Sonda di ibridazione divisa che utilizza un aptamero fluorescente a DNA come reporter di segnale per l'analisi degli acidi nucleici specifici della sequenza

Summary

Questo protocollo delinea la progettazione di sonde di ibridazione split che utilizzano l'aptamero fluorescente DAP-10-42 come reporter di segnale e la loro applicazione per il rilevamento dell'acido nucleico e la differenziazione tra bersagli con sostituzioni a singolo nucleotide.

Abstract

Gli aptameri fluorescenti light-up (FLAP) basati sul DNA sono promettenti per i saggi bioanalitici perché forniscono una lettura del segnale fluorescente a basso costo senza la necessità di marcare i reporter del segnale dell'acido nucleico con fluorofori e/o quencher, a differenza delle sonde di ibridazione convenzionali utilizzate per la rilevazione istantanea dell'acido nucleico. Invece, i FLAP legano in modo non covalente i leganti coloranti, che mostrano una fluorescenza intrinsecamente bassa in soluzioni acquose, ma diventano altamente emettitori quando si legano i FLAP. Questo protocollo descrive un algoritmo per progettare sensori di aptamero a luce divisa (SLAS) utilizzando DAP-10-42, il DNA FLAP più efficiente riportato finora. Se dotato di sequenze di acidi nucleici complementari a un bersaglio di acido nucleico di interesse, SLAS è uno strumento promettente per l'analisi degli acidi nucleici che consente la rilevazione sequenziale di bersagli di acidi nucleici con selettività fino a un nucleotide per consentire l'analisi delle sostituzioni a singolo nucleotide (SNS). Gli SLAS offrono il vantaggio di una lettura del segnale basata sulla fluorescenza senza marcatura, che può essere misurata con uno spettrofotometro fluorescente convenzionale basato su cuvetta, un fluorimetro portatile o osservata visivamente dopo l'eccitazione con una sorgente luminosa portatile. L'approccio SLAS è vantaggioso per le applicazioni di biorilevamento nella diagnostica delle malattie, nel monitoraggio ambientale e nella ricerca biomolecolare.

Introduction

L'analisi degli acidi nucleici mediante sonde di ibridazione viene eseguita di routine per rilevare e quantificare specifiche sequenze di DNA/RNA¹. Una delle sonde di ibridazione di maggior successo è la sonda Molecular Beacon (MB), che è un DNA a forma di forcina
oligonucleotide marcato con un fluoroforo e un quencher ai terminali opposti ^2,3. Rileva istantaneamente (senza la necessità di lavare il complesso sonda-bersaglio dall'eccesso della sonda) la presenza di una sequenza di acido nucleico complementare al frammento dell'ansa della sonda ed è comunemente usato nella PCR quantitativa (qPCR). La necessità di legare in modo covalente due coloranti - il fluoroforo e il quencher - alla sequenza oligonucleotidica della sonda aumenta il costo, in particolare quando è necessaria una nuova sonda MB mirata a una nuova sequenza di acido nucleico. In alternativa, la sonda MB può essere utilizzata come reporter di segnale in un formato di sonda di ibridazione multicomponente (split), in cui due oligonucleotidi non marcati interagiscono sia con il target che con il reporter della sonda MB⁴. L'approccio della sonda multicomponente migliora la selettività per il riconoscimento degli acidi nucleici e migliora il legame della sonda con bersagli strutturati ^5,6,7, Questo approccio, tuttavia, non elimina la necessità di marcatura covalente del reporter con un fluoroforo⁸.

Gli aptameri fluorescenti luminosi (FLAP)⁹ sono aptameri che hanno un'affinità con i coloranti sensibili all'ambiente a bassa fluorescenza (fluorogeni), in cui il legame con FLAP migliora la fluorescenza del collettore del fluorogeno. A differenza delle sonde marcate in fluorescenza e dei reporter di segnale, i FLAP non richiedono che gli elementi di rilevamento siano marcati in modo covalente con uno o più coloranti e offrono quindi il vantaggio del rilevamento della fluorescenza senza marcatura¹⁰. Ciò è particolarmente importante durante la fase di ottimizzazione, quando è necessario testare dozzine di costrutti di acidi nucleici per ottenere prestazioni di analisi soddisfacenti. Inoltre, i saggi FLAP possono essere ottimizzati regolando la concentrazione di un sensore di fluorogeno e/o FLAP piuttosto che modificare il design del sensore. Questi vantaggi possono essere significativi per i laboratori di ricerca e didattica a basso budget. I DNA FLAP sono particolarmente promettenti come segnalatori di segnali di sonde di ibridazione multicomponente denominate Split Light-up Aptamer Sensors (SLAS)¹¹. Il DNA FLAP più efficiente riportato finora è DAP-10-42, che è stato originariamente selezionato per migliorare la fluorescenza dei coloranti dapoxyl sulfonyl¹², con una capacità promiscua di legare e migliorare la fluorescenza di una varietà di coloranti arilmetano (ad esempio, auramina O, AO; cristallovioletto, CV)¹³. DAP-10-42 è stato convertito in SLAS per essere utilizzato per l'analisi degli acidi nucleici 13,14,15.

L'obiettivo del metodo qui descritto è quello di consentire l'analisi sequenziale specifica di bersagli di acidi nucleici di interesse utilizzando filamenti SLAS label-free e un colorante fluorogenico come componente tampone. Questo protocollo descrive un algoritmo per progettare SLAS basato su DAP-10-42 e mette in evidenza le prestazioni di SLAS per il rilevamento altamente selettivo di sequenze di acidi nucleici che differiscono in un solo nucleotide.

Il test di rilevamento dell'acido nucleico SLAS richiede due oligonucleotidi di DNA non modificati sintetizzati su misura utilizzati a una concentrazione finale di 0,5-1 μM per ottenere le massime prestazioni. Il protocollo qui descritto utilizza un colorante Auramina O (AO) disponibile in commercio come fluorogeno. La concentrazione finale di AO nel saggio varia da 1 a 10 μM per garantire un elevato aumento della fluorescenza in presenza di uno specifico bersaglio di acido nucleico rispetto al bianco (assenza del bersaglio; Figura supplementare 1). I componenti necessari del tampone del saggio sono gli ioni potassio e magnesio (Figura 2 supplementare). Gli ioni potassio (1,25-40 mM) stabilizzano il dominio G-quadruplex proposto del FLAP utilizzato come reporter di segnale. Gli ioni magnesio (2,5-50 mM) riducono la repulsione dei gruppi fosfato caricati negativamente in seguito alle interazioni SLAS-bersaglio. La temperatura del test SLAS utilizzando le sequenze riportate per il dominio di segnalazione del segnale non deve superare i 28 °C per evitare la perdita di prestazioni¹⁶.

SLAS è compatibile con bersagli di acidi nucleici a singolo filamento, come gli ampliconi di DNA della PCR asimmetrica o una reazione di amplificazione isotermica del DNA (ad esempio, l'amplificazione della polimerasi ricombinasi, RPA¹⁷), i prodotti dell'RNA dall'amplificazione mediata dalla trascrizione (TMA) o dall'amplificazione basata sulla sequenza di acidi nucleici (NASBA)¹⁸ e le molecole di RNA native come miRNA, rRNA o ncRNA). Le variazioni nella sequenza nucleotidica del bersaglio fino a un singolo nucleotide possono essere rilevate utilizzando l'approccio SLAS^13,14.

Protocol

1. Progettazione del sensore aptamero di illuminazione divisa (SLAS) con DAP-10-42 come reporter di segnale

1. Progettare le sequenze di due filamenti di oligonucleotidi di DNA non modificati che costituiscono SLAS. Utilizzare un frammento contenente nucleotidi (nts) 4,6-39 di DAP-10-42 (Tabella 1, Figura 1A).
2. Convertire la sequenza dello stelo 1 (nts 1-8 e 36-42) in stem 1' rimuovendo un residuo di timina rigonfio nella posizione nt 5, accorciando lo stelo a 4 bp (nts 4,6-8 e 36-39) e aggiungendo un C-G bp terminale (Figura 1A, passaggio 1). Inoltre, uno dei filamenti SLAS contiene nts 9-29 della sequenza centrale DAP-10-42, mentre un altro filamento SLAS contiene nts 30-35 della sequenza.
3. Estendere la sequenza 3'-terminale del frammento contenente nts 9-29 con d(GGTCAT) e la sequenza 5'-terminale del frammento nts 30-35 con d(ATGACC) per formare uno stelo 2 da 6-bp (Figura 1A, passaggio 2).
   NOTA: Le coppie di basi T4-A39, A6-T38, C7-G37 e G8-C36 dello stelo 1 in DAP-10-42 sono necessarie per la funzione di illuminazione dell'aptamero. La sequenza del gambo 1' può essere modificata solo al terminale bp e può essere una coppia di basi G-C, A-T, T-A o estesa con 1-2 coppie di basi secondo necessità. La sequenza del gambo 2 è arbitraria e può essere modificata. Tuttavia, si raccomanda di preservare la stabilità termodinamica dello stelo 2 a meno che la temperatura del saggio non venga aumentata oltre i 28 °C. L'accorciamento o la destabilizzazione dello stelo 2 impedisce il legame prematuro del colorante senza un bersaglio se si osserva un elevato fondo del test fluorescente basato su SLAS. È consentita anche la suddivisione della sequenza nucleotidica DAP-10-42 tra nts 28-29, 27-28 o 26-27 invece di nts 29-30 (Figura 1B).
4. Per adattare lo SLAS progettato a un bersaglio o interesse dell'acido nucleico, estendere lo stelo 1' con sequenze di DNA complementari ai frammenti di legame bersaglio-bersaglio (bracci) attraverso i linker d(TT) (Figura 1A, passaggio 3). Questo produce le sequenze dei filamenti SLAS-U e SLAS-S che costituiscono la sonda.
5. Rendere il braccio di legame del bersaglio di SLAS-S complementare a un frammento di 7-10 nt del bersaglio contenente il sito SNS e il braccio di legame al bersaglio di SLAS-U - complementare a un frammento di 15-25 nt del bersaglio adiacente al braccio di legame del bersaglio di SLAS-S (Tabella 1).
   NOTA: È facoltativo se collegare il braccio di rilegatura del bersaglio di SLAS-S a nt 4 o nt 39 della sequenza DAP-10-42 (Figura 1, braccio 1 o braccio 2, rispettivamente).
6. Valutare la temperatura di fusione (T_m) dei duplex tra il bersaglio di interesse e i bracci di legatura del bersaglio di SLAS-S e SLAS-U utilizzando il Web Server UNAFold (unafold.org)¹⁹.
   1. Fare clic sulla scheda DINAMelt nella parte superiore della pagina web; andare su Applicazioni e selezionare Ibridazione di fusione a due stati (Figura supplementare 3A). Nella pagina Ibridazione di fusione a due stati, inserire una delle sequenze interagenti nella casella di sinistra e un'altra nella casella di destra (Figura 3B supplementare). Assicurati che entrambe le sequenze siano in ordine da 5' a 3'. È possibile immettere più di una coppia di sequenze interagenti separandole con un punto e virgola.
   2. Nella parte inferiore della pagina, indicare la temperatura del test (22 °C), le concentrazioni di cationi monovalenti e bivalenti (20 mM e 25 mM, rispettivamente) in modo che corrispondano alle condizioni del test. Indicare la concentrazione delle sequenze interagenti.
   3. Premere Invia (Figura supplementare 3B). Osservare i risultati che includono la variazione di energia di Gibbs, la variazione di entalpia e la variazione di entropia del legame, nonché i valori di T_m per i duplex corrispondenti (Figura supplementare 3B).
   4. Assicurarsi che i valori T_m per i duplex tra il target completamente abbinato (M) e i bracci di fissaggio del target di SLAS-S e SLAS-U siano superiori alla temperatura del saggio, che è di 22 °C nel protocollo corrente. Qui, i valori di T_m erano rispettivamente di 32,2 °C e 74,4 °C (Figura supplementare 3C).
   5. Assicurarsi che il duplex tra SLAS-S e un target non corrispondente (MM) contenente un SNS abbia un T_m inferiore alla temperatura del saggio. Ciò garantisce un'elevata selettività del riconoscimento sonda-bersaglio, impedendo al fluorogeno AO di segnalare la presenza dell'analita di acido nucleico mirato se contiene un SNS nel frammento legante SAS (Figura 2). Qui, il T_m era di 21,3 °C (Figura supplementare 3C), che era sufficiente per discriminare la discrepanza dal complesso abbinato.
   6. Regolare le sequenze dei bracci di legatura del bersaglio accorciando o estendendo i frammenti complementari al bersaglio, se necessario, per soddisfare i requisiti di stabilità indicati.
7. Ottenere i filamenti progettati SLAS-S e SLAS-U da qualsiasi fornitore commerciale che fornisca oligonucleotidi di DNA su misura o sintetizzare i filamenti di DNA internamente utilizzando un sintetizzatore di oligonucleotidi automatizzato.

Figura 1: Conversione di un aptamero fluorescente (FLAP) DAP-10-42 in un sensore di aptamero a luce divisa (SLAS). (A)La struttura secondaria di DAP-10-42¹² è prevista da un'applicazione di ripiegamento del DNA del Web Server¹⁹ UNAFold a 22 °C, 20 mM Na⁺, 25 mM Mg²⁺. L'aptamero presenta una struttura secondaria a forcina con un'anima che presumibilmente si ripiega in un motivo G-quadruplex stabilizzato dal gambo 1. Affinché DAP-10-42 possa essere convertito in un SLAS, (1) lo stelo 1 dell'aptamero viene accorciato a 4 bp e affiancato da un ulteriore G-C bp per ottenere lo stelo 1'; (2) la sequenza centrale è divisa tra NTS 29 e 30, con i lati 3' e 5' del sito diviso estesi con sequenze complementari d(GGTCAT) e d(ATGACC), rispettivamente, per formare il gambo 2; (3) lo stelo 1' è esteso con le sequenze complementari ai frammenti adiacenti di un bersaglio di interesse - bracci leganti il bersaglio, con un d(TT)-linker tra i bracci leganti il bersaglio e il dominio di segnalazione del segnale della sonda. (B) Il nucleo può anche essere diviso tra nts 28-29, 27-28 o 26-27 senza perdita significativa del segnale e/o aumento della piega della fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Meccanismo di generazione del segnale SLAS. SLAS è composto da due filamenti - SLAS-U e SLAS-S - e da un colorante fluorogenico (ad esempio, Auramina O; AO). In assenza di un bersaglio di acido nucleico di interesse, entrambi i filamenti sono nello stato dissociato e incapaci di legare il colorante; Non viene osservato alcun segnale (centro). In presenza di un bersaglio M completamente abbinato, sia SLAS-U che SLAS-S ibridano il frammento adiacente di M per portare i frammenti del nucleo in prossimità. Ciò consente la formazione del sito di legame del colorante. Il legame dell'AO ne migliora la fluorescenza, che viene misurata come lettura del segnale fluorescente (a sinistra). In presenza di un MM bersaglio non corrispondente contenente una sostituzione a singolo nucleotide (SNS) in un frammento che interagisce con SLAS-S, solo SLAS-U può ibridarsi con il bersaglio MM , mentre SLAS-S è nello stato dissociato. Ciò impedisce la formazione del sito di legame del colorante e non si osserva alcun segnale (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Amplificazione della sequenza bersaglio

1. Amplificare un frammento del gene da analizzare con il test SLAS. Per l'amplificazione PCR o RPA, utilizzare condizioni asimmetriche (ad esempio, con il Forward Primer aggiunto a un eccesso di 10 volte rispetto al Reverse Primer) per generare un amplicone a filamento singolo. Per amplificare un frammento di 126 nt dal gene NANOGP8 utilizzando la PCR²⁰ lineare dopo l'esponenziale (LATE), utilizzare le sequenze di primer elencate nella Tabella 2. In questo caso, è stato utilizzato un modello di DNA a filamento singolo (Template NANOGP8 o Template G1423C, Tabella 2) corrispondente al frammento di 126 nt del gene. Il modello è stato sintetizzato su misura da Integrated DNA Technologies, Inc.
   1. Preparare una reazione PCR da 100 μL mescolando 10 μL di 10x Standard Taq Reaction Buffer, 2 μL di 10 mM di miscela dNTP (per ottenere la concentrazione finale di 0,2 mM), 10 μL di 10 μM Forward Primer e 10 μL di 1 μM Reverse Primer (per la concentrazione finale di 1 μM e 0,1 μM, rispettivamente), 0,5 μL di 5U/μL Taq DNA polimerasi, DNA stampo e acqua priva di nucleasi. Per un controllo senza modello, aggiungere acqua al posto del modello.
   2. Utilizzare le seguenti condizioni di termociclo: denaturazione iniziale a 95 °C per 1 min; 45 cicli di (1) denaturazione a 95 °C per 15 s, (2) ricottura con primer a 60 °C per 30 s, (3) prolungamento con primer a 68 °C per 30 s; e prolungamento finale a 68 °C per 5 min.
      NOTA: Le tecniche di amplificazione basate sulla trascrizione come NASBA¹⁸ possono essere utilizzate al posto della PCR o dell'RPA, soprattutto se è disponibile un modello di RNA per l'amplificazione. NASBA genera un amplicone di RNA a singolo filamento a una concentrazione del prodotto finale nell'intervallo dei micromolari, che è sufficientemente alta da poter essere utilizzata nel saggio SLAS a valle senza concentrazione di prodotto.
2. Precipitare i campioni amplificati con etanolo aggiungendo 0,1x il volume di acetato di sodio 3 M (pH 5,5) e 3x il volume di etanolo. Incubare a -20 °C per 1 ora, centrifugare a 12.000-18.000 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
3. Lavare il pellet con etanolo al 70%, centrifugare nuovamente e scartare nuovamente il surnatante. Asciugare il pellet all'aria e scioglierlo in 10 μL di acqua priva di nucleasi da utilizzare nel test SLAS.

3. Saggio di fluorescenza mediante SLAS

1. Preparare soluzioni madre di AO (0,1 mM in DMSO, 10x), SLAS-S (10 μM in acqua priva di nucleasi, 10x), SLAS-U (10 μM in acqua priva di nucleasi, 10x) e 4 tamponi per saggio (80 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM MgCl₂, 80 mM KCl).
   NOTA: Gli ioni potassio sono necessari per stabilizzare il presunto motivo G-quadruplex dell'aptamero, che fa parte del sito di legame del colorante. Un minimo di 1 mM di KCl (a 25 mM di MgCl₂) in un tampone di saggio 1x è sufficiente per garantire un aumento della fluorescenza di ~14 volte in presenza del target specifico M sul bianco (campione senza target; Figura supplementare 2B). Gli ioni magnesio stabilizzano le interazioni dei filamenti di acido nucleico (tra SLAS-S, SLAS-U e il bersaglio). La concentrazione di Mg²⁺ nel tampone del saggio 1x deve essere di almeno 5 mM (a 20 mM KCl; Figura supplementare 2C, D). La soluzione madre di AO (~1 mM) viene preparata in DMSO. Le concentrazioni di SLAS-S e SLAS-U sono arbitrarie e possono essere regolate se necessario, purché vengano mantenute le concentrazioni finali dei filamenti (vedere la logica per la selezione della concentrazione finale di SLAS nella Discussione).
   ATTENZIONE: L'AO è dannosa se ingerita, tossica a contatto con la pelle e sospettata di causare il cancro. Indossare sempre i guanti quando si lavora con le soluzioni AO. La pesatura dell'AO e la preparazione delle sue soluzioni madre devono essere effettuate sotto il cofano chimico.
2. Preparare la miscela master contenente tutti i componenti del saggio tranne il target. Calcolare il volume della miscela master (V_mix) moltiplicando il volume del campione (60 μL) per il numero di campioni più uno (n+1):
   
   Il numero di campioni n deve includere i controlli negativi e positivi necessari.
3. Combinare 0,25_μl di miscela da 4 μL di saggio, μl di _miscela da 0,1 V di AO da 0,1 mM, _{μl di miscela} da 0,1 V di SLAS-S da 10 μM e μL di _miscela da 0,1 V di SLAS-S da 10 μM. Aggiungere acqua priva di nucleasi al volume finale di in modo che contenga il volume target aggiunto al passaggio 3.4. Agitare e centrifugare brevemente la miscela master. Aliquotare 50 μl della miscela master in n provette.
   NOTA: Il volume del campione può essere regolato in base alle caratteristiche dello strumento utilizzato per rilevare il segnale fluorescente. Il volume della miscela master aliquotata nelle provette del campione può essere regolato in base al volume target aggiunto al passaggio 3.4. Il volume di acqua priva di nucleasi aggiunta per ottenere la miscela master deve essere regolato di conseguenza. Ad esempio, se il campione contenente il target viene aggiunto al 10% (V/V) del volume del campione finale, l'acqua deve essere aggiunta alla miscela master fino a 0,9 volte la_miscela V.
4. Utilizzare un campione come controllo senza target (vuoto) e un campione come controllo positivo. Aggiungere 10 μl del campione contenente il target alla miscela master (50 μl) per ottenere il volume finale del campione di 60 μl contenente un target da 10 a 1000 nM. Per il bianco, utilizzare acqua priva di nucleasi (10 μL) al posto del bersaglio. Per un controllo positivo, utilizzare un oligonucleotide di DNA sintetico contenente la sequenza mirata (ad esempio, bersaglio M, Tabella 1). Aggiungere 10 μl di controllo 0,6-3 μM per ottenere una concentrazione finale di 0,1-0,5 μM.
   NOTA: L'elevata fluorescenza in questo controllo positivo garantisce che il test funzioni come previsto, anche se si osserva un segnale negativo per i campioni sconosciuti testati.
5. Mescolare i campioni e centrifugarli con una microcentrifuga. Incubare i campioni a 22 °C per 10-60 minuti. Il segnale aumenta solo del <15% tra 40 min e 60 min (Figura 3).
6. Misurare la fluorescenza dei campioni a 540 nm dopo eccitazione a 475 nm utilizzando uno spettrofotometro fluorescente.
   NOTA: È possibile utilizzare un fluorimetro portatile che misura la fluorescenza in provette PCR a parete sottile. Il fluorimetro deve essere dotato di filtri di eccitazione ed emissione adatti a rilevare la fluorescenza AO. Un esempio di filtro di eccitazione adatto è un passaggio corto da 495 nm. Un esempio di filtro di emissione adatto è 510-580 nm. In alternativa, il segnale può essere osservato visivamente dopo l'eccitazione della fluorescenza AO nel campione con una sorgente di luce UV o blu.
   ATTENZIONE: Se si utilizza una lampada UV, indossare occhiali protettivi dai raggi UV.

Figura 3: Dipendenza dal tempo della generazione del segnale per SLAS-29U/30S. Un campione contenente AO, SLAS-29U e SLAS-30S è stato analizzato utilizzando la modalità cinetica di uno spettrofotometro fluorescente (eccitazione a 475 nm, emissione a 540 nm, fessure di eccitazione/emissione a 5 nm) per 60 minuti. A un tempo di 5 minuti (indicato con una freccia), il bersaglio M è stato aggiunto al campione. I dati sono la media di due studi indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Results

Le prestazioni di SLAS che utilizzano il core DAP-10-42 come reporter di segnale sono state dimostrate utilizzando una sonda progettata per interrogare un frammento del gene NANOGP8 importante per la progressione del glioblastoma multiforme (GBM), una forma aggressiva di cancro al cervello²¹. Questo frammento è stato riportato per contenere SNS nel carico di DNA di esosomi derivati da cellule tumorali²². Pertanto, lo SLAS è stato adattato al sito SNS del gene. Per ...

Discussion

Nel protocollo riportato, i passaggi critici includono (i) la progettazione SLAS; ii) temperatura di prova; (iii) presenza di cationi metallici mono- e bivalenti (K⁺ e Mg²⁺); iv) concentrazioni di filamenti SLAS.

Progettazione SLAS
Nella progettazione dei filamenti SLAS, è importante considerare la stabilità termodinamica dei complessi formati dai filamenti SLAS-S e SLAS-U in assenza di bersagli e in presenza di un ber...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aauramina O	MP Biomedicals	195064	un colorante fluorogenico utilizzato per la segnalazione dei segnali
Fluorimetro Cary Eclipse	Tecnologie Agilent	G9800A	per misurare il segnale fluorescente dei campioni
Dimethy Sulfoxide	MP Biomedicals	196055	solvente per preparare soluzioni madre di Auramina O
Oligonucleotidi di DNA (primer, filamenti SLAS, stampo sintetico per PCR)	IDT	N/A	Realizzato su misura e dissalato dal venditore, utilizzato senza ulteriore purificazione
Miscela dNTP, 10 mM	ThermoFisher Scientifico	R0191	per reazione di PCR tardiva
Cloruro di magnesio	Invitrogen	AM9530G	componente tampone; necessario per la corretta associazione dei filamenti della sonda con il target analizzato
Provette per microcentrifuga (1,5 mL)	Fisherbrand	02-681-320	plastica per la preparazione dei campioni
Micropipetta (0,1-2,5 &; micro; L)	Eppendorph	K56877G	Utilizzato per la preparazione dei campioni
Micropipetta (100-1000 µ L)	Eppendorph	K13160F	Utilizzato per la preparazione dei campioni
Micropipetta (20-200 & micro; L)	Eppendorph	J05253M	Utilizzato per la preparazione dei campioni
Micropipetta (2-20 & micro; L)	Eppendorph	G24675G	Utilizzato per la preparazione dei campioni
Mini centrifuga	Corning	6770	utilizzato per la filatura dei campioni
Acqua priva di nucleasi (non trattata con DEPC)	ThermoFisher Scientifico	AM9932	Utilizzo per campioni in saggi PCR e SLAS
Provette per PCR (0,5 mL)	Invitrogen	AM9932	per misurare la fluorescenza utilizzando il fluorimetro Quantus
Punte di pipetta (20-200 µ L)	VWR	76322-150	plastica per la preparazione dei campioni
Puntali per pipette (1-10 uL)	VWR	76322-528	plastica per la preparazione dei campioni
Cloruro di potassio	Invitrogen	AM9640G	componente tampone; necessario per il corretto ripiegamento del dominio dell'aptamero fluorescente della sonda
Fluorimetro Quantus	Promega	E6150	Fluorimetro portatile a basso costo che può essere utilizzato per misure di fluorescenza
Cuvetta al quarzo	Distretto di Starna	16.50F-Q-10/Z15	da utilizzare per la misurazione della fluorescenza con il fluorimetro Cary Eclipse
Taq DNA polimerasi con tampone Taq standard	Biolaboratori del New England	Codice: M0273S	per l'amplificazione di un frammento genico da analizzare con il saggio SLAS
Tampone Tris-HCl (pH 7,4)	Boston Bioproducts	R-314	Componente buffer
Lampada UV	UVP	95-0016-14	per eccitare l'AO per l'osservazione del segnale visivo
Miscelatore a vortice	VWR	10153-838	utilizzato per miscelare i campioni