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Articolo metodologico

Indagine sugli effetti della terapia a infrarossi sull'osso dopo l'allenamento su tapis roulant ad alta intensità

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⸱

DOI:

10.3791/68502

⸱

22 agosto 2025

 ,  ,  , 
1School of Exercise and Health, Shanghai University of Sport, 2College of Athletic Performance, Shanghai University of Sport, 3Institute of Orthopedic Surgery, Xijing Hospital, Air force Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'allenamento prolungato ad alta intensità sul tapis roulant inibisce la formazione ossea e favorisce il riassorbimento osseo nei topi, con conseguente diminuzione della massa ossea. Qui, presentiamo un protocollo per esaminare gli effetti della terapia a infrarossi sulle alterazioni del metabolismo osseo indotte dall'esercizio fisico ad alta intensità. Sono necessari ulteriori studi meccanicistici per chiarire i percorsi molecolari sottostanti.

Abstract

Il tessuto osseo è un importante organo portante del corpo umano. L'esercizio moderato aumenta la massa ossea attraverso il carico meccanico, mentre l'esercizio ad alta intensità può sopprimerla. La terapia a infrarossi migliora la circolazione, riduce il dolore/infiammazione e aiuta la riparazione dei tessuti. Questo articolo presenta un protocollo per chiarire gli effetti modulatori della terapia a infrarossi sui disturbi metabolici scheletrici indotti dall'esercizio ad alta intensità e sui loro meccanismi molecolari. In questo studio, 24 topi di 6 settimane sono stati divisi casualmente in gruppi di controllo (CTR, N = 8), allenamento su tapis roulant ad alta intensità (HIT, N = 8) e terapia a infrarossi dopo esercizio su tapis roulant ad alta intensità (IRT, N = 8). Gli ultimi due gruppi sono stati addestrati per 8 settimane. Nella prima settimana, i topi sono stati sottoposti a un allenamento di acclimatazione sul tapis roulant. Nella seconda settimana, i topi si sono esercitati alla velocità di 24 m/min per 50 minuti, che è aumentata alla velocità di 1 m/min e 10 minuti ogni settimana fino a raggiungere i 28 m/min per 80 minuti, con una pendenza di 5° per 6 giorni. Alla quinta settimana, i topi del gruppo HIT sono stati sottoposti a un intervento di terapia a infrarossi per tutto il corpo, con la temperatura controllata tra 42 °C e 45 °C. L'intero processo di trattamento è durato ~40 minuti, 3 volte a settimana. I risultati hanno mostrato che nel gruppo HIT rispetto a quelli del gruppo CTR, il volume osseo/volume totale e il numero trabecolare erano significativamente diminuiti, la separazione trabecolare era significativamente aumentata, i geni osteogenici di Atf4, Runx2 e Ocn erano sottoregolati e i geni osteoclasti di Ctsk e Mmp9 correlati sono stati sovraregolamentati. I risultati della micro-CT dei topi del gruppo IRT non hanno mostrato differenze significative, ma i geni correlati all'osteogenesi Alp, Atf4, Runx2, Ocn e Osx erano sovraregolati nel femore. Inoltre, il gene Ctsk , correlato agli osteoclasti, è stato sottoregolato. L'esercizio a lungo termine ad alta intensità sul tapis roulant può ridurre la massa ossea. Sebbene la terapia a infrarossi non influisca sulla densità minerale ossea, può migliorare il metabolismo osseo.

Introduzione

L'osteoporosi (OP) è una delle malattie metaboliche ossee sistemiche più comuni, particolarmente diffusa tra gli anziani, e rappresenta un importante problema di salute globale1. L'OP è caratterizzata principalmente da una diminuzione della densità minerale ossea (BMD), della qualità ossea e della forza ossea, che aumenta il rischio di fratture ossee2. La prevenzione e il trattamento dell'OP sono fondamentali per migliorare la qualità della vita umana e comprendono approcci come la terapia farmacologica, l'assunzione adeguata di calcio e vitamina D, la riduzione del fumo e del consumo di alcol e l'esercizio fisico precoce per aumentare e mantenere il livello di massa ossea di picco 3,4.

L'osso, in quanto struttura del corpo, fornisce la forma fondamentale e protegge gli organi interni. Sotto la regolazione del sistema nervoso, l'osso facilita vari movimenti durante le contrazioni muscolari. Per tutta la vita, l'osso subisce una continua formazione, riassorbimento e rimodellamento. Gli osteoclasti riassorbono continuamente l'osso vecchio, mentre gli osteoblasti formano e mineralizzano l'osso nuovo. Questi processi sono strettamente accoppiati e regolati reciprocamente, mantenendo un equilibrio dinamico nel turnover osseo5. Numerosi studi hanno dimostrato che un adeguato esercizio fisico (come l'esercizio aerobico e l'allenamento di resistenza) può prevenire e trattare efficacemente l'OP6. L'esercizio fisico influenza il metabolismo osseo modulando lo stress meccanico sullo scheletro (come l'impatto con il suolo, lo shock e la tensione del sito di attacco muscolare) e i fattori biochimici nella circolazione sanguigna (come ormoni e citochine), promuovendo così la salute delle ossa7. Tuttavia, l'esercizio prolungato ad alta intensità potrebbe influire negativamente sulla salute delle ossa, portando alla perdita ossea. Ad esempio, dopo 8 settimane di corsa sul tapis roulant ad alta, moderata e bassa intensità (a una velocità di 15 m/min) in un modello murino con lesione della cuffia dei rotatori, il volume osseo/volume totale (BV/TV), il numero trabecolare (Tb.N) e lo spessore trabecolare (Tb.Th) erano più bassi nel gruppo ad alta intensità rispetto a quelli nei gruppi di controllo e moderata/bassa intensità, mentre la separazione trabecolare (Tb.Sp) era più alta. Questa scoperta suggerisce che l'allenamento ad alta intensità ha effetti dannosi sul recupero della cuffia dei rotatori e sulla massa ossea8.

La terapia a infrarossi (IRT) è uno dei principi più utilizzati nei dispositivi di fisioterapia riabilitativa in Cina. Favorisce la circolazione sanguigna locale, accelera l'assorbimento delle sostanze infiammatorie e migliora l'apporto di sostanze nutritive 9,10. Come terapia fisica non invasiva, negli ultimi anni l'IRT ha guadagnato un'attenzione diffusa nei campi della medicina dello sport, della scienza della riabilitazione e della ricerca sul metabolismo osseo. L'IRT è più comunemente usato in ambito clinico rispetto ad altri interventi. Gli studi hanno dimostrato che la guarigione del tessuto osseo è un processo complesso, che include la risoluzione dell'infiammazione e la rigenerazione cellulare, che può essere suddiviso in tre fasi: infiammazione, proliferazione e rimodellamento. La fase infiammatoria è caratterizzata principalmente dall'angiogenesi; la fase proliferativa prevede la proliferazione degli osteoblasti e la formazione di nuovo osso; e la fase di rimodellamento è caratterizzata dal graduale aumento delle trabecole di nuova formazione all'interno del callo, con il callo del ponte che attraversa la fessura della frattura completamente in ossificazione11. Dopo una frattura, il sangue che scorre dai vasi nei tessuti deve essere assorbito rapidamente, il che stimola la proliferazione degli osteoblasti e la formazione ossea. Questi processi vitali richiedono un ambiente interno favorevole e nutrienti sufficienti per il supporto. Un certo grado di termoterapia può facilitare efficacemente queste funzioni12. Nella pratica clinica, la terapia a infrarossi può essere utilizzata come mezzo ausiliario per trattare l'osteoporosi e aiutare ad alleviare i sintomi correlati, ma la sua ricerca sulla massa ossea è relativamente limitata. Questo articolo presenta un protocollo per chiarire gli effetti modulatori della terapia a infrarossi sui disturbi metabolici scheletrici indotti dall'esercizio ad alta intensità e sui loro meccanismi molecolari. Pertanto, questo lavoro, basato su precedenti ricerche13, costruisce un modello di esercizio su tapis roulant ad alta intensità nei topi per osservare i cambiamenti nella massa ossea e indagare ulteriormente se la termoterapia può mitigare la perdita ossea indotta dall'esercizio su tapis roulant ad alta intensità. L'obiettivo è quello di fornire un riferimento per la prevenzione e il trattamento dell'OP basati sull'esercizio fisico.

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Protocollo

Questo studio ha ricevuto l'approvazione etica dal Comitato etico degli animali da laboratorio dell'Università dello sport di Shanghai (n. 102772023DW016) ed è conforme alle normative nazionali/istituzionali sulla ricerca sugli animali. Ventiquattro topi maschi C57BL/6 di 5 settimane sono stati ospitati in una struttura per animali di grado SPF presso l'Università dello Sport di Shanghai. I topi sono stati alloggiati a 22 ± 2 °C, 40-70% di umidità con cicli luce/buio di 12 ore e hanno ricevuto cibo/acqua ad libitum . Tutti i materiali biologici, comprese le ossa, il sangue e i campioni trattati con reagenti per l'estrazione dell'RNA, devono essere raccolti in sacche per autoclave di livello II a rischio biologico, sterilizzate a 121 °C per 60 minuti prima dello smaltimento, con un'adeguata documentazione nei registri dei rifiuti di laboratorio.

1. Animali

  1. Dopo 1 settimana di acclimatazione, stratificare i topi in base al peso corporeo e assegnarli in modo casuale a tre gruppi: i gruppi di controllo (gruppo CTR, N = 8), allenamento su tapis roulant ad alta intensità (HIT, N = 8) e terapia a infrarossi dopo esercizio su tapis roulant ad alta intensità (IRT, N = 8).

2. Allenamento con tapis roulant ad alta intensità e protocollo di intervento termoterapico

  1. Alimentare il gruppo CTR in condizioni statiche senza intervento.
  2. Dopo 1 settimana di acclimatazione, sottoporre i topi dei gruppi HIT e IRT a 8 settimane di allenamento su tapis roulant ad alta intensità. La prima settimana è considerata la fase di adattamento: fai correre i topi del gruppo di tapis roulant a velocità di 12, 15 e 18 m/min rispettivamente per 20, 30 e 40 minuti, con un'inclinazione di 0°. Nella seconda settimana, fare in modo che i topi si esercitino alla velocità di 24 m/min per 50 minuti, quindi aumentare l'esercizio al ritmo di 1 m/min e 10 minuti ogni settimana fino a raggiungere i 28 m/min per 80 minuti, con una pendenza di 5°. Condurre questo regime di esercizi 6 giorni alla settimana, con riposo la domenica (Tabella 1).
  3. Per il gruppo IRT, dopo 4 settimane di esercizio sul tapis roulant, introdurre la terapia a infrarossi (IRT) nella quinta settimana.
    NOTA: Durante l'irradiazione a infrarossi, mantenere rigorosamente la temperatura corporea del mouse tra 42 °C e 45 °C.
    1. Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale per indurre l'incoscienza.
    2. Irradiare l'intero corpo dei topi utilizzando l'apparecchio terapeutico a infrarossi, assicurandosi che la temperatura dei topi sia mantenuta tra i 42 °C e i 45 °C (rilevata da un rilevatore di temperatura). Eseguire l'intero processo di trattamento per ~40 minuti, 3 volte a settimana (lunedì, mercoledì e sabato), per 4 settimane fino al prelievo dei campioni.

3. Raccolta dei tessuti

NOTA: I campioni di osso di topo sezionati devono essere immediatamente conservati in azoto liquido o a -80 °C per mantenere l'integrità dell'RNA.

  1. Raccolta e conservazione dei campioni di siero
    1. Pesa tutti i mouse utilizzando una bilancia elettronica.
    2. Anestetizzare i topi tramite un'iniezione intraperitoneale di tribromoetanolo.
      NOTA: Quando si maneggia il tribromoetanolo, preparare sempre soluzioni fresche sotto una cappa chimica indossando guanti in nitrile e protezione per gli occhi, conservare a 4 °C in fiale ambrate protette dalla luce e smaltire le porzioni inutilizzate attraverso canali di rifiuti chimici approvati.
    3. Raccogliere campioni di sangue in modo asettico utilizzando la puntura cardiaca per ottenere 0,5-0,6 ml di sangue. Per prima cosa, radere i peli del torace del topo e disinfettare con iodoforo. Successivamente, palpare il punto di massima pulsazione cardiaca e inserire un ago da 4-5 G attaccato a una siringa nella cavità toracica sinistra tra il terzo e il quarto spazio intercostale. Infine, quando si osserva che il sangue scorre spontaneamente nella siringa, applicare un'aspirazione delicata per completare la procedura di raccolta del sangue.
    4. Lasciare coagulare i campioni di sangue per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi centrifugare a 1.000 × g per 15 minuti. Aliquotare e conservare il surnatante (siero) a -80 °C.
  2. Raccolta e conservazione dei campioni ossei
    1. Usa micro forbici e pinzette sterili per sezionare sia i femori che le tibie. Staccare delicatamente i muscoli e i tendini dalla superficie ossea lungo l'asse longitudinale, senza raschiare il periostio, e prestare particolare attenzione alla protezione della cartilagine di crescita.
    2. Sciacquare tutti i campioni con 1x PBS (pH 7,4). Fissare il femore sinistro in paraformaldeide al 4% (PFA) per 24 ore. Utilizzare il femore sinistro per la misurazione della densità minerale ossea prima di ulteriori analisi.
    3. Posizionare il femore destro in provette da microcentrifuga da 1,5 mL premarcate e conservare a -80 °C.
    4. Utilizzare il femore destro ed entrambe le tibie per i saggi del metabolismo osseo.

4. Misurazione dei parametri

  1. Misurazione del livello di glucosio nel sangue
    1. Prima della raccolta dei tessuti, prelevare campioni di sangue dalla vena caudale dei topi. Misurare i livelli di glucosio nel sangue utilizzando un analizzatore di glucosio portatile.
  2. Misurazione del livello di lattato nel sangue
    1. Subito dopo l'ultima sessione di esercizi sul tapis roulant, raccogliere campioni di sangue dalla vena caudale. Determinare i livelli di lattato nel sangue utilizzando un analizzatore di lattato portatile.
  3. Prova Rotarod
    NOTA: Dopo che tutti gli interventi sono stati completati, abbiamo eseguito i test rotarod sui topi di ciascun gruppo. Quando conduciamo il test del rotarod, scegliamo diversi gruppi di topi da testare contemporaneamente per garantire un tempo di riposo costante, piuttosto che testare prima un gruppo di topi, in modo da poter escludere le differenze causate dal tempo di riposo.
    1. Posizionare i topi su un apparecchio rotarod con la testa rivolta verso il senso opposto di rotazione, consentendo una prova di adattamento.
    2. Impostare la velocità del rotarod a 30 giri/min; Dopo l'avviamento, l'apparecchio accelera uniformemente fino alla velocità impostata.
    3. Registra il tempo fino alla prima caduta del mouse. Usa questa misura per valutare la capacità di coordinazione motoria dei topi.
  4. Misurazione della massa ossea trabecolare femorale
    1. Rimuovere il muscolo e il tessuto connettivo attaccato alle ossa utilizzando micro-forbici e pinze sterili e lavare con PBS.
    2. Eseguire la scansione micro-CT per valutare i parametri dell'osso trabecolare nel femore sinistro utilizzando i seguenti parametri di scansione: la scansione micro-CT è stata eseguita a 55 kVp/145 μA (8 W) in modalità di rotazione continua con voxel isotropi da 9 μm, FOV di 31,0 mm, esposizione di 250 ms, risoluzione nativa (388 strati/segmento) e calibrazione BH di 1.200 mgHA/cc.
    3. Misurare i seguenti risultati della microarchitettura trabecolare e corticale.
      1. Importa le immagini ricostruite in CT-vox per il rendering e la visualizzazione tridimensionale (3D).
      2. Utilizzando le viste multiplanari (piani coronali, sagittali e trasversali), separare ed estrarre l'osso corticale e trabecolare in regioni di tessuto distinte per consentire un'analisi indipendente delle loro caratteristiche morfometriche.
      3. Quantificare i principali parametri microstrutturali, tra cui il volume osseo/volume totale (BV/TV), il numero trabecolare (Tb.N) e lo spessore trabecolare (Tb.Th), la separazione trabecolare (Tb.Sp), per valutare lo sviluppo osseo e lo stato di mineralizzazione.
  5. Sezionamento in paraffina e colorazione istologica
    1. Lavare tre femori sinistri di ciascun gruppo con PBS e decalcificarli in EDTA al 10% (pH 7,15) fino alla completa decalcificazione.
    2. Disidratare i campioni attraverso concentrazioni graduate di etanolo (70%, 90%, 95% e 100%), limpizzare con xilene, infiltrarli con paraffina e incorporarli (vedere Tabella 2).
    3. Taglio di sezioni seriali di 5,0 μm di spessore.
    4. Colorazione con ematossilina ed eosina (HE)
      1. Sottoporre le fette prima alla deceratura dello xilene, alla reidratazione con etanolo in gradiente, quindi immergerle nell'ematossilina per 5 minuti.
      2. Lavare per rimuovere la macchia in eccesso, differenziare in alcol acido cloridrico all'1% per 3 s, colorare con eosina per 3 minuti, disidratare con etanolo graduato, pulire con xilene e montare con gomma neutra (vedi Tabella 3).
      3. Acquisisci immagini microscopiche per osservare la struttura del tessuto osseo e la morfologia e la distribuzione cellulare nella cavità del midollo osseo.
    5. Colorazione con fosfatasi acida resistente ai tartrati (TRAP)
      1. Decerare le fette con xilene e reidratarle con etanolo a gradiente.
      2. Incubare le fette con il reagente TRAP in un forno a 37 °C per 1 ora, disidratarle e renderle trasparenti (vedi Tabella 4).
      3. Applicare una goccia di resina neutra sul vetrino, quindi abbassare con cautela il vetrino coprioggetti a un angolo di 45° da un bordo per ridurre al minimo la formazione di bolle. Lasciare asciugare completamente il vetrino montato in una cappa aspirante prima di procedere con l'osservazione microscopica e l'imaging.
  6. Analisi dell'espressione genica nel tessuto osseo tibiale
    1. Isolamento del midollo osseo
      1. Sezionare le tibie di topo e rimuovere il muscolo/fascia in eccesso utilizzando strumenti sterili.
      2. Mettere le tibie pulite in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
      3. Taglia entrambe le estremità dell'osso con le forbici sterili.
      4. Lavare il midollo osseo in un tubo di macinazione contenente perle di macinazione sterili utilizzando 1x PBS.
        NOTA: Sciacquare la cavità del midollo osseo con PBS fino a quando la cavità appare pallida e tutto il tessuto midollare visibile viene rimosso.
    2. Estrazione dell'RNA
      NOTA: I rifiuti di cloroformio/isopropanolo devono essere separati in appositi contenitori di solventi alogenati e mai mescolati con candeggina a causa della formazione di gas tossici.
      1. Aggiungere 1 mL di reagente per l'estrazione dell'RNA per provetta. Omogeneizzare i campioni utilizzando un omogeneizzatore da banco (30 s impulsi, 4 °C). Incubare i lisati a temperatura ambiente per 5 minuti.
      2. Aggiungere 200 μl di cloroformio, agitare per 15 s e incubare a 4 °C per 30 min.
      3. Centrifugare a 12.000 × g per 30 min a 4 °C.
      4. Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta per microcentrifuga. Aggiungere 500 μl di isopropanolo, capovolgere 10 volte per mescolare e incubare a 4 °C per 20 minuti.
      5. Centrifugare a 12.000 × g per 30 min a 4 °C. Scartare il surnatante con cura senza disturbare il pellet di RNA.
      6. Lavare il pellet con 1 mL di etanolo al 75% (preparato con acqua trattata con DEPC). Agitare brevemente e centrifugare a 7.500 × g per 5 minuti a 4 °C.
      7. Asciugare il pellet all'aria per 5-10 minuti in una cappa aspirante (evitare un'asciugatura eccessiva).
      8. Sciogliere l'RNA in 20-50 μL di acqua trattata con DEPC.
      9. Misurare la concentrazione e la purezza (rapporto A260/A280 ≥ 1,8) utilizzando uno spettrofotometro.
    3. Sintesi del cDNA
      1. Sintetizzare il cDNA utilizzando 1 μg di RNA totale e un kit di trascrizione inversa.
      2. Conservare il cDNA a -20 °C per l'analisi qPCR.
    4. Analisi qPCR
      1. Analizzare l'espressione genica per marcatori osteogenici: Alp, Atf4, Runx2, Ocn, Osx; marcatori osteoclasti: Nfatc1, Mmp9, Ctsk; citochine: Tnf-α, Il-1β, Il-10 (vedi Tabella 5).
      2. Utilizzare le sequenze di primer elencate nella Tabella 6 (comprese le temperature di ricottura).

5. Analisi statistica

  1. Presentare tutti i dati come media ± errore standard della media (media ± SEM).
  2. Utilizzare Bonferroni e Tamhani per i test post-hoc.
  3. Condurre un'analisi unidirezionale della varianza per valutare le differenze tra i gruppi.
  4. Considera P < 0,05 statisticamente significativo.

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Risultati

Affaticamento dovuto all'allenamento prolungato ad alta intensità sul tapis roulant
Abbiamo stabilito un modello di esercizio di corsa su piattaforma ad alta intensità a lungo termine per studiare i cambiamenti scheletrici sotto esercizio e gli effetti della terapia a infrarossi sulle ossa (Figura 1A). Alla fine dell'intervento, i topi sono stati osservati per i cambiamenti nel peso corporeo. Rispetto al peso corporeo dei topi nel gruppo CTR, non è stato determinato alcun...

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Discussione

Di tutte le malattie metaboliche dell'osso, l'OP è il più comune e uno dei principali problemi di salute pubblica globale11. L'OP insorge quando le funzioni osteoblastiche e osteoclastiche sono disfunzionali e la sua prevalenza è elevata18. L'esercizio fisico è stato sempre più enfatizzato da medici e ricercatori come una potenziale strategia per la prevenzione e il trattamento dell'OP, considerando il suo basso costo e pochi effetti avvers...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da segnalare.

Ringraziamenti

Il lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82172475, 82222046, 82272608); Shanghai Key Laboratory of Human Sport Competence Development and Maintenance (Università dello Sport di Shanghai) (n. 11DZ2261100).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Strumento per terapia a infrarossi lontani  Tecnologia medica CofoeLa radiazione infrarossa è stata quindi applicata come fonte di calore per riscaldare il sangue nella rete capillare sottocutanea. La temperatura della terapia è stata controllata tra 42 ° C e 45 gradi C, e l'intero trattamento è durato circa 40 minuti, 3 volte a settimana
Micro-CTSCANCO Medical AGVIVACT80La scansione micro-CT è stata eseguita per valutare i parametri dell'osso trabecolare nel femore sinistro, tra cui BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp e spessore corticale (Ct.Th).
Tapis roulant per mouseAnhui Zhenghua Biological Apparatus Facilities Co., LtdCorsa su tapis roulant ad alta intensità nei topi
Macchina per l'inclusione di paraffinaLeicaLa macchina per l'inclusione della paraffina può incorporare i tessuti
affettatrice a paraffinaLeicaIl microtomo di paraffina può affettare i tessuti
Kit di reagenti PrimeScript RT 
SPSS 
Tribromoetanolo Avertina
TRIzol Biologia accurataAG21101/AG21102

Riferimenti

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