Method Article

Clonazione shuttle basata su CRISPR: un metodo di clonazione ad alto rendimento

DOI:

10.3791/68503

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un protocollo per un metodo di clonaggio ad alto rendimento, il clonaggio shuttle basato su CRISPR (CRISPRshuttle cloning), che consente il trasferimento di frammenti di DNA di interesse tra vettori senza la necessità di amplificazione PCR dei frammenti di DNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo sviluppo di librerie di plasmidi a livello di genoma utilizzando i repository genomici esistenti costituisce un prerequisito fondamentale per la caratterizzazione funzionale sistematica dei geni in diversi processi biologici. Le attuali metodologie ad alto rendimento per il trasferimento di frammenti di DNA intervettoriali, tuttavia, richiedono l'amplificazione PCR delle sequenze bersaglio prima del clonaggio, rendendo la generazione di collezioni di plasmidi su scala genomica tecnicamente impegnativa e dispendiosa in termini di tempo. Sfruttando una cassetta CRISPRshuttle, abbiamo sviluppato un nuovo metodo di clonazione ad alto rendimento, il clonaggio shuttle basato su CRISPR (clonazione CRISPRshuttle), che facilita il trasferimento di molti frammenti di DNA da plasmidi donatori che condividono sequenze di backbone identiche a un vettore compatibile con CRISPRshuttle senza amplificazione PCR dei frammenti di DNA. Qui presentiamo un protocollo per CRISPRshuttle. Questo protocollo prevede due reazioni sequenziali in provetta prima della trasformazione batterica. In primo luogo, i frammenti di DNA bersaglio vengono asportati dai plasmidi donatori mediante scissione mediata da Cas9 della loro sequenza di scheletro vettoriale condivisa. In secondo luogo, i frammenti di DNA asportati vengono inseriti in vettori linearizzati compatibili con CRISPRshuttle attraverso l'assemblaggio di Gibson. I nostri risultati dimostrano che l'efficienza di CRISPRshuttle supera il 94% e che due ricercatori possono generare circa 300 plasmidi in 7 giorni utilizzando CRISPRshuttle. CRISPRshuttle facilita il trasferimento efficiente, adattabile ed economico di frammenti di DNA tra vettori, semplificando significativamente la generazione di librerie plasmidiche a livello di genoma.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La costruzione di librerie di plasmidi a livello di genoma a partire dalle risorse disponibili è la base e il prerequisito per l'impiego della genomica funzionale per sezionare i processi biologici. Gli attuali metodi di clonazione ad alto rendimento, inclusi i sistemi di clonazione Gateway, In-Fusion, Creator e Univector, richiedono l'amplificazione PCR dei frammenti di DNA target 1,2,3,4,5. Questo prerequisito comporta flussi di lavoro di elaborazione specifici per frammenti che comprendono più operazioni standardizzate, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la progettazione di primer per oligonucleotidi, la purificazione del gel e la convalida della sequenza attraverso il sequenziamento. Di conseguenza, la costruzione di librerie di plasmidi a livello di genoma (ad esempio, librerie di sovraespressione cDNA/ORF) è diventata laboriosa e dispendiosa in termini di tempo, impedendo l'avanzamento della genomica funzionale.

In precedenza, abbiamo sviluppato CRISPRmass, un metodo di clonaggio ad alto rendimento progettato per integrare specifici frammenti di DNA (ad esempio, il modulo UAS) in più plasmidi che condividono dorsali vettoriali identiche6. Utilizzando CRISPRmass, abbiamo costruito più di 5.500 plasmidi UAS-cDNA/ORF basati su GAL4/UAS da una libreria di cDNA/ORF di Drosophila , la Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection6. Tuttavia, CRISPRmass non ha la capacità di trasferire frammenti di DNA tra vettori, limitando la sua applicazione nel clonaggio ad alto rendimento.

Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato la clonazione shuttle basata su CRISPR (CRISPRshuttle), un nuovo metodo ad alto rendimento che facilita il trasferimento di più frammenti di DNA bersaglio ai vettori di destinazione dai plasmidi donatori7. Questo processo richiede solo due reazioni sequenziali in provetta, eludendo così il requisito per la manipolazione specifica del frammento di bersagli discreti di DNA7.

Il protocollo CRISPRshuttle prevede due reazioni sequenziali in provetta (Figura 1). In primo luogo, le sequenze vettoriali condivise dei plasmidi del donatore vengono scisse da Cas9/sgRNA per rilasciare frammenti di DNA bersaglio. Questi frammenti vengono poi trasferiti nella cassetta CRISPRshuttle di un vettore compatibile con CRISPRshuttle tramite l'assemblaggio Gibson per generare i plasmidi finali. Una cassetta CRISPRshuttle comprende una sequenza di backbone vettoriale di ~20-40 bp che fiancheggia le estremità 5' e 3' dei frammenti di DNA provenienti da plasmidi donatori e uno o due siti di riconoscimento di enzimi di restrizione unici situati tra queste sequenze fiancheggianti. Un vettore compatibile con CRISPRshuttle viene costruito inserendo una cassetta CRISPRshuttle in un vettore di destinazione, che viene successivamente linearizzato digerendo i siti di restrizione all'interno della cassetta. Il vettore di destinazione deve portare un gene di resistenza agli antibiotici distinto da quelli dei plasmidi donatori; Se identico, il gene di resistenza deve essere sostituito con uno distinto prima dell'uso.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che utilizza CRISPRshuttle per costruire una libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF. Questo processo prevede il trasferimento di ORF umane dalla CCSB-Broad Lentiviral Expression Library al vettore di transgenesi di Drosophila pBID-UASC 8,9. CRISPRshuttle semplifica la costruzione di librerie di plasmidi a livello di genoma, facilitando così gli studi di genomica funzionale.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Determinazione dei siti ottimali di scissione di Cas9/sgRNA che fiancheggiano cDNA/ORF

  1. Preparazione di plasmidi cDNA/ORF
    1. Ottieni cloni di cDNA/ORF da repository pubblici.
      NOTA: Questo protocollo utilizza i cloni ORF basati su vettori pLX304 della libreria di espressione lentivirale umanaCCSB 8.
    2. Isolare il plasmide utilizzando un kit di miniprep plasmidico e misurarne la concentrazione con uno spettrofotometro.
  2. Progettazione di sgRNA
    1. Accedi al sito web di CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Incollare la regione 20-100 bp della dorsale vettoriale pLX304 che fiancheggia l'estremità ORF 3' nel campo target.
    2. Seleziona Drosophila melanogaster come specie e fai clic su Trova siti di destinazione. Seleziona i candidati sgRNA che si prevede abbiano un'efficienza superiore all'80%.
  3. Preparazione di sgRNA
    1. Sintetizzare un primer diretto (5′-TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3′) dove (N)20 rappresenta la sequenza bersaglio dell'sgRNA e un primer inverso sgRNA-REV (5′- AAAAGCACCGACTCGTGCCACTT-3′).
      NOTA: Si consigliano primer purificati con PAGE.
    2. Generare un modello di DNA per la trascrizione in vitro (IVT) di sgRNA tramite PCR. Preparare una reazione da 100 μL contenente 5 μL ciascuno di stampo pX330 (plasmide Addgene 42230; 0,1 ng/μL), primer diretto (10 μM) e primer sgRNA-REV (10 μM); 50 μL di 2x master mix PCR ad alta fedeltà; e 35 μl di acqua ultrapura trattata con pirocarbonato di dietil (DEPC).
    3. Amplificare in un termociclatore PCR utilizzando il seguente programma: 98 °C per 30 s; 5 cicli di 98°C per 8 s, 52 °C per 15 s, 72 °C per 5 s; 30 cicli a 98 °C per 8 s, 72 °C per 20 s; 72 °C per 2 min.
    4. Risolvi i prodotti PCR su un gel di agarosio allo 0,8%. Asciugare la banda da ~120 bp e purificare utilizzando un kit di estrazione del gel.
    5. Preparare una reazione IVT da 10 μL contenente 300 ng di frammento di DNA purificato, 3,33 μL di miscela tampone NTP, 0,67 μL di miscela di RNA polimerasi T7 e acqua ultrapura trattata con DEPC. Incubare a 37 °C per 4 ore.
    6. Quantificare l'sgRNA non purificato mediante spettrofotometria, diluire a 20 ng/μl con acqua ultrapura trattata con DEPC e congelare a -80 °C in piccole aliquote.
      NOTA: Il trattamento con DNasi non è necessario, poiché il DNA residuo non interferisce con le reazioni a valle.
  4. Valutazione dell'sgRNA
    1. Digerire un plasmide cDNA/ORF contenente la spina dorsale del vettore pLX304 utilizzando un enzima di restrizione. Risolvi i frammenti di DNA risultanti con gel di agarosio allo 0,8%. Purificare il substrato del DNA utilizzando un kit di estrazione con gel.
    2. Preparare una miscela di reazione di scissione Cas9 da 5 μL contenente 0,2 μL di S. pyogenes Cas9 da 1,22 μM, 0,5 μL di sgRNA da 20 ng/μL, 0,015 pmol di substrato di DNA, 0,5 μL di tampone Cas9 10x e acqua ultrapura trattata con DEPC. Incubare la reazione a 37 °C per 1 ora.
    3. Risolvere i prodotti per la scissione utilizzando il gel di agarosio allo 0,8%. Includere il substrato di DNA non scisso come controllo negativo.
    4. Visualizzare i modelli di scissione utilizzando un sistema di imaging digitale e selezionare l'sgRNA con un substrato residuo minimo non scisso per gli esperimenti successivi (Figura 2).

2. Scambio del gene di resistenza agli antibiotici del vettore di destinazione

NOTA: In questo protocollo, utilizziamo l'esempio dello scambio del gene di resistenza all'ampicillina del vettore di destinazione pBID-UASC con il gene di resistenza al cloramfenicolo, generando così il vettore di destinazione contenente cloramfenicolo pBIDC-UASC.

  1. Rimuovere il gene di resistenza all'ampicillina da pBID-UASC.
    NOTA: Il gene di resistenza all'ampicillina di pBID-UASC è stato rimosso mediante digestione Cas9 in combinazione con due sgRNA, f1Ori5-G4 (sequenza bersaglio: 5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3') e Amp3-G2 (sequenza bersaglio: 5'-GGAACGAAAACTCACGTTAA-3'), risultando in una spina dorsale vettoriale pBID-UASC lineare di 7.687 bp. Questi due sgRNA hanno come bersaglio rispettivamente i 5' a monte e i 3' a valle del gene di resistenza all'ampicillina.
    1. Preparare una reazione di scissione da 10 μL contenente 0,03 pmol di pBID-UASC, 0,25 μL di 1,22 μM di S. pyogenes Cas9, 20 ng di f1Ori5-G4, 20 ng di Amp3-G2, 1 μL di tampone 10x Cas9 e acqua ultrapura trattata con DEPC. Incubare a 37 °C per 1 ora.
      NOTA: Il plasmide scisso da Cas9, senza purificazione, è direttamente sottoposto all'assemblaggio di Gibson.
  2. PCR-amplificare il gene di resistenza al cloramfenicolo.
    NOTA: Un gene di resistenza al cloramfenicolo di 840 bp è stato amplificato dal plasmide pMartini-Cam6 mediante PCR utilizzando il f1Ori5-Cam-F (5'-TTACAATTCACTGGCC
    GTCGCGTATGTATGATACATAAGGTT-3') e Amp3-Cam-R (5'-AGTGGAACGAAAACTCAC
    GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3').
    1. Preparare il gene di resistenza al cloramfenicolo mediante PCR amplificando il gene di resistenza al cloramfenicolo di 840 bp. Impostare una reazione PCR da 20 μL contenente 2 μL di pMartini-Cam (0,1 ng/μL), 1 μL di f1Ori5-Cam-F (10 μM), 1 μL di Amp3-Cam-R (10 μM), 4 μL di tampone 5x, 0,4 μL di dNTP (10 mM), 0,4 μL di DNA polimerasi ad alta fedeltà (2,5 unità/μL), 11,2 μL di acqua ultrapura.
    2. Eseguire la PCR utilizzando le seguenti condizioni di termociclo: 1 ciclo a 95 °C per 1 min; 5 cicli di 95 °C per 15 s, 46 °C per 15 s, 72 °C per 20 s; 30 cicli a 95 °C per 15 s, 61 °C per 15 s, 72 °C per 20 s; 1 ciclo a 72 °C per 2 min. Eseguire la reazione in un termociclatore.
    3. Risolvere i prodotti di scissione con gel di agarosio allo 0,8% e purificare un frammento di DNA da 840 bp utilizzando un kit di estrazione su gel.
  3. Inserire il gene di resistenza al cloramfenicolo nella dorsale vettoriale pBID-UASC linearizzata, ottenendo pBIDC-UASC.
    1. Eseguire una reazione di assemblaggio Gibson da 2 μl: 0,008 pmol di gene di resistenza al cloramfenicolo 840 bp, 0,002 pmol del pBID-UASC linearizzato (passaggio 2.1.1), 1,0 μl di 2x miscela master di assemblaggio Gibson. Eseguire la reazione a 50 °C per 1 ora.
    2. Trasformare 10 μL di cellule competenti di E. coli con 1 μL di prodotto della reazione di legatura. Selezionatrici di trasformanti su una piastra LB integrata con 15 μg/mL di cloramfenicolo.
    3. Scegli una singola colonia e sottoponila a successiva coltura batterica e miniprep plasmidica. Verificare il vettore di destinazione contenente cloramfenicolo pBIDC-UASC mediante analisi di restrizione e sequenziamento del DNA.

3. Costruzione di un vettore di destinazione compatibile con CRISPRshuttle

NOTA: Una cassetta CRISPRshuttle comprende circa 20-40 sequenze di backbone vettoriale bp che fiancheggiano entrambe le estremità 5' e 3' dei frammenti di DNA bersaglio, con uno o due siti di restrizione unici situati tra di loro.

  1. Ricottura di oligonucleotidi utilizzando un termociclatore con il seguente programma: 94 °C per 2 min; 70 cicli di 52 s a (95-N) °C, dove N rappresenta il numero del ciclo.
    NOTA: La cassetta CRISPRshuttle ricotto contiene sporgenze di 5' complementari a EcoRI e XbaI.
  2. Collegare la cassetta CRISPRshuttle ricotto al vettore di destinazione digerito EcoRI/XbaI pBIDC-UASC per generare il vettore di destinazione compatibile con CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect.
    NOTA: Questa legatura elimina i siti EcoRI e XbaI originali all'interno dei siti di clonazione multipli, rendendo i siti EcoRI e XhoI al centro della cassetta CRISPRshuttle unici nel vettore finale. Gli esclusivi siti di restrizione nella cassetta CRISPRshuttle consentono la linearizzazione del vettore di destinazione compatibile con CRISPRshuttle.
    1. Preparare una reazione di legatura da 5 μl contenente 14 ng di pBIDC-UASC digerito con EcoRI/XbaI da 8.451 bp, 0,02 pmol della cassetta CRISPRshuttle ricotta, 0,5 μl di tampone DNA ligasi T4 10x, 0,3 μl di DNA ligasi T4. Incubare la reazione per una notte a 16 °C.
    2. Trasformare 10 μL di cellule competenti di E. coli con 1 μL del prodotto della reazione di legatura. Selezionare i trasformanti su una piastra LB integrata con 15 μg/mL di cloramfenicolo e incubare per una notte a 37 °C.
    3. Scegli una singola colonia e sottoponila a successiva coltura batterica e miniprep plasmidica. Verificare il vettore di destinazione compatibile con CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect mediante analisi di restrizione e sequenziamento del DNA.

4. Generazione di plasmidi UAS-cDNA/ORF utilizzando CRISPRshuttle

NOTA: Il protocollo CRISPRshuttle prevede reazioni in provetta in due fasi eseguite in parallelo prima della trasformazione batterica (Figura 1).

  1. Reazione in provetta fase 1
    1. Asportazione di ORF dai plasmidi pLX304-ORF mediante scissione della dorsale vettoriale utilizzando Cas9 in combinazione con due sgRNA, pLX304-CMV-G16 (sequenza bersaglio: 5'-GAGCTCTCTGGCTAACTGTC-3', localizzata nella dorsale vettoriale pLX304 che fiancheggia l'estremità 5' di ORF) e pLX304-3'-G1 (sequenza bersaglio: 5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGCG-3', localizzata nella dorsale vettoriale pLX304 che fiancheggia l'estremità 3' di ORF).
      1. Preparare una miscela master per un dato numero (N) di reazioni di digestione come segue: (N+1) x 0,4 μL di 1,22 μM di S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,5 μL di 80 ng/μL di pLX304-CMV-G1, (N+1) x 0,5 μL di 80 ng/μL pLX304-3'-G1, (N+1) x 0,4 μL di tampone Cas9 10x e (N+1) x 1,45 μL di acqua ultrapura trattata con DEPC.
      2. Mescolare accuratamente e centrifugare il master mix. Aliquotare 3,75 μl della miscela master in ciascuna provetta. Aggiungere 0,75 μL di plasmide pLX304-ORF da 0,03 μM a ciascuna provetta. Mescolare accuratamente e incubare le reazioni a 37 °C per 1 ora.
        NOTA: Diluire ciascun plasmide pLX304-ORF a una concentrazione di 0,03 μM con acqua ultrapura trattata con DEPC. Se la concentrazione è inferiore a 0,03 μM, aggiungere il DNA plasmidico direttamente alla reazione. I plasmidi scissioni di Cas9 non devono essere purificati dopo le reazioni di scissione e possono essere utilizzati direttamente per il successivo assemblaggio di Gibson.
  2. Reazione in provetta fase 2
    1. Inserire gli ORF asportati nel vettore di destinazione compatibile con CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect tramite l'assemblaggio Gibson, ottenendo plasmidi UAS-cDNA/ORF.
      1. Digerire pBIDC-UASC-pLXvect con EcoRI e XbaI. Separare il pBIDC-UASC-pLXvect linearizzato mediante elettroforesi su gel di agarosio e purificare utilizzando un kit di estrazione del gel.
      2. Preparare una miscela master per un dato numero (N) di reazioni di assemblaggio Gibson come segue: (N+1) x 0,14 μL di 3,36 μM linearizzato pBIDC-UASC-pLXvect e (N+1) x 1,8 μL di miscela master di assemblaggio Gibson.
      3. Mescolare accuratamente e centrifugare il master mix. Aliquotare 1,94 μl della miscela master in ciascuna provetta. Aggiungere 1,66 μL di plasmide scisso Cas9 a ciascuna provetta. Mescolare accuratamente e incubare le reazioni a 50 °C per 1 ora.
        NOTA: Mantenere la miscela master e le provette ghiacciate prima dell'incubazione a 50 °C.
  3. Trasforma E. coli con i prodotti di assemblaggio Gibson.
    NOTA: I prodotti dell'assemblaggio Gibson non richiedono la purificazione prima della trasformazione di E. coli .
    1. Scongelare le cellule batteriche competenti sul ghiaccio. Aliquotare 10 μl di cellule in ciascuna provetta prerefrigerata da 1,5 mL.
      NOTA: Si raccomandano cellule batteriche competenti con un'efficienza di trasformazione di almeno 1 × 108 CFU/μg di DNA pUC19.
    2. Miscelare delicatamente 10 μl di cellule competenti con 1 μl di prodotti di assemblaggio Gibson. Mettere sul ghiaccio per 30 min.
    3. Shock termico a 42 °C per 1 min, quindi raffreddare con ghiaccio per 2 min.
    4. Aggiungere 100 μl di terreno SOC preriscaldato (37 °C) in ciascuna provetta. Agitare a 250 giri/min per 1 ora a 37 °C.
    5. Posizionare le cellule su piastre LB contenenti 15 μg/mL di cloramfenicolo. Incubare per una notte a 37 °C.
      NOTA: L'esecuzione di queste procedure su larga scala richiede in genere diverse ore. Salvo diversa indicazione, mantenere sia i reagenti che le impostazioni di reazione sul ghiaccio.
  4. Verifica di plasmidi UAS-cDNA/ORF.
    1. Inoculare una singola colonia in 4,5 mL di terreno LB con 15 μg/mL di cloramfenicolo. Agitare a 250 giri/min per una notte a 37 °C.
    2. Isolare il DNA plasmidico utilizzando un kit di mini-preparazione del plasmide.
    3. Preparare una reazione di digestione di restrizione da 20 μl per ciascun plasmide contenente 300-500 ng di DNA plasmidico, 0,3 μl di PvuII, 2 μl di tampone 10x e acqua ultrapura. Eseguire le reazioni a 37 °C per 1 ora.
    4. Risolve i frammenti di DNA con gel di agarosio allo 0,8%. Immagine sotto luce UV (Figura 3).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo utilizzato CRISPRshuttle per costruire una collezione di plasmidi UAS-cDNA/ORF che copre 1.397 geni umani conservati in Drosophila7. L'analisi delle restrizioni ha rivelato che CRISPRshuttle raggiunge un'efficienza del 94,5% per l'utilizzo di vettori di destinazione compatibili con CRISPRshuttle contenenti due sequenze ripetitive e del 96,1% per l'utilizzo di vettori di destinazione senza sequenze ripetitive7. I nostri dati hanno dimostrato che generalmente...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un passaggio critico nel protocollo CRISPRshuttle è la preparazione di vettori di destinazione linearizzati compatibili con CRISPRshuttle. Per garantire una digestione completa, utilizzare un eccesso di enzimi di restrizione per digerire i vettori e si raccomanda vivamente la purificazione con gel dei vettori digeriti. Un altro passaggio cruciale è la digestione dei plasmidi cDNA/ORF con Cas9. Se la costruzione del plasmide fallisce, utilizzare l'elettroforesi su gel di agarosio per veri...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è stato supportato da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (32071135) e da un fondo di avvio dell'Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China. Siamo grati al Prof. Feng Zhang per aver gentilmente fornito il plasmide pX330 e al Dr. Xiaohui Cai per l'assistenza tecnica.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Polvere di agarBase chimicaKBS-001H
AgarosioSangonA600014-0100
Sistema automatizzato di analisi digitale delle immagini su gelTanonTanon-2500B
CloramfenicoloSangonA100230-0010
Kit di estrazione del gel E.Z.N.A.OmegaD2500-02
Mini kit di DNA plasmidico E.Z.N.A. IOmegaD6942-02
EcoRI-HFNEBR3101S
Assemblaggio Gibson Master MixNEBE2611S
Kit di sintesi rapida di RNA ad alto rendimento HiScribe T7NEBE2050
NEBuilder HiFi DNA Assemblaggio Master MixNEBE2621X
Termociclatore PCRGene lungoT20
Platino SuperFi II DNA polimerasiTermo Scientifico12361010
PvuII-HFNEBR3151L
Q5 Hot Start ad alta fedeltà 2x Master MixNEBCodice: M0494
S. pyogenes Cas9Script GenScriptZ03386
Incubatrice a scuotimentoZhichuZQLY-180V
SpettrofotometroShimadzuBioSpec-nano
T4 DNA ligasiPromegaMotore M1801
Trans 10 Cellula Chimicamente CompetenteTransGenCD101-02
TriptoneOssoideLP0042
XbaINEBR0145S
Estratto di lievitoOssoideLP0021

References

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