Articolo metodologico

Un framework di imaging multimodale per far progredire la fenotipizzazione di cellule viventi di cancro al seno senza etichetta

DOI:

10.3791/68498

⸱

22 agosto 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Laser Biomedical Research Center, G. R. Harrison Spectroscopy Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Politecnico di Milano, 4Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT and Harvard, 5Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 6Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo presenta un approccio multimodale che combina la spettroscopia Raman e la microscopia di fase tomografica per la fenotipizzazione senza marcatura e non invasiva di cellule viventi di carcinoma mammario umano. Include una pipeline di analisi facile da usare e priva di pregiudizi umani per un'analisi morfo-chimica rapida e quantitativa, fornendo informazioni molecolari e strutturali dettagliate con applicazioni nella ricerca sul cancro e nella biologia cellulare.

Abstract

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Presentiamo la microspettroscopia Raman confocale multimodale (RS) e la microscopia di fase tomografica (TPM) per una rapida fenotipizzazione morfochimica delle cellule di carcinoma mammario umano (MDA-MB-231). Sfruttando la natura non perturbativa di queste tecniche avanzate di microscopia, abbiamo acquisito dati morfo-molecolari dettagliati da cellule viventi prive di marcatura nel loro ambiente fisiologico nativo. Sono state sviluppate pipeline di elaborazione dati umane prive di distorsioni per analizzare immagini Raman iperspettrali (che coprono modalità Raman da 600 cm-1 a 1800 cm-1, che caratterizzano in modo univoco un'ampia gamma di legami molecolari e strutture subcellulari), nonché dati morfologici da tomogrammi tridimensionali dell'indice di rifrazione (che forniscono misurazioni del volume cellulare, dell'area superficiale, dell'impronta e della sfericità con risoluzione nanometrica, insieme alla massa secca e alla densità). Analizzando sistematicamente i ricchi dettagli delle singole cellule fornite da RS e TPM, dimostriamo, in modo quantitativo, il vantaggio di un tale metodo di microscopia multimodale per la fenotipizzazione delle cellule tumorali del cancro al seno. I nostri strumenti forniscono anche ulteriori informazioni sulle informazioni subcellulari senza l'uso di alcuna etichetta. Infine, studiamo e discutiamo tutte le informazioni univoche o correlate presenti nei set di dati derivati da RS e TPM. Riteniamo che i nostri strumenti e le pipeline di analisi quantitativa dei dati possano rivoluzionare le attività di fenotipizzazione nella ricerca biomedica quando è necessario un metodo rapido e non perturbativo su cellule viventi in coltura, con il potenziale per la futura traduzione in applicazioni cliniche e diagnostiche.

Introduzione

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La caratterizzazione e la fenotipizzazione cellulare sono aspetti fondamentali della ricerca biomedica1. Essere in grado di caratterizzare le cellule sia a livello morfologico che molecolare è fondamentale per comprendere la funzione, il differenziamento e la patologia cellulare 1,2,3. È particolarmente interessante nel campo dell'oncologia, dove è necessaria un'accurata profilazione cellulare per la diagnosi del tumore, la determinazione dello stadio della malattia e, infine, l'identificazione dei bersagli terapeutici2. I metodi tradizionali di caratterizzazione cellulare non sono in grado di fornire dinamiche temporali e di solito si basano su tecniche invasive, come la colorazione o l'etichettatura, che possono interferire con lo stato nativo delle cellule e introdurre potenziali distorsioni all'interno dei dati4. Pertanto, sono sempre più richieste strategie non invasive per fornire una fenotipizzazione accurata e completa delle cellule viventi, nel loro stato nativo e imperturbato.

In questo contesto, i metodi di imaging multimodale label-free hanno rivoluzionato la ricerca sulla biologia cellulare combinando modalità complementari per catturare informazioni sia morfologiche che molecolari 2,5. Questi approcci consentono la caratterizzazione integrata e non invasiva delle cellule che le singole tecniche tradizionali potrebbero non essere sempre in grado di fornire 2,5,6. Ad esempio, sebbene le tecniche di microscopia come la microscopia a fluorescenza siano state ampiamente utilizzate nell'imaging cellulare morfologico e funzionale, possiedono limiti intrinseci. I metodi di fluorescenza spesso soffrono di fotosbiancamento, fototossicità e basse quantità di molecole bersagliabili, che limitano il potenziale analitico4. Inoltre, questi approcci richiedono spesso l'uso di etichette o coloranti esogeni, che possono interrompere lo stato cellulare nativo o portare ad artefatti7.

Le piattaforme di imaging multimodale, che combinano i punti di forza di più modalità di imaging, superano queste limitazioni consentendo l'acquisizione di diversi tipi di dati da cellule viventi senza la necessità di etichettatura. L'integrazione della spettroscopia Raman (RS) con altre modalità di imaging come la microscopia a contrasto di fase o la microscopia tomografica di fase (TPM) è stata una strategia promettente per superare i limiti delle singole tecniche. Infatti, l'imaging multimodale fornisce una comprensione più profonda dei fenotipi cellulari, specialmente in condizioni biologiche complesse e patologie come il cancro, dove le proprietà molecolari e strutturali sono cruciali per una caratterizzazione accurata 2,5.

L'RS label-free è adatto per l'imaging chimico delle cellule8. Rilevando le modalità vibrazionali molecolari, RS fornisce impronte biochimiche che possono rivelare informazioni approfondite sulla composizione molecolare delle cellule 9,10,11. Gli spettri Raman acquisiti da campioni biologici contengono informazioni su una varietà di biomolecole come lipidi, proteine, acidi nucleici e metaboliti, che svolgono un ruolo essenziale nella comprensione della natura molecolare delle cellule 9,12. Uno dei principali punti di forza della RS è che non è invasiva, consentendo la caratterizzazione delle cellule viventi nel loro stato naturale senza alterarne le condizioni fisiologiche.

Nonostante i suoi numerosi vantaggi, RS presenta anche alcune limitazioni. Infatti, sebbene la RS fornisca informazioni molecolari dettagliate, non consente informazioni quantitative sulla morfologia o sulla struttura delle cellule2. È qui che le tecniche di imaging complementari come la TPM svolgono un ruolo cruciale.

La TPM è una forma di imaging di fase quantitativa (QPI)13,14 e consente la visualizzazione di informazioni quantitative ad alta risoluzione e prive di marcatura sulla morfologia cellulare15,16. La TPM differisce dalle tecniche di microscopia tradizionali in quanto non richiede agenti di contrasto; invece, funziona misurando gli spostamenti di fase risultanti dalle variazioni dell'indice di rifrazione (RI) del campione17. Gli spostamenti di fase forniscono informazioni sulle proprietà strutturali della cella, tra cui il volume, l'area superficiale, la forma e la struttura interna 2,18. La TPM può raggiungere un'alta risoluzione spaziale, a livello nanometrico, e quindi è una tecnica ideale per registrare dettagli morfologici ad alta risoluzione di cellule viventi. Inoltre, la capacità di ricostruire tomogrammi RI 3D consente di visualizzare le strutture subcellulari nel loro ambiente vivo18, fornendo informazioni più accurate rispetto alle proiezioni 2D. Tuttavia, uno dei principali limiti del TPM è la sua mancanza di specificità chimica, in quanto fornisce principalmente informazioni sulla morfologia e sulla distribuzione di fase della cellula, senza essere in grado di distinguere tra componenti chimici distinti o identificare caratteristiche biochimiche.

La combinazione di RS e TPM in una tecnica multimodale offre vantaggi nella fenotipizzazione cellulare. Mentre la RS consente di ottenere ricche informazioni molecolari, la TPM aggiunge un aspetto strutturale, consentendo di analizzare la morfologia cellulare in modo molto dettagliato. Recentemente, la combinazione di RS con TPM è stata dimostrata con successo in diversi studi incentrati sulla ricerca sul cancro 2,19,20. Ad esempio, lavori precedenti hanno riportato che la co-registrazione della spettroscopia Raman con i dati della microscopia di fase olografica può fornire informazioni molecolari e morfologiche complementari, consentendo di distinguere tra diversi tipi di cellule e stadi di sviluppo del tumore2. Queste indagini hanno evidenziato il potere dell'imaging multimodale per migliorare l'accuratezza della fenotipizzazione cellulare, in particolare nel contesto del cancro, dove le caratteristiche molecolari e strutturali delle cellule sono strettamente legate alla loro malignità e al loro comportamento 2,20.

Nonostante i recenti progressi nell'imaging multimodale, vi sono ancora sfide da affrontare, in particolare nell'elaborazione e nell'analisi dei dati21. Le grandi quantità di dati prodotte dalle tecniche di imaging multimodale possono essere ingombranti da analizzare e devono essere impiegate procedure semplici per estrarre informazioni significative. Per contrastare questa sfida, è necessario stabilire pipeline di elaborazione dei dati di facile utilizzo per gestire la complessità dei dati e ridurre al minimo i pregiudizi umani nell'analisi. Tali pipeline sono fondamentali per il raggiungimento dell'accuratezza e della riproducibilità dei risultati e per la possibile traduzione di questi approcci in applicazioni cliniche e diagnostiche.

L'obiettivo del presente lavoro è quello di illustrare il potenziale della fusione di RS con TPM per la fenotipizzazione label-free, ad alta velocità e non perturbativa di singole cellule tumorali vive. Unendo questi due robusti approcci di imaging, forniamo una caratterizzazione completa e quantitativa delle proprietà molecolari e morfologiche delle cellule di carcinoma mammario umano (MDA-MB-231). Il lavoro sottolinea anche l'importanza di stabilire pipeline di elaborazione dei dati prive di pregiudizi umani per garantire che le informazioni estratte dai set di dati multimodali siano corrette e affidabili. Qui, cerchiamo di stabilire una solida piattaforma per la fenotipizzazione delle cellule tumorali che possa essere generalizzata ad altri tipi di cellule. La versatilità e la sensibilità di questo approccio lo rendono un potenziale candidato per un'ampia gamma di applicazioni biomediche, dagli studi di biologia cellulare fondamentale alla diagnostica.

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Protocollo

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1. Preparazione del campione

  1. Semina le cellule MDA-MB-231 su piastre di Petri al quarzo.
    1. Piastra le cellule di cancro al seno umano MDA-MB-231 su piastre di Petri con fondo in vetro di quarzo da 3,5 cm.
    2. Incubare le cellule a 37 °C in un ambiente al 5% di CO2 fino a quando non sono completamente attaccate alla superficie (almeno 12 ore dopo la semina).
  2. Lavare le celle e prepararsi per la misurazione.
    1. Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule una volta che hanno aderito alla capsula di Petri.
    2. Lavare delicatamente le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere il terreno residuo.
    3. Aggiungere un terreno di coltura cellulare fresco e mantenere le cellule coperte con il terreno durante l'intera procedura di misurazione per garantirne la vitalità.
      NOTA: Come terreno di coltura, questo studio ha utilizzato DMEM/F-12 privo di rosso fenolo integrato con il 5% di siero fetale bovino (FBS) e penicillina (100 UI/mL)-streptomicina (100 μg/mL).

2. Sistema di microscopio Raman ad alta produttività

NOTA: I dettagli tecnici del microscopio Raman costruito in casa impiegato per il lavoro attuale riguardante l'imaging di cellule vive di cellule MDA-MB-231 sono stati descritti in precedenza22. In breve, il sistema di microscopio Raman ad alta produttività utilizzato su misura è dotato di un laser Ti-Zaffiro da 785 nm pompato da un laser a 532 nm (Figura 1A). Il laser di eccitazione Raman da 785 nm è accoppiato a un corpo di microscopio a fluorescenza IX83 invertito, con eccitazione diretta al campione attraverso un obiettivo a immersione in acqua da UPLSAPO60× 1,2 NA utilizzando uno specchio dicroico da 749 nm. Un polarizzatore regola la potenza media del laser sulla porta posteriore del microscopio. L'imaging in campo chiaro è abilitato accoppiando la luce bianca in modo simile. Il sistema passa dalla modalità Raman a quella in campo chiaro cambiando automaticamente i filtri dicroici. Il sistema combina la scansione a specchio galvo e la scansione a tavolino per l'imaging ad alta produttività. Uno script MATLAB personalizzato interagisce con il software di controllo del microscopio open source, una scheda di acquisizione dati (DAQ) e sistemi di rilevamento del segnale per automatizzare il processo di acquisizione dei dati. La luce Raman retrodiffusa viene raccolta dallo stesso obiettivo, mentre la luce visibile viene filtrata da uno specchio dicroico da 785 nm e diretta a uno spettrografo NIR e a un rivelatore di dispositivi ad accoppiamento di carica (CCD). Questa configurazione consente l'imaging multidimensionale, catturando segnali in campo chiaro, fluorescenza e Raman in varie posizioni e z-stack 2,22.

  1. Procedura di imaging Raman
    1. Preparazione del campione e conservazione delle condizioni fisiologiche
      1. Installare il campione nell'incubatore onstage per mantenere le condizioni fisiologiche. Assicurarsi che l'incubatrice sia impostata a 37 °C, con regolazione del feedback in tempo reale per il controllo della temperatura.
      2. Mantenere i livelli di umidità all'interno della camera al >95% utilizzando l'unità periferica interna del bagno riempita con acqua distillata. Impostare il regolatore di gas CO2 in modo che mescoli il 5% di CO2 con il 95% di aria e lo fornisca alla camera dell'incubatore.
    2. Gestione automatizzata dell'immersione in acqua
      1. Accendere l'alimentatore automatizzato a immersione in acqua per fornire acqua alla lente dell'obiettivo a una portata di 2 μl/min utilizzando pompe a siringa e aghi per siringa incollati alla punta dell'obiettivo.
      2. Controllare regolarmente i livelli dell'acqua per evitare l'evaporazione e garantire condizioni di imaging coerenti durante le misurazioni.
    3. Acquisizione dati con spettroscopia Raman
      1. Accendere il laser della pompa e regolarne la potenza per ottenere una potenza laser sul piano del campione di 75 mW.
      2. Aprire il software di controllo del microscopio open source Micro-manager. Nelle impostazioni di configurazione, selezionare BF e fare clic su Live sul lato sinistro della finestra del software per visualizzare l'immagine in campo chiaro. Selezionare la singola cella desiderata da cui verrà acquisito lo spettro Raman. Quindi fare clic su Interrompi per terminare la visualizzazione in campo chiaro.
      3. Impostare la coordinata Z del piano di imaging Raman massimizzando il conteggio del segnale sulla telecamera CCD.
      4. A tale scopo, aprire il software di controllo della telecamera CCD (LightField); nell'impostazione dell'esperimento, impostare il tempo di esposizione su 1,5 s. Quindi, fai clic su Esegui sulla barra degli strumenti Esperimento e attiva il raggio laser.
      5. Quindi, regolare la posizione Z per massimizzare il conteggio del segnale nella regione dell'impronta digitale da 600 cm-1 a 1800 cm-1 per ottimizzare la visualizzazione dei picchi Raman associati alle firme biologiche. Quindi spegnere il laser e fare clic su Stop nella barra dell'esperimento del software della telecamera CCD, quindi uscire dal software.
        NOTA: È stato osservato che i conteggi massimizzati del segnale Raman sulla camera CCD sono in corrispondenza della posizione lungo l'asse Z coincidente con +8 μm rispetto al piano di imaging che non mostra alcuna traccia di picchi Raman correlati alle cellule, a causa di una macchia focale che cade abbastanza all'interno del quarzo. Questo valore può variare in base al tipo e allo stato della cella.
    4. Avvia il processo di acquisizione dei dati utilizzando lo script MATLAB, che gestirà automaticamente i canali Raman nelle misurazioni multidimensionali e salverà i dati Raman iperspettrali.
    5. Impostare il campo visivo su 50 × 50 μm2, 40 × 40 pixel, con ogni area di pixel corrispondente a 1,25 × 1,25 μm2. Impostare il tempo di esposizione per ogni spettro Raman pari a 1,5 s.
      NOTA: Eseguire regolarmente la calibrazione del numero d'onda utilizzando campioni di acetamidofenolo per annotare i picchi Raman noti. Calibrare l'asse di spostamento Raman attraverso l'interpolazione quadratica.
      ATTENZIONE: Maneggiare i laser con cura. Utilizzare sempre occhiali protettivi adeguati per la lunghezza d'onda del laser durante la configurazione e il funzionamento.

3. Analisi dei dati RS

  1. Post-elaborazione di mappe iperspettrali Raman tramite lo strumento basato sul Web RamApp (https://ramapp.io/):
    1. Accedi allo strumento basato sul web.
    2. Importare i dati iperspettrali. Nella scheda Le mie analisi , fare clic su Nuovo e caricare il file .mat, contenente la variabile dei dati spaziali e spettrali e la variabile dell'asse x (ad esempio, i valori di spostamento Raman).
    3. Per troncare lo spettro alle regioni specificate nello spostamento Raman, nel menu a discesa Ritaglia e ruota , fare clic su Ritaglio spettrale e definire il bordo inferiore e il bordo superiore della regione di spostamento Raman uguali rispettivamente a 600 cm-1 e 1800 cm-1.
      NOTA: Eseguendo questo troncamento dello spettro, il picco ampio e ad alta ampiezza relativo al materiale quarzoso della piastra di Petri è escluso dall'analisi.
    4. Per correggere gli spettri Raman per i raggi cosmici, all'interno delle opzioni di Denoising, fare clic su Despike, selezionare Z-score come metodo e impostare la soglia su 8.
      NOTA: La funzione di pre-elaborazione Despike aiuta a risolvere il problema dei pixel che contengono picchi nel loro segnale, che derivano dai raggi cosmici.
    5. Seleziona l'opzione Usa la prima differenza per trovare i valori anomali utilizzando la prima differenza discreta di intensità lungo lo spettro e seleziona l'opzione Correggi picchi. Lo spettro di ogni pixel difettoso sarà sostituito dallo spettro mediano dei pixel adiacenti.
    6. Fare clic su Esegui per correggere i picchi.
    7. Per rimuovere il rumore dalle mappe corrispondenti a ciascun numero d'onda, all'interno delle opzioni di Denoising , fare clic su Smooth Map, selezionare Filtro mediano e impostare la dimensione del lato del quadrato che viene considerata quando si applica il filtro su ogni pixel della mappa pari a 3 pixel. Quindi fare clic su Esegui.
    8. Per applicare un filtro per attenuare lo spettro di ciascun pixel, fare clic su Attenua spettro all'interno delle selezioni Riduzione rumore . Selezionare il filtro Savitzky-Golay come Metodo e impostare la lunghezza della finestra del filtro uguale a 7 e l'ordine polinomiale del filtro uguale a 2. Quindi, fai clic su Esegui.
      NOTA: Un filtro Savitzky-Golay richiede di specificare la lunghezza della finestra del filtro (un numero intero dispari positivo) e l'ordine del polinomio.
    9. Per rimuovere il segnale di fondo medio dal primo piano, aprire il pannello Rimozione supporto di stampa ottico e fare clic su Identifica supporto di stampa. Imposta k-means come metodo e il numero di cluster è uguale a 2.
      NOTA: Questa funzione segmenta le celle (il "primo piano") e il loro substrato utilizzando un approccio di clustering. Sarai quindi in grado di rimuovere il segnale di fondo medio dal primo piano o limitare alcuni passaggi per lavorare solo sui pixel in primo piano. Il numero di cluster da selezionare può variare a seconda del campione specifico.
    10. Nelle opzioni avanzate, selezionare Pulizia morfologica per rimuovere alcune piccole macchie dal primo piano (ad esempio, parti di cellule spurie, ecc.). Quindi fare clic su Esegui.
    11. Nel pannello Rimozione supporto di stampa ottico , per sottrarre il segnale di fondo medio, fare clic su Rimuovi supporto di stampa, quindi selezionare Media globale (media del 95% centrale dei valori) e fare clic su Esegui.
      NOTA: K-means è in genere più veloce, anche se non deterministico (tuttavia, poiché il seme casuale è fisso, lo stesso risultato verrà ottenuto in ogni esecuzione, a parità di condizioni). Il numero di cluster può essere aumentato oltre 2 se alcune parti del primo piano sono ancora riconosciute come sfondo. Il cluster con il segnale medio più basso è definito come sfondo.
    12. Per correggere la fluorescenza della linea di base, aprire il pannello Linea di base e fare clic su Correggi linea di base. Selezionare asPLS (Adaptive Smoothness PLS) e impostare λ uguale a 5000000. Quindi, fai clic su Esegui.
      NOTA: Ci sono 7 metodi disponibili che possono essere selezionati, 5 dei quali si basano sui minimi quadrati penalizzati (PLS). In questi metodi PLS, è necessario un parametro di livellamento (λ). Un valore più alto di λ si tradurrà in linee di base più uniformi.
    13. Per normalizzare ogni mappa iperspettrale Raman dividendola per la relativa norma di Frobenius, fare clic su Varie e selezionare l'opzione Normalizza . Quindi, seleziona Frobenius come Metodo e fai clic su Esegui.
      NOTA: La norma di Frobenius viene utilizzata per normalizzare l'intera matrice di dati.
    14. Per ottenere un'immagine in falsi colori che illustri la distribuzione spaziale di un componente subcellulare, nel pannello Immagini sul lato destro, sull'Immagine di intensità, fare clic sul simbolo del menu Apri . Quindi fare clic sull'opzione Modifica immagine per aprire il pannello di modifica.
    15. Nel pannello di modifica, selezionare Banda singola, quindi definire l'intervallo spettrale (ad esempio, 715-725 cm-1 per il citoplasma). Seleziona Doppio colore sulla mappa dei colori, definisci il colore, la soglia di intensità e l'opacità, quindi fai clic su Conferma.
    16. Per scaricare uno spettro a punto singolo, fare clic sul pixel di interesse sull'immagine per selezionarlo. Quindi, nella sezione Cursore del pannello Legenda spettrale fare clic su Scarica spettro. Ripetere la stessa procedura per diversi componenti subcellulari.
    17. Per esportare gli spettri Raman in primo piano e nel substrato, nella sezione Identificazione substrato del pannello Legenda spettrale fare clic su Scarica spettro per entrambe le sezioni Primo piano e Substrato.
      NOTA: Nel protocollo precedentemente descritto per l'analisi dei dati RS, sono state descritte le fasi di pre-elaborazione e l'analisi univariata per generare immagini in falsi colori che illustrano la distribuzione spaziale dei componenti subcellulari chiave, gli spettri di intensità Raman sia dal primo piano che dal substrato e gli spettri a punto singolo delle strutture subcellulari. Mentre l'analisi a valle è spesso adattata alla specifica questione biologica, questo studio evidenzia ora metodi multivariati e di classificazione rappresentativi accessibili tramite la sezione Analisi delle mappe dello strumento basato sul web utilizzato. Questi includono l'analisi dei cluster, l'analisi delle componenti principali (PCA), la risoluzione della curva multivariata (MCR), N-FINDR e l'adattamento spettrale. L'adattamento spettrale consente la quantificazione e il confronto delle caratteristiche spettrali utilizzando approcci basati sulla distanza come il coefficiente di correlazione di Pearson o il mappatore dell'angolo spettrale. L'analisi dei cluster può essere condotta utilizzando algoritmi come k-means, Mini-batch k-means o clustering agglomerativo gerarchico, facilitando la segmentazione dei dati iperspettrali in base alla somiglianza spettrale. La PCA può essere applicata per ridurre la dimensionalità dei dati ed evidenziare i modelli di varianza, mentre l'MCR consente la scomposizione di segnali misti in spettri di componenti puri. L'algoritmo N-FINDR aiuta a estrarre gli spettri dei membri finali applicando prima la PCA per ridurre la dimensionalità, rendendolo particolarmente adatto per i set di dati iperspettrali. Questi strumenti forniscono un solido quadro per l'esplorazione a valle di modelli biologici codificati nei dati spettrali Raman.

4. Protocollo di misurazione TPM

  1. Preparare la configurazione del microscopio.
    1. Posizionare una goccia di acqua distillata sulla lente dell'obiettivo del microscopio. Posizionare il campione sul tavolino di traslazione del microscopio. Regolare la posizione del campione per allinearlo con la lente dell'obiettivo.
  2. Allineare le lenti dell'obiettivo e del condensatore.
    1. Accendi il microscopio e avvia il software di imaging TomoStudio. Fare clic sull'icona del microscopio sulla barra degli strumenti. Dopo l'inizializzazione, fare clic su Configurazione. Selezionate LiveCell nel pannello Lavoro e PBS come Supporto.
      NOTA: Il valore RI nel pannello Medio viene impostato automaticamente su 1,337 quando PBS è selezionato come medio.
    2. Accedere alla scheda Calibrazione nel pannello di controllo del software di imaging. Impostare le posizioni assiali delle lenti dell'obiettivo e del condensatore selezionando rispettivamente Messa a fuoco e Superficie.
    3. Fare clic su Modalità di scansione per regolare manualmente le lenti, assicurandosi che i modelli di illuminazione siano concentrati al centro del campo visivo e appaiano quasi fermi.
  3. Individuare il campione.
    1. Fare clic su Modalità normale e regolare la fase di traslazione per posizionare la cella nel campo visivo. Mettere a fuoco il campione regolando la posizione assiale della lente dell'obiettivo fino a quando il bordo del campione diventa quasi invisibile sullo schermo.
    2. Regola la fase di traslazione per individuare una regione senza celle, garantendo una visione senza ostacoli.
  4. Calibrare il sistema.
    1. Selezionare Calibra nel software di imaging per acquisire più ologrammi 2D con angoli di illuminazione variabili.
  5. Acquisisci il tomogramma RI 3D.
    1. Regolare la fase di traslazione per centrare la cella all'interno del campo visivo. Passare alla scheda Acquisizione e selezionare Istantanea 3D per acquisire il tomogramma della cella.
      NOTA: Il tempo di acquisizione per un tomogramma RI 3D di una singola cellula è significativamente più breve (nell'ordine dei secondi), rispetto al tempo di acquisizione richiesto dai dati RS; pertanto, l'adozione di un incubatore onstage per TPM non è tipicamente richiesta. Tuttavia, se devono essere eseguite misurazioni su un gran numero di cellule, o in condizioni specifiche, sono disponibili camere di incubazione commerciali dedicate che forniscono condizioni fisiologiche e possono essere integrate nel sistema TPM.

5. Analisi dei dati TPM

  1. Post-elaborazione delle mappe TPM utilizzando il software TomoStudio.
    1. Per visualizzare i tomogrammi olografici, selezionare i dati nel pannello di navigazione dati , fare clic con il pulsante destro del mouse sui dati e scegliere Apri. La scheda Ricerca si aprirà automaticamente per ulteriori analisi. Nel pannello Gestione dati , fare clic su Tomogramma RI.
    2. Nel pannello Visualizzazione volume , selezionare RI e disegnare quattro caselle di colore rettangolari all'interno dell'area di disegno RI.
      NOTA: Ogni casella di colore consente di associare, sul tomogramma mostrato sul pannello del display , un colore specifico ai componenti delle celle caratterizzate dall'intervallo di RI identificato dalla casella nel canvas RI. Dopo aver disegnato ogni casella di colore, le informazioni correlate vengono visualizzate automaticamente nella tabella sotto l'area di disegno dell'istanza riservata.
    3. Nel pannello sotto l'area di disegno dell'area di disegno, imposta i valori minimo e massimo dell'intervallo RI per ciascuna casella di colore (ad esempio, la prima casella di colore: MinRI = 1,3450 e MaxRI = 1,3499, la seconda casella di colore: MinRI = 1,3506 e MaxRI = 1,3571, la terza casella di colore: MinRI = 1,3586 e MaxRI = 1,3650, la quarta casella di colore: MinRI = 1,3688 e MaxRI = 1,3866). Associa un valore di opacità e un colore (facendo doppio clic su ciascuna casella e selezionando un colore) a ciascuna casella. Ciò consente la visualizzazione dei tomogrammi in base alle distribuzioni RI 3D.
    4. Fare clic su Salva per salvare gli intervalli RI e le caselle di colore definiti.
      NOTA: Gli intervalli dell'RI devono essere regolati in base ai campioni specifici.
    5. Per ottenere descrittori quantitativi della morfologia cellulare (ad esempio, volume [V], area superficiale [S], area proiettata [A], RI media, densità [D], massa secca [DM] e sfericità [Φ]), utilizzare l'interfaccia di analisi .
      NOTA: I dettagli sul calcolo teorico dei parametri quantitativi sono disponibili qui 2,23.
      1. Nella barra degli strumenti, fare clic su Analisi. Nel pannello Analisi a destra, selezionare Manuale nel pannello Segmentazione e impostare 1,3450 come Soglia RI. Quindi fare clic su Applica.
        NOTA: Assicurarsi che i valori del RII (fl/pg) e dell'RI basale siano rispettivamente 0,19 (l'incremento di rifrazione, ampiamente stabilito da precedenti indagini24) e 1,3370 (RI di PBS impiegato per l'RI della calibrazione di fondo PBS). Il software di imaging esegue una segmentazione volumetrica della cellula target in base alla soglia RI impostata e calcola gli indici morfologici (V, S, A, RI media, D, DM e Φ) e li riporta in una tabella di output nel pannello Measurement .
      2. Fare clic su Salva per salvare gli indici morfologici calcolati.
        NOTA: Oltre al software utilizzato, è possibile utilizzare diversi strumenti open source per quantificare i tratti morfologici dai dati TPM. CellProfiler (https://cellprofiler.org/) fornisce strumenti per l'analisi delle immagini, tra cui la segmentazione e l'estrazione di caratteristiche, compatibili con le immagini a contrasto di fase. Fiji (https://fiji.sc/) è un software open-source con plugin per la segmentazione e il calcolo dei parametri morfologici25. Napari (https://napari.org/) è un visualizzatore di immagini multidimensionale con supporto per l'integrazione di modelli di apprendimento automatico per la segmentazione e l'analisi. Ilastik (https://www.ilastik.org/) offre strumenti di segmentazione basati sull'apprendimento automatico e DeepImageJ (https://deepimagej.github.io/) integra modelli di deep learning con ImageJ/Fiji per l'analisi avanzata. Inoltre, MorphoLibJ (https://imagej.net/plugins/morpholibj) fornisce strumenti per operazioni morfologiche 2D e 3D nelle Fiji. Cellpose326 è un altro strumento basato sul deep learning per la segmentazione cellulare che può essere applicato all'imaging a contrasto di fase.

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Risultati

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Abbiamo descritto un flusso di lavoro per la caratterizzazione morfo-chimica label-free di cellule viventi basato su RS confocale e TPM. Abbiamo testato la capacità del flusso di lavoro proposto di raggiungere la composizione molecolare e i parametri morfologici della linea cellulare di carcinoma mammario umano MDA-MB-231 (Figura 1).

Le cellule MDA-MB-231 sono state seminate su piastre di Petri con fondo in vetro di quarzo. Un microscopio Raman confocale costruito...

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Discussione

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Abbiamo presentato un approccio multimodale e una pipeline di analisi semplice che integra due tecniche di imaging avanzate e prive di marcature: RS e TPM. Il flusso di lavoro descritto ha consentito una fenotipizzazione morfochimica rapida e non invasiva di singole cellule viventi di cancro al seno umano (MDA-MB-231) senza la necessità di marcatura esterna.

La RS è una tecnica non distruttiva che consente la caratterizzazione della composizione biochimica di ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata finanziata dal Progetto Rocca della fondazione MIT-Italia, dalle sovvenzioni NIH (P41EB015871, UH3CA275687, R01DC021326), da Apollon (Seoul, Corea del Sud) e dal National Cancer Center, Corea (NCC-24H1170). Leonardo Bianchi riconosce l'assegnazione di una borsa di studio post-dottorato Progetto Rocca per condurre ricerca collaborativa presso il Massachusetts Institute of Technology e il Politecnico di Milano.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Telecamera CCDStrumenti di PrincetonPIXIS 100BR eXcelonRivelatore per segnale di scattering Raman.
Software di controllo della telecamera CCDStrumenti di PrincetonCampo luminoso
Laser Ti-Sapphire a onda continua (lunghezza d'onda: 785 nm)Spettri-Fisica3900 SViene utilizzato per l'eccitazione al microscopio Raman.
Specchio dicroicoThorLabsDMSP750BSpecchio dicroico da 749 nm, devia l'eccitazione Raman da 785 nm al campione, filtra la fluorescenza e i segnali di campo chiaro.
Siero fetale bovinoThermo Fisher ScientificoA5256701
Corpo del microscopio a fluorescenzaOlimpoIX83
Laser (lunghezza d'onda: 532 nm)Spettri-FisicaMillenni eVLaser a pompa per sistema laser Ti-Sapphire da 785 nm.
Software MATLABMathWorks2023a
Linea cellulare MDA-MB-231ATCCHTB-26
Spettrografo NIRAndrorHolospec HS-HSG-785-LFViene utilizzato per l'analisi spettrale della luce retrodiffusa.
Obiettivo (60& 1,2 NA ad immersione in acqua)OlimpoUPLSAPO60&volte;
Camera di incubazione sul palcoColpo Tokaistxg-welsx-set
Software di controllo del microscopio open sourceµ DirettoreMicro-Manager-2.0
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientifico15140122
Senza fenoli DMEM/F-12Thermo Fisher Scientifico21041025
Soluzione salina tamponata con fosfatoGibco10-010-023
Piastre Petri con fondo in vetro di quarzoSveglia B TechSF-S-D12
Software di analisi dati RamanRamAppStrumento web-based per l'elaborazione di dati iperspettrali Raman.
Fotocamera sCMOSFotonica di HamamatsuOrca Flash 4.0 v2
Pompa a siringaChemyxFusione 720
Microscopio di fase tomograficoTomocube, Inc.HT-2HSistema commerciale per l'ottenimento di immagini di fase quantitative.
Software di analisi dati TPMTomocube, Inc.TomoStudioSoftware utilizzato per l'analisi dei dati di microscopia di fase tomografica (TPM).

Riferimenti

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