Saggio della cometa per quantificare il danno al DNA nelle cellule 32D che esprimono mutanti FLT3 dopo l'esposizione a inibitori FLT3 di tipo I e II

La leucemia mieloide acuta (LMA) rappresenta una malattia clonale delle cellule staminali ematopoietiche definita dall'espansione patologica dei progenitori mieloidi indifferenziati, con conseguente soppressione ematopoietica e insufficienza del midollo osseo. L'intrinseca eterogeneità molecolare della LMA pone sfide terapeutiche significative¹. Di particolare significato clinico, le mutazioni della tirosin-chinasi 3 (FLT3) simili alla FMS costituiscono una delle alterazioni genetiche più prevalenti nella LMA, che si verificano in circa il 30% dei casi, e dimostrano una forte correlazione con gli esiti clinici avversi². La tirosin-chinasi del recettore FLT3 subisce un'attivazione a livello della membrana plasmatica per mediare le cascate di segnalazione PI3K/AKT e RAS/MAPK, mentre la variante mutante FLT3-ITD viene mantenuta all'interno del reticolo endoplasmatico, inducendo la fosforilazione persistente del trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 5 (STAT5). Queste alterazioni genetiche guidano la leucemogenesi attraverso molteplici meccanismi oncogenici, principalmente attraverso la disregolazione della trasduzione del segnale, la segnalazione proliferativa incontrollata e la resistenza apoptotica³.

AC220 e gilteritinib, come tipici inibitori di FLT3, inibiscono la proliferazione cellulare e inducono l'apoptosi sopprimendo l'espressione di FLT3, ma con meccanismi d'azione diversi. Gilteritinib (un inibitore di tipo I) non solo copre uno spettro più ampio di mutazioni attivanti FLT3, ma inibisce anche la tirosina chinasi AXL, che è strettamente correlata a FLT3. Attraverso la doppia inibizione, gilteritinib può bloccare la crescita delle cellule tumorali in modo più completo⁴. AC220 (un inibitore di tipo II) esercita il suo effetto inibitorio attraverso il legame competitivo alla conformazione chinasica attivata, mirando specificamente alla tasca di legame dell'ATP con elevata specificità⁵. Questa inibizione può portare all'arresto del ciclo cellulare e all'aumento dello stress di replicazione del DNA.

Gilteritinib è associato a un basso rischio di resistenza ed è indicato per la monoterapia nella LMA con mutazione FLT3 recidivante/refrattaria. AC220 è efficace e selettivo per le mutazioni FLT3-ITD, con buoni tassi di risposta clinica, ma è inefficace per le mutazioni FLT3-TKD e può essere resistente alle mutazioni FLT3-TKD dovute a mutazioni secondarie FLT3-TKD (ad esempio, D835 o F691L) allo sviluppo di resistenza. Questi inibitori hanno acquisito importanza nelle terapie per la LMA sulla base della dimostrata efficacia clinica e del miglioramento degli indici terapeutici⁶. Tuttavia, l'uso clinico di questi farmaci è messo alla prova dalla resistenza acquisita e dagli effetti fuori bersaglio. L'uso a lungo termine di AC220 in clinica porta a resistenza dovuta a mutazioni FLT3-TKD, mentre l'uso a lungo termine di gilteritinib può avere limitazioni per mutazioni composte (ad esempio, FLT3-ITD combinato con TKD) anche se non provoca resistenza a causa di mutazioni FLT3-TKD ^7,8.

Queste due classi di inibitori di FLT3 esercitano un duplice effetto terapeutico inducendo indirettamente lo stress replicativo attraverso l'inibizione di FLT3 e il blocco della via di segnalazione proliferativa-RAS-MAPK, PI3K-AKT-mTOR, STAT5. Il blocco della proliferazione cellulare di solito porta all'arresto del ciclo cellulare, a disturbi metabolici (disregolazione dell'omeostasi redox) e, infine, all'apoptosi ^9,10. Questo meccanismo genera lesioni del DNA che attivano adattamenti compensatori della riparazione del DNA nelle popolazioni cellulari resistenti. Il test della cometa consente il confronto quantitativo dei profili di danno al DNA specifici dell'inibitore nelle cellule mutanti FLT3. Questo approccio sperimentale fornisce informazioni critiche per lo sviluppo di terapie di combinazione razionali che sfruttano le vulnerabilità del danno al DNA, superando così la resistenza terapeutica acquisita.

Le metodologie contemporanee per la rilevazione dei danni al DNA comprendono l'analisi immunoistochimica, l'elettroforesi su gel di agarosio di frammenti di DNA, la reazione a catena della polimerasi (PCR) e il sequenziamento di nuova generazione (NGS), ciascuno dei quali dimostra un'elevata sensibilità analitica e specificit๹. Tuttavia, questi approcci sono limitati da requisiti finanziari sostanziali, durate di lavorazione prolungate e condizioni sperimentali rigorose. Ciò sottolinea l'imperativo di adottare strategie di rilevamento che bilancino la precisione analitica con la semplicità operativa.

Il saggio della cometa è stato ampiamente utilizzato nella tossicologia ambientale e nella valutazione della genotossicità grazie alla sua sensibilità superiore, all'accessibilità tecnica, alla quantificazione del danno al DNA visualizzato e all'ampia applicabilità nei sistemi biologici^12,13. Sono state stabilite tre principali varianti metodologiche: il saggio della cometa alcalina per il rilevamento della rottura del singolo/doppio filamento, il saggio della cometa neutra per l'analisi della rottura del doppio filamento e il saggio della cometa modificata con enzimi per l'identificazione di lesioni specifiche del DNA. ¹⁴

Il principio metodologico prevede: (1) l'induzione di rotture del filamento di DNA attraverso un trattamento sperimentale; (2) Dissoluzione mediata da tampone di lisi di membrane cellulari e nucleari, consentendo la diffusione citoplasmatica/nucleare di proteine e RNA in tampone per elettroforesi, mentre il DNA ad alto peso molecolare rimane immobilizzato nella matrice di agarosio; (3) Denaturazione alcalina (pH > 13) che induce lo svolgimento del DNA e la liberazione di frammenti di DNA danneggiati; (4) Migrazione anodica elettroforetica guidata dal campo di DNA frammentato che crea una caratteristica morfologia cometaria, con DNA intatto che mantiene la struttura nucleoide sferica^15,16. La quantificazione del danno al DNA si ottiene attraverso l'analisi computerizzata della percentuale di DNA della coda (TDP), fornendo una misurazione precisa dell'impatto genotossico alla risoluzione di una singola cellula¹⁷.

Questa indagine ha impiegato un quadro sperimentale sistematico per confrontare gli effetti genotossici differenziali di gilteritinib e AC220 in cellule 32D FLT3-mutanti convalidate. Il disegno sperimentale comprendeva due componenti principali: (i) la definizione di un modello di danno al DNA specifico per la mutazione FLT3 e (ii) la valutazione quantitativa del danno al DNA indotto da farmaci attraverso la metodologia del saggio della cometa alcalina. La linea cellulare 32D con mutazione FLT3 è stata mantenuta in condizioni standard in vitro prima dell'esposizione a inibitori FLT3 diluiti in serie. La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando saggi CCK-8, con successivo calcolo dei valori di concentrazione inibitoria semimassimale (IC₅₀) attraverso l'analisi di regressione non lineare. Un valore IC₅₀ quintuplo è stato scelto come soglia di induzione del danno al DNA. Le cellule trattate con il farmaco sono state raccolte e incorporate in agarosio a basso punto di fusione su vetrini per la successiva analisi. La separazione elettroforetica è stata eseguita a 24 V (~0,74 V/cm) e 300 mA per 30 minuti in tampone alcalino, durante il quale il DNA frammentato è migrato anodicamente per formare la caratteristica morfologia della cometa, mentre il DNA intatto ha mantenuto la configurazione nucleoide sferica. La quantificazione del danno al DNA è stata ottenuta attraverso il progetto software CASP (Comet Assay Software) per l'analisi computerizzata delle immagini che misura il momento di coda, con un aumento dei valori del momento di coda di oliva direttamente correlato all'entità della frammentazione del DNA.

1. Costruzione di un modello di danno al DNA in cellule 32D con mutazioni FLT3-ITD ¹⁸

1. Recupero cellulare
   1. Utilizzando una pinza, trasferire rapidamente le cellule 32D mutanti FLT3-ITD crioconservate (conservate a -80 °C). Recuperare i crioviali utilizzando una pinza e immergerli immediatamente in un bagno d'acqua a temperatura regolata (37 °C ± 0,5 °C) per esattamente 60 s per completare lo scongelamento controllato.
      NOTA: Durante lo scongelamento, agitare a intermittenza i crioviali nel bagno d'acqua per garantire un riscaldamento uniforme.
   2. Centrifugare i campioni crioconservati a 150 × g per 5 minuti a 25 °C ± 1 °C. Aspirare con cura il surnatante utilizzando pipette sierologiche sterili conservando il pellet cellulare.
   3. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura completo (RPMI 1640 + 10% siero fetale bovino + 1% penicillina/streptomicina) alla provetta per crioconservazione. Eseguire una triturazione delicata attraverso 10 cicli di pipettaggio sequenziali (volume da 1 mL) per garantire una risospensione completa. Trasferire la sospensione cellulare in una piastra per colture cellulari da 100 mm e aggiungere 7 mL di terreno completo per ottenere un volume finale di 8 mL.
   4. Agitare delicatamente il recipiente di coltura con cinque movimenti orizzontali e cinque movimenti rotatori. Mantenere le cellule in un incubatore umidificato a 37,0 °C ± 0,2 °C con il 5% di CO₂ e il 95% di umidità. Incubare per 24 ore prima dell'elaborazione sperimentale.
2. Valutazione della vitalità cellulare
   1. Selezionare le cellule 32D mutanti FLT3-ITD nella fase di crescita logaritmica con un buon stato cellulare per l'esperimento.
      NOTA: Le cellule nella fase di crescita logaritmica di solito hanno un ciclo di divisione breve e un'alta frequenza di divisione cellulare.
      1. Osservare la morfologia e lo stato di crescita delle cellule 32D mutate in FLT3-ITD utilizzando un microscopio elettronico. Assicurarsi che i criteri per le soglie di proliferazione cellulare siano soddisfatti: cercare cellule che abbiano la forma di un singolo globulo con bordi lisci, dispersione uniforme, pochi aggregati, dimensioni cellulari uniformi, integrità della membrana plasmatica intatta e detriti cellulari < 5%.
   2. Utilizzare un contatore di cellule per determinare la concentrazione della sospensione cellulare.
      NOTA: Miscelare le sospensioni cellulari (10 cicli di pipettaggio sequenziali utilizzando puntali sterili da 1 mL al 50% della velocità massima della pipetta).
   3. Standardizzare la sospensione cellulare a 2,0 × 10⁵ cellule/mL in un terreno di crescita completo utilizzando la diluizione iterativa. Utilizzando una pipetta, erogare aliquote da 50 μl nei pozzetti centrali (B2-G7) di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Riempire i pozzetti periferici (A1-H12) con 100 μL di PBS sterile per mantenere l'umidità e ridurre al minimo gli effetti dell'evaporazione dei bordi.
   4. Preparazione del terreno contenente inibitore FLT3: selezionare nove pozzetti in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti ed etichettarli secondo la scala di concentrazione dell'inibitore FLT3 (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250, 500 e 1000 nM). Aggiungere 400 μL di terreno completo ai pozzetti etichettati con 10,0 μM e 200 μL di terreno completo ai pozzetti rimanenti.
      1. Diluizione di Gilteritinib: aggiungere 4 μL di reagente Gilteritinib da 100 μM (Gilteritinib in dimetilsolfossido) a ciascuno dei pozzetti etichettati con 1000 nM utilizzando una pistola pipettatrice e miscelare accuratamente la soluzione. Pipettare 200 μL di Gilteritinib da 1000 nM nei pozzetti marcati con 500 nM e mescolare; quindi pipettare 200 μl di Gilteritinib da 500 nM nei pozzetti etichettati con 250 nM e mescolare. Ogni volta, prelevare 200 μl della diluizione precedente nel pozzetto successivo e mescolare per ottenere la concentrazione desiderata.
      2. Diluizione AC220: aggiungere 4 μl di reagente AC220 da 100 μM (AC220 in dimetilsolfossido) a ciascuno dei pozzetti etichettati con 1000 nM utilizzando una pistola per pipette. Seguire il passaggio 1.2.4.1 per gli altri pozzetti.
         NOTA: Assicurarsi che la soluzione madre dell'inibitore FLT3 nella pipetta sia completamente trasferita nei pozzetti per evitare residui di soluzione. Assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata prima di procedere con la diluizione.
   5. Incubazione: Erogare il terreno contenente inibitori FLT3 in appositi pozzetti (50 μL/pozzetto) utilizzando una pipetta. Mantenere la piastra a 96 pozzetti in condizioni di coltura fisiologiche (37,0 °C ± 0,2 °C, 5% CO₂, 95% di umidità) per esattamente 72 ore ± 15 minuti.
   6. Aliquotare 10 μL di reagente CCK-8 in tutti i pozzetti di controllo sperimentali e in bianco utilizzando una pipetta. Proteggere la piastra dalla luce e incubarla in condizioni normossiche (37 °C, 5% CO₂) per 2,0 H ± 10 min.
      NOTA: Erogare il reagente a bassa velocità della pipetta con una profondità di immersione del puntale di 2 mm per ridurre al minimo la formazione di bolle. Evitare la formazione di bolle d'aria durante l'aggiunta del campione per evitare interferenze con le letture OD.
   7. Rimuovere la piastra a 96 pozzetti dall'incubatore e misurare l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Registra i risultati.
   8. Calcolare la % di inibizione secondo la formula di calcolo IC₅₀ :
      Inibizione (%) = × 100%
      Il pozzetto sperimentale del farmaco denota pozzetti cellulari trattati con il farmaco. Il pozzetto di controllo cellulare denota i pozzetti cellulari che non sono stati trattati con il farmaco. I pozzetti di controllo in bianco indicano solo il fluido senza celle.
   9. Analizzare i dati dose-risposta normalizzati attraverso la regressione non lineare, utilizzando un modello logistico a quattro parametri. Fare clic sul pulsante Raccordo curva (Fitting Curve) per l'adattamento della curva. Ricavare la concentrazione inibitoria semimassimale (IC₅₀) dalla convergenza del modello (R² > 0,98, somma residua dei quadrati < 0,15) e calcolare gli intervalli di confidenza al 95% attraverso il ricampionamento bootstrap di 1000 iterazioni.
3. Esperimento di danno al DNA di cellule 32D con mutazione FLT3-ITD indotta da un inibitore di FLT3
   1. Selezionare le cellule 32D mutanti FLT3-ITD che mostrano uno scatto di crescita (tempo di raddoppio della popolazione < 24 ore) per la valutazione del danno al DNA.
   2. Contare le celle (vedere il passaggio 1.2.2 per i dettagli).
   3. Semina cellulare: regolare la densità della sospensione cellulare a 1 × 10⁶ cellule per piastra, utilizzando una piastra di 6 cm di diametro e 4 ml di sospensione cellulare per piastra.
   4. Preparare tre repliche per ogni concentrazione di inibitore: 55 nM gilteritinib: 4 mL di terreno + 2,2 μL di stock da 100 μM, 0,15 nM AC220: 4 mL di terreno + 6 μL di stock da 100 nM. Mescolare le soluzioni a vortice ed equilibrarle a 37 °C per 15 min; Agitare delicatamente i tubi per garantire un'adeguata miscelazione. Aspirare il terreno originale e sostituirlo con 4 mL/piatto di terreno contenente inibitori appena preparato utilizzando pipette sierologiche sterili.
   5. Incubare le cellule trattate in condizioni fisiologiche (37 °C, 5% CO₂, 95% di umidità) per intervalli definiti (0, 2, 4, 6 H). Elaborate immediatamente i controlli a tempo zero per la valutazione del danno al DNA di base.
   6. Saggio di esclusione del blu di tripano
      1. Centrifugare le cellule raccolte a 150 × g per 1 minuto. Scartare il surnatante e risospendere le cellule con 1 mL di terreno di coltura.
      2. Pipettare 100 μl di cellule risospese in una provetta da centrifuga di plastica, aggiungere 100 μl di colorante blu di tripano (2x), mescolare delicatamente e colorare per 3 minuti.
      3. Contare le celle (vedere il passaggio 1.2.2 per i dettagli).
      4. Calcolare la vitalità cellulare come segue:
         %Sopravvivenza cellulare = × 100%
         NOTA: Solo i campioni con vitalità ≥90% sono stati processati per il test della cometa.

2. Preparazione del reagente e preparazione del campione cellulare

1. Equilibrare la soluzione di lisi (contenente 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1% Triton X-100, 10% DMSO) a 4 °C ± 0,5 °C per 30 minuti utilizzando un frigorifero.
2. Sciogliere l'agarosio bassofondente (LMA) a 95 °C per 15 minuti, quindi tenerlo a bagnomaria a 37 °C per evitare la solidificazione.
3. Preparare il tampone per elettroforesi alcalina (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH >13) pesando 12 g di NaOH utilizzando una bilancia elettronica, pipettando 2 mL di soluzione 500 mM EDTA e quindi aggiungendo ddH₂O per ottenere fino a 1 L di tampone.
4. Prelievo di cellule
   1. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare le sospensioni cellulari a 800 × g per 5 min. Aspirare i surnatanti utilizzando la filtrazione sottovuoto.
      1. Risospendere delicatamente le cellule in 1 mL di terreno completo utilizzando puntali per pipette a foro largo da 1 mL, seguiti da 10 inversioni verticali.
      2. Contare le celle come nel passaggio 1.2.
      3. Centrifugare la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL a 150 × g per 5 minuti per rimuovere l'intero terreno. Risospendere le cellule lavate in PBS privo di calcio a ~5,0 × 10⁵ cellule/mL.

3. Procedura di analisi della cometa

1. Preparare in anticipo i vetrini del saggio delle comete e i campioni di cellule. Preparare una miscela 10:1 (v/v) di agarosio LMA e sospensione cellulare (5 × 10⁵ cellule/mL) in provette da 1,5 mL utilizzando una pipetta e mescolare delicatamente. Erogare 55 μL di aliquote della miscela di cellule di agarosio sui vetrini cometa utilizzando una pipetta tenuta a un angolo di 45°, mantenendo una distanza di 2 mm dalla superficie del vetrino. Posizionare i vetrini rivestiti con la miscela a 4 °C per 30 minuti per evitare la luce.
   NOTA: Durante l'aggiunta della LMA e della miscela cellulare ai vetrini del saggio della cometa, erogare la sospensione lentamente e in modo uniforme per prevenire la formazione di bolle e garantire una distribuzione omogenea del gel.
2. Immergere i vetrini solidificati in una soluzione di lisi preraffreddata (contenente 2,5 M di NaCl, 100 mM di EDTA, 10 mM di Tris, pH 10, 1% di Triton X-100, 10% di DMSO) ed eseguire la lisi per ≥1 ora a 4 °C in condizioni di protezione dalla luce.
3. Dopo la lisi, rimuovere il vetrino dal lisato e utilizzare una pistola per pipette per aspirare quanto più liquido possibile attorno alla paletta. Quindi posizionare il vetrino in tampone per elettroforesi alcalina (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH >13) e pre-equilibrare per 1 ora a 4 °C, facendo attenzione a evitare la luce.
4. Elettroforesi: posizionare i vetrini in una camera di elettroforesi e aggiungere una quantità sufficiente di soluzione alcalina per elettroforesi per immergere i vetrini. Condurre l'elettroforesi a 24 V (equivalente a 0,74 V/cm) con corrente costante (300 mA) per 30 minuti utilizzando un tampone pre-bilanciato (4 °C) per ridurre al minimo i danni al DNA.
5. Neutralizzazione: Dopo l'elettroforesi, utilizzare una pistola per pipette per aspirare la soluzione alcalina per elettroforesi dal vetrino, immergere i vetrini per 2 x 5 minuti in dH₂O, quindi immergerli in etanolo al 70% per 5 minuti. Asciugare i vetrini in un'incubatrice a 37 °C per 15 minuti.
6. Colorazione: Applicare un'aliquota da 100 μl di colorante di acido nucleico 1x YeaRed per pozzetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in condizioni di protezione dalla luce. Rimuovere le macchie in eccesso con un delicato risciacquo acquoso seguito da asciugatura termica a 37 °C.
7. Imaging: Esecuzione della visualizzazione a fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo 4x, con acquisizione di immagini digitali condotta in condizioni di esposizione standardizzate.

4. Trattamento dei dati

1. Esegui l'analisi quantitativa delle immagini per determinare i parametri standard della cometa, tra cui il DNA della coda (%), il momento della coda dell'oliva e la lunghezza della coda (μm).
   1. Aprire l'interfaccia del software (Figura 5).
   2. Importare un'immagine nel software, fare clic su File, quindi fare clic su Seleziona file per importare l'immagine che si desidera analizzare nel software. Quindi, tieni premuto il pulsante del mouse e trascina finché non viene visualizzata una casella blu. Trascinare la casella blu per assicurarsi che la cella che si desidera analizzare sia racchiusa all'interno della casella. L'opzione Regola nella figura può essere utilizzata per regolare la posizione della cornice in modo da includere l'intera cella (Figura 5).
   3. Prima di iniziare l'analisi, fare clic su Avvia, quindi su Analizza. I risultati dell'analisi a cella singola verranno visualizzati sul lato destro sotto "Profili". Dopo aver analizzato ogni cella, fai clic su Salva. I parametri che possono essere rilevati vengono visualizzati sul lato destro di "Profili" e i valori numerici dei vari parametri vengono visualizzati nella parte inferiore. Infine, fai clic su File | Esporta risultati. I risultati ottenuti includono HeadArea, TailArea, HeadDNA, TailDNA, HeadDNA%, TailDNA%, HeadRadius, TailLength, CometLength, HeadMeanX, TailMeanX, TailMoment e OliveTailMoment.

Il test della cometa è stato sistematicamente impiegato per quantificare i profili differenziali di danno al DNA indotti da gilteritinib e AC220 in linee cellulari mutanti FLT3. Le analisi hanno mostrato che la differenza nel danno al DNA tra le popolazioni cellulari non trattate con gilteritinib e AC220 non era statisticamente significativa (P > 0,05). Aumenti dose-dipendenti dei valori di DNA della coda (%) e di Olive Moment Tail (OMT) hanno raggiunto la significatività statistica (P < 0,05) dopo esposizioni di 2-6 ore. L'OMT rappresenta il prodotto della % di DNA nella coda e della "distanza tra il centro di gravità della fluorescenza testa-coda". Le differenze tra il DNA della coda (%) e la coda del momento dell'olivo (OMT) indicano che l'AC220 causa più danni al DNA alle cellule rispetto a gilteritinib (Figura 3 e Figura 4). In conclusione, questo paradigma sperimentale stabilisce in modo definitivo che il saggio della cometa può aiutare a valutare le differenze di danno al DNA degli inibitori di FLT3 in modelli cellulari mutanti.

Figura 1: Scia di cometa prodotta da cellule mutanti FLT3 in risposta a 55 nM gilteritinib. Cellule mutanti FLT3 (A) non trattate con gilteritinib, (B) dopo 2 ore di trattamento con gilteritinib, (C) dopo 4 ore di trattamento con gilteritinib, (D) dopo 6 ore di trattamento con gilteritinib. La freccia indica la cometa che ha prodotto una coda evidente dopo il trattamento chimico. Barra della scala = 1.000 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Scia di cometa prodotta da cellule mutanti FLT3 in risposta a 0,15 nM AC220. Cellule mutanti FLT3 (A) non trattate con AC220, (B) dopo 2 ore di trattamento con AC220, (C) dopo 4 ore di trattamento con AC220, (D) dopo 6 ore di trattamento con AC220. La freccia indica la cometa che ha prodotto una coda evidente dopo il trattamento chimico. Barra della scala = 1.000 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Effetti di gilteritinib e AC220 sulla percentuale di DNA della coda delle cellule FLT3-mutanti. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, vs 0 H cellule non trattate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Effetti di gilteritinib e AC220 sull'OMT delle cellule FLT3-mutanti. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, vs 0 H cellule non trattate. Abbreviazione: OMT = Coda del momento dell'oliva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Procedure operative del software CASP Comet Analysis. (A) Schermata di visualizzazione dopo l'apertura del software, (B) Interfaccia di visualizzazione dopo aver importato correttamente le immagini. L'interfaccia viene visualizzata dopo aver importato correttamente le immagini. Cliccando sul pulsante REGOLA si aprirà il riquadro rettangolare bianco con cui inquadrare le singole comete. (C) Fare clic sul pulsante di analisi nella barra degli strumenti. Il software fornirà i seguenti parametri: % DNA della coda, momento della coda, momento della coda dell'oliva, ecc. (D) Pulsanti utilizzati durante il funzionamento.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.