 450/40 nm e 535/30 nm, rispettivamente, per 3 minuti (3 cicli di 60 s con un intervallo di misurazione di 0,30 s) (4) e 16 minuti (16 cicli di 60 s con un intervallo di misurazione di 0,30 s) (5). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Uno schema generalizzato della configurazione e dell'esecuzione sperimentale è dettagliato nella Figura 2. L'attivazione delle proteine della famiglia Gs o Gi/o in seguito all'attivazione del ligando di due GPCR è stata valutata utilizzando i biosensori G-CASE. In primo luogo, è stato studiato un GPCR prototipico della famiglia A, il β2-AR trasfettato transitoriamente in cellule HEK 293T. Quando un agonista (ad es. isoproterenolo) è stato applicato a cellule hek wt che esprimono il β2-AR insieme al sensore proteico Gs(short)-CASE, è stata osservata una diminuzione dipendente dalla concentrazione del segnale BRET, indicando l'attivazione della proteina Gs (Figura 3B). I valori di ΔBRET diminuivano con la concentrazione del ligando fino al raggiungimento della saturazione, con un plateau osservato circa 5 minuti dopo la stimolazione del ligando. Al contrario, le cellule wt HEK trasfettate con il plasmide pcDNA3.1 vuoto e il sensore proteico Gs(short)-CASE hanno mostrato una risposta inversa ma bassa e non significativa alla stimolazione con isoproterenolo (Figura 3B). In questo protocollo, vengono tracciati i valori ottenuti dopo 15 minuti di stimolazione del ligando. Per garantire la coerenza dei risultati e l'indipendenza dalla selezione del tempo, è necessario testare altri punti temporali, assicurandosi che l'equilibrio sia stato raggiunto. Inoltre, per confrontare i risultati tra diversi esperimenti, la selezione del tempo deve essere regolata in base alla cinetica di attivazione di ciascun esperimento.

Per generare le curve dose-risposta sigmoidale mostrate nella Figura 3C, i valori di ΔBRET misurati a 15 minuti dopo la stimolazione (quando il plateau è stabilizzato) sono stati tracciati rispetto alle diverse concentrazioni di ligando. L'EC50 osservato (9,4 nM ± 2,1 nM) è nell'intervallo dei valori noti del recettore Kd per l'isoproterenolo (13 nM ± 6 nM)13,14 (Figura 3C,D). Questi risultati dimostrano l'efficienza dei sensori G-CASE nel valutare l'attivazione della proteina G con una risposta osservata specificamente associata alla presenza della β2-AR.

Figura 3: Valutazione del sensoredella proteina G s nelle cellule wt HEK. Letture cinetiche del ΔBRET dopo l'aggiunta dell'agonista isoproterenolo alle cellule wt HEK trasfettate con il sensore della proteina Gs e β2-AR (A) o pcDNA3.1 (B). (C) Curve dose-risposta ottenute adattando i valori di ΔBRET (%) dopo 15 minuti di stimolazione del ligando a concentrazioni variabili del ligando. (D) Confronto dei valori massimi di ΔBRET tra le cellule di controllo trasfettate pcDNA3.1 e β2-AR stimolate con isoproterenolo. La differenza statistica rispetto alla condizione pcDNA3.1 è stata testata utilizzando un test di Mann-Whitney non parametrico (**p < 0,01). I dati mostrano ± SEM medio di tre esperimenti indipendenti eseguiti in duplicato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In secondo luogo, i biosensori sono stati testati in cellule HEK CB1, una linea cellulare HEK 293T che esprime stabilmente il CB1R. Queste cellule sono state trasfettate transitoriamente con il sensore proteico Gi3-CASE. La stimolazione con l'agonista CB1R WIN-55,212-2 ha indotto un segnale ΔBRET concentrazione-dipendente, indicando l'attivazione della via Gi3 (Figura 4A). Al contrario, le cellule hek wt trasfettate con il sensore proteico Gi3-CASE e stimolate nelle stesse condizioni non hanno mostrato alcuna risposta, confermando la specificità dell'attivazione di CB1R (Figura 4B). Un plateau è stato raggiunto a circa 5 minuti dopo l'attivazione del ligando. La corrispondente curva dose-risposta ha evidenziato la risposta ΔBRET concentrazione-dipendente indotta dalla stimolazione WIN-55,212-2 nelle cellule HEK-CB1, mentre tale risposta non è stata osservata nelle cellule HEK wt (Figura 4C). L'EC50 osservato (112 nM ± 25 nM) è nell'intervallo dei valori noti del recettore EC50 per WIN-55,212-2 (354 nM ± 62 nM)15 (Figura 4C, D). Infine, un confronto tra i valori di ΔBRET ottenuti 15 minuti dopo la stimolazione dell'agonista con 10 μM di WIN-55,212-2 in HEK CB1 e le cellule hek wt illustrano l'attivazione CB1R-dipendente della via di segnalazione Gi3 (Figura 4D).

Figura 4: Valutazione del sensore della proteina Gi3 nelle cellule HEK CB1. Letture cinetiche del ΔBRET dopo l'aggiunta dell'agonista WIN-55,212-2 alle cellule HEK CB1 (A) o HEK wt (B). Curve dose-risposta ottenute adattando i valori di ΔBRET (%) dopo 15 minuti di stimolazione del ligando contro la concentrazione del ligando (C). Confronto dei valori massimi ΔBRET tra le cellule HEK wt di controllo e le cellule HEK CB1 stimolate con WIN-55.212-2 (D). La differenza statistica rispetto alla condizione di peso HEK è stata testata utilizzando un test di Mann-Whitney non parametrico (****p < 0,0001). I dati mostrano ± SEM medio di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in duplicato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.