Un protocollo basato sulla fluorescenza per lo screening preliminare degli inibitori della sintesi proteica da fonti naturali

Summary

Questo protocollo introduce una metodologia di screening fluorometrica ottimizzata per identificare inibitori naturali di prodotti e piccole molecole nella sintesi proteica. La sua praticità lo rende adatto sia all'istruzione triennale sulle tecniche di scoperta di farmaci sia all'applicazione in campagne di chimica medicinale.

Abstract

I prodotti naturali rappresentano una ricca fonte di composti terapeutici con applicazioni in molteplici malattie, in particolare il cancro. Sfruttando queste biomolecole come modelli strutturali nella scoperta di farmaci, i ricercatori hanno ottenuto sia tempi di sviluppo più rapidi sia una maggiore efficacia biologica rispetto ai composti completamente sintetici. La via di sintesi proteica è emersa come un bersaglio convincente per i prodotti naturali, soprattutto considerando il suo coinvolgimento nei tumori difficili da trattare. Il potente inibitore della sintesi proteica cicloessimide, derivato da Streptomyces griseus, esemplifica il potenziale dei composti naturali in questo ambito. Man mano che questi derivati di prodotti naturali vengono sviluppati in molecole simili a un farmaco, confermare la loro attività inibitoria della sintesi proteica rimane un passaggio cruciale per la validazione. L'obiettivo principale è fornire un protocollo adatto agli studenti universitari per una rapida valutazione dell'attività inibitoria del composto. Il protocollo impiega un substrato fluorescente e tecniche avanzate di microscopia a fluorescenza per rilevare e misurare sistematicamente le capacità inibitorie di questi prodotti naturali. Lo studio ha esaminato composti derivati da due specie vegetali: Pinus sylvestris e Psoralea corylifolia. Utilizzando la cicloessimide come inibitore di riferimento, entrambi i prodotti naturali hanno mostrato diversi livelli di inibizione della sintesi proteica.

Introduction

La sintesi proteica coinvolge processi altamente regolamentati: trascrizione e traduzione. Durante la trascrizione, vengono copiate sequenze di DNA dei geni, producendo RNA messaggero (mRNA). L'enzima RNA polimerasi agisce per separare la doppia elica del DNA e utilizza un filamento come guida per costruire una molecola di mRNA corrispondente. Una volta che l'mRNA è completamente formato, viaggia dal nucleo fino al citoplasma per la traduzione. La traduzione avviene nel ribosoma, dove l'mRNA viene utilizzato come modello per assemblare gli amminoacidi in una catena polipeptidica. Questa catena polipeptidica, esce dal tunnel di uscita del ribosoma, viene piegata in una proteina funzionale. La trascrizione è regolata principalmente da fattori di trascrizione, modifiche della cromatina e RNA regolatori, mentre la traduzione è regolata da fattori di iniziazione, vie di segnalazione e meccanismi di stabilità dell'RNA. Questi sistemi regolatori permettono alle cellule di mantenere le funzioni cellulari e di rispondere efficacemente a stress o^{danni 1}.

La stragrande maggioranza dei tumori umani—circa l'85%—si manifesta come tumori^{solidi 2}. Sebbene questi tumori possano variare notevolmente nelle loro caratteristiche e comportamenti specifici, tendono a condividere alcune caratteristiche e schemi fisiologici comuni, come la sintesi proteica sovraregolata indipendentemente dalla loro eziologia o posizione^{anatomica 3}. Le cellule tumorali disregolano la sintesi proteica dirottando i meccanismi traslazionali per sostenere le loro elevate esigenze energetiche e la crescita incontrollata. Questa riprogrammazione è il risultato della disregolazione di quasi tutte le principali vie di segnalazione oncogeniche, favorendo la sopravvivenza cellulare, la proliferazione e la metastasi, sopprimendo al contempo le vie della morte^{cellulare 4}. Nelle cellule tumorali, il meccanismo per la produzione dei ribosomi entra in sovraccarico, permettendo una maggiore produzione proteica e una rapida divisione cellulare. Poiché questa sintesi proteica potenziata è cruciale per la sopravvivenza al cancro, i trattamenti che mirano e bloccano questo processo mostrano potenziali^{terapie 5}. Pertanto, ricerche focalizzate su fattori di traduzione specifici per il cancro, composizioni ribosomiche uniche o vie di segnalazione alterate che regolano la sintesi proteica potrebbero produrre inibitori più mirati con migliori fenestrate terapeutiche.

Poiché i prodotti naturali (NP) sono noti per la loro ampia gamma di attività biologica, lo sviluppo di inibitori selettivi della sintesi proteica per il trattamento del cancro utilizzando i loro impalcature è un approccio^{promettente 6,7}. Gli NP possono colpire diversi componenti della macchina della sintesi proteica, dal legame dei ribosomi all'interferenza con fattori di iniziazione o processi di allungamento, rendendoli punti di partenza preziosi nello sviluppo di farmaci per inibitori della sintesi proteica nei tumori^{solidi 6}. La capacità di selezionare rapidamente i composti per l'attività desiderata rappresenta un punto di ingresso cruciale per le piattaforme di scoperta di farmaci che cercano di identificare in modo efficiente i risultati NP. Tipicamente, lo screening ad alto rendimento dei composti utilizza saghi di fluorescenza per restringere rapidamente le molecole candidate^{al piombo 8}.

Gli scienziati di tutto il mondo si affidano a tecniche basate sulla fluorescenza come strumenti essenziali per analizzare i sistemi biologici. Questi approcci sono ampiamente utilizzati per studiare i processi cellulari, permettendo ai ricercatori di tracciare le interazioni biomolecolari in tempo^{reale 9}. Quando combinati con reazioni bio-ortogonali di click-chimica, questi metodi possono consentire una visualizzazione precisa della sintesi^{proteica 10}. Il saggio di sintesi proteica fluorescente presentato è una tecnica non radioattiva per valutare la sintesi proteica che utilizza O-propargil-puromicina (OPP), un analogo cellulopermeabile contenente alchino puromico. Dopo il trattamento cellulare, l'OPP viene incorporata al C-terminale delle catene polipeptidiche allungate, causando la terminazione della traslazione. Queste proteine troncate marcate con alchino vengono poi rilevate tramite chimica a clic catalizzata dal rame abbinata a 5 FAM-azide.

Questo saggio fluorometrico è uno strumento di ricerca prezioso e un metodo accessibile di biologia chimica per la formazione degli studenti universitari. Fornendo un protocollo accessibile ed efficiente con un trattamento minimo dei dati, offre agli studenti un'esperienza pratica nelle tecniche moderne di scoperta di farmaci e accelera il processo di scoperta di farmaci. Con la crescita della domanda di nuovi inibitori della sintesi proteica, questo approccio offre agli studenti universitari opportunità di ricerca significative, contribuendo al contempo ai progressi nelle terapie oncologiche.

Protocol

1. Preparazione dei reagenti dal kit

NOTA: Mescolare adeguatamente, centrifuga e tieni tutti i reagenti sul ghiaccio fino all'uso.

1. Organizzare e ottenere il kit di inibizione della sintesi proteica, il tampone PBS, il mezzo di coltura cellulare, le piastre trattate con coltura cellulare, i tubi centrifughe sterili conici sterili in polipropilene da 15 mL, i tubi centrifughe da 2 mL, le pipette p10, p200 e p1000, e le punte appropriate.
2. Prepara il buffer di lavaggio.
   1. Scongela il buffer di lavaggio 10x a 37 °C copponendo la fiala con la mano. Usa il calore corporeo delle mani per lo scongelamento e controlla spesso se lo scongelamento è completo.
   2. Diluire le 10x di calci di lavaggio 1:10 in acqua deionizzata in un tubo centrifuga. Mescola per inversione o risospensione pipettando su e giù. Conserva sul ghiaccio fino all'uso.
3. Scongelare la soluzione fissativa a temperatura ambiente. Conserva sul ghiaccio fino all'uso.
4. Prepara il buffer di permeabilizzazione.
   1. Scongelare il buffer di permeabilizzazione 10x a 37 °C copponendo la fiala con la mano. Usa il calore corporeo delle mani per lo scongelamento e controlla spesso se lo scongelamento è completo.
   2. Diluire la 10x 1x 1:10 in acqua deionizzata in un tubo centrifuga. Mescola i componenti tramite inversione o risospensione facendo pipette su e giù. Conserva sul ghiaccio fino all'uso.
5. Scongelare 400x marcatore proteico, 100x azide fluorescente, 100x cicloessimide, colorazione DNA e l'agente riduttore 20x a temperatura ambiente. Tieni su ghiaccio in un ambiente buio durante l'uso. Copri i coloranti con della carta stagnola o conservali in un frigorifero a 2 °C quando non li usi.

2. Marcatura delle cellule di controllo e sperimentali

NOTA: Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando cellule stabili di tumore al seno epiteliale MDA-MB-231. Possono essere utilizzate linee cellulari aderenti. Tutti i passaggi elencati di seguito utilizzano una piastra a 96 pozzi, e tutti i volumi e le concentrazioni sono calcolati per due composti di prova e due controlli con un volume di lavoro di 100 μL.

1. Coltivazione di cellule aderenti di mammiferi
   NOTA: Le cellule devono essere eliminate prima di raggiungere l'80-90% di confluenza per mantenere una crescita sana ed esponenziale e prevenire l'inibizione o la differenziazione da contatto.
2. Scongelare una fiala di cellule criopriservate a temperatura ambiente, poi diluirla con il mezzo appropriato.
3. Centrifuga la sospensione per pelletare le cellule e aspirare il soprantantante. Risospendere il pellet in un mezzo fresco e trasferire in una nuova fiaschetta alla densità cellulare appropriata.
4. Una volta che le cellule sono confluenti all'80%, rimuovere il substrato e aspirare il substrato di crescita vecchia dalla fiaschetta. Poi, risciacquare le cellule con PBS sterile per rimuovere il siero residuo, che inibisce la tripsina. Aggiungere la soluzione di tripsina-EDTA per coprire lo strato cellulare e incubare per 3-5 minuti o fino a quando le cellule si staccano a 37 °C.
5. Aggiungi un mezzo intero contenente siero per inattivare la tripsina, poi trasferisci la sospensione cellulare in un tubo, mescola delicatamente e conta le cellule.
6. Le cellule seme nelle placche di screening diluiscono le cellule al rapporto di divisione appropriato (ad esempio, 1:3 o 1:5) in fiaschette fresche con nuovo substrato e incubano (tipicamente 37 °C, 5% CO₂) per ottenere la concentrazione cellulare desiderata.
   NOTA: Per l'esperimento descritto qui, la linea cellulare è stata placcata a 2 × 10⁴ per pozzo (piastra a 96 pozzi) e incubata a 37 °C per 12 ore.

3. Aggiunta di composti

1. Prepara il master mix A.
   1. Etichetta un tubo centrifuga come "A". Pipetta 598,5 μL di mezzo colturale e 1,5 μL di marcatore proteico in "A". Risospendere la miscela per garantire l'omogeneità pipettando su e giù.
2. Prepara il master mix B.
   1. Etichetta un tubo centrifuga come "B". Pipetta 1,5 μL di marcatore proteico, 6,6 μL di cicloessimide e 591,9 μL di mezzo colturale in "B". Risospendere la miscela per garantire l'omogeneità pipettando su e giù.
3. Trattare le cellule con composti desiderati (Figura 1), controlli positivi e negativi.
   1. Rimuovere le cellule dall'incubatore e rimuovere il mezzo di crescita tramite aspirazione. Inclinare la piastra e aspirare sul lato del pozzo invece che al centro per evitare disturbi delle celle.
   2. Pipetta 1 μL di composto di prova in un pozzo e 1 μL di veicolo composto di prova (0,1% v/v DMSO) in un pozzo. Per gli studi duplicati, aggiungi ogni campione a un secondo pozzo e ripeti questo processo. Aggiungi 99 μL di master mix A in questi pozzi. Pipetta delicatamente ad angolo verso il lato del pozzo per prevenire la rottura cinetica delle cellule.
      NOTA: La concentrazione massima di DMSO per lo screening dei composti dipende dal tipo cellulare e dal saggio, ma le linee guida generali sono: 0,1-0,5% DMSO - generalmente sicuro per la maggior parte degli saggi cellulari con tossicità minima, e 1% DMSO - massimo comunemente usato e accettabile per molti tipi cellulari in saghi a breve termine.
   3. Pipetta 100 μL di master mix B in due pozzi. Pipetta ad angolo verso il lato del pozzo per evitare la distruzione delle cellule.
   4. Tocca delicatamente la piastra per ottenere l'incorporazione dei componenti desiderati nelle celle. Incubare le cellule a 37 °C per 0,5-2 ore.

4. Terminazione dell'esperimento e lavaggio delle cellule

1. Rimuovere il mezzo di coltura tramite aspirazione. Inclinare la piastra e aspirare sul lato del pozzo invece che al centro per evitare disturbi delle celle.
2. Aggiungi 100 μL di PBS buffer in ogni pozzo e centrifuga la piastra a 900 × g per 5 minuti.
3. Rimuovere il buffer PBS tramite aspirazione.

5. Fissazione e permeabilizzazione

1. Aggiungi 100 μL di soluzione fissativa in ciascun pozzo. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 15 minuti in un ambiente buio.
2. Rimuovi la soluzione fissativa tramite aspirazione. Inclina la piastra e aspira sul lato del pozzo invece che al centro.
3. Lavare le celle con 100 μL di tampone di lavaggio e rimuovere il tampone tramite aspirazione. Ripeti questo passaggio due volte.
4. Aggiungi 100 μL di buffer di permeabilizzazione a ciascun pozzo e incuba a temperatura ambiente per 10 minuti.
5. Rimuovere il buffer di permeabilizzazione tramite aspirazione. Inclina la piastra e aspira sul lato del pozzo invece che al centro.

6. Reazione proteica e colorazione

1. Prepara il mix master cocktail di reazione.
   1. Aggiungere 651 μL di buffer PBS, 7,0 μL di reagente di rame 100x, 7 μL di azide fluorescente e infine 35 μL di agente riducente in un tubo centrifuga. Sospezione riportata questa miscela per garantire l'omogeneità.
      NOTA: Segui esattamente questo ordine quando aggiungi i reagenti. Da usare entro 15 minuti dalla preparazione.
2. Aggiungi 100 μL del cocktail di reazione in ogni pozzo. Incubare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente in un ambiente buio per prevenire il fotosbiancamento.
3. Centrifuga le celle a 900 × g per 5 minuti. Bilancia la centrifuga aggiungendo piastre vuote per distribuire il peso in modo uniforme. Rimuovi la miscela tramite aspirazione.
4. Lavare le celle con 100 μL di tampone di lavaggio e rimuovere il tampone tramite aspirazione. Ripeti questo passaggio due volte.

7. Colorazione del DNA

1. Prepara una diluizione 1x della colorazione totale del DNA e aggiungi 100 μL a ciascun pozzo. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 20 minuti in un ambiente buio per prevenire il fotosbiancamento.
2. Centrifuga la piastra a 900 × g per 5 minuti. Bilancia la centrifuga aggiungendo piastre vuote per distribuire il peso in modo uniforme. Rimuovi la miscela tramite aspirazione.
3. Lavare le celle con 100 μL di tampone di lavaggio e rimuovere il tampone tramite aspirazione. Ripeti questo passaggio due volte.
4. Risospendere le cellule con 100 μL di buffer PBS raffreddato per prepararle all'imaging.

8. Imaging

1. Inserisci la piastra nel lettore di piatti.
2. Imposta l'ingrandimento a 20x.
3. Analizza la colorazione del nucleo con il canale GFP 469/525 nm. Usa autobinning e autofocus per migliorare i risultati di immagini.
4. Analizza la sintesi attiva di proteine con il canale Texas Red 586/647nm. Usa autobinning e autofocus per migliorare i risultati di immagini.

Results

Questo saggio ha utilizzato la fluorescenza per visualizzare e quantificare la capacità di diversi prodotti naturali di inibire la sintesi proteica. La cicloessimide (CHX) è un noto inibitore della sintesi proteica il cui modo d'azione consiste nell'interferire con il processo di traslocazione durante l'allungamento¹¹. Per questo studio, le cellule viventi sono state rilevate con un colorante nucleare verde fluorescente. OPP è un derivato della puromicina che si l...

Discussion

Questo protocollo fornisce una metodologia di screening fluorometrico per testare prodotti naturali e piccole molecole al fine di valutarne la capacità di inibire la sintesi proteica. La semplicità di questo protocollo consente ai ricercatori universitari di implementarlo correttamente, consentendo loro di apportare contributi sostanziali alla conoscenza scientifica. Il protocollo richiede una comprensione di base dei metodi e delle tecniche biologiche, con passaggi che richiedono un'ese...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lettore multimodalità per imaging cellulare Agilent Biotek Cytation 1	Agilent	BTCYT1V
Composto 1 (Deidroabietilamina, CAS 1446-61-3)	Enamine	EN300-7409771
Compound 2 (Bakuchiol, CAS 10309-37-2)	ChemFaces	CFN99047
Heraeus Megafuge 16R	Thermo Scientific & nbsp;	75004271
Piastra Ibidi Gmbh-slide a 96 pozzi	Ibidi	80826
Linee cellulari MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
Soluzione salina tamponata con fosfato pH 7,4	ATCC	ATCC 30-2200
Kit per il saggio di sintesi proteica (verde)	Abcam	Ab239725