Clonazione shuttle basata su CRISPR: un metodo di clonazione ad alto rendimento

Xiaoxue Li; Yutian Peng; Wen Xue; Xuelian Liu; Si Luo; Ping Wei; Jiwu Wang

doi:10.3791/68503

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Articolo metodologico

Clonazione shuttle basata su CRISPR: un metodo di clonazione ad alto rendimento

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DOI:

10.3791/68503

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13 giugno 2025

Xiaoxue Li^*¹^,² , Yutian Peng^*²^,³ , Wen Xue² , Xuelian Liu² , Si Luo⁴ , Ping Wei⁴ , Jiwu Wang²

¹Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, ²Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ³Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ⁴Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un protocollo per un metodo di clonaggio ad alto rendimento, il clonaggio shuttle basato su CRISPR (CRISPRshuttle cloning), che consente il trasferimento di frammenti di DNA di interesse tra vettori senza la necessità di amplificazione PCR dei frammenti di DNA.

Abstract

Lo sviluppo di librerie di plasmidi a livello di genoma utilizzando i repository genomici esistenti costituisce un prerequisito fondamentale per la caratterizzazione funzionale sistematica dei geni in diversi processi biologici. Le attuali metodologie ad alto rendimento per il trasferimento di frammenti di DNA intervettoriali, tuttavia, richiedono l'amplificazione PCR delle sequenze bersaglio prima del clonaggio, rendendo la generazione di collezioni di plasmidi su scala genomica tecnicamente impegnativa e dispendiosa in termini di tempo. Sfruttando una cassetta CRISPRshuttle, abbiamo sviluppato un nuovo metodo di clonazione ad alto rendimento, il clonaggio shuttle basato su CRISPR (clonazione CRISPRshuttle), che facilita il trasferimento di molti frammenti di DNA da plasmidi donatori che condividono sequenze di backbone identiche a un vettore compatibile con CRISPRshuttle senza amplificazione PCR dei frammenti di DNA. Qui presentiamo un protocollo per CRISPRshuttle. Questo protocollo prevede due reazioni sequenziali in provetta prima della trasformazione batterica. In primo luogo, i frammenti di DNA bersaglio vengono asportati dai plasmidi donatori mediante scissione mediata da Cas9 della loro sequenza di scheletro vettoriale condivisa. In secondo luogo, i frammenti di DNA asportati vengono inseriti in vettori linearizzati compatibili con CRISPRshuttle attraverso l'assemblaggio di Gibson. I nostri risultati dimostrano che l'efficienza di CRISPRshuttle supera il 94% e che due ricercatori possono generare circa 300 plasmidi in 7 giorni utilizzando CRISPRshuttle. CRISPRshuttle facilita il trasferimento efficiente, adattabile ed economico di frammenti di DNA tra vettori, semplificando significativamente la generazione di librerie plasmidiche a livello di genoma.

Introduzione

La costruzione di librerie di plasmidi a livello di genoma a partire dalle risorse disponibili è la base e il prerequisito per l'impiego della genomica funzionale per sezionare i processi biologici. Gli attuali metodi di clonazione ad alto rendimento, inclusi i sistemi di clonazione Gateway, In-Fusion, Creator e Univector, richiedono l'amplificazione PCR dei frammenti di DNA target 1,2,3,4,5. Questo prerequisito comporta flussi di lavoro di elaborazione specifici per framme....