Articolo metodologico

In vivo Biotinilazione di prossimità per studi di interazione proteica in Paramecium tetraurelia

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DOI:

10.3791/68504

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12 settembre 2025

 ,  ,  , 
1Institute of Cell Biology, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

In questo articolo

Sommario

Il protocollo presenta un metodo per l'attaccamento covalente in vivo della biotina alle proteine in base alla loro vicinanza a una biotina ligasi fusa a una proteina di interesse. Questa modifica consente un arricchimento selettivo delle proteine utilizzando perle di streptavidina come necessario negli studi di interazione proteica.

Abstract

Il paramecio è un importante organismo modello per lo studio dei meccanismi molecolari coinvolti nei riarrangiamenti genomici programmati e nell'eliminazione dei trasposoni durante la riproduzione meiotica. Molti dettagli di questo processo rimangono enigmatici a causa della complessità del meccanismo molecolare coinvolto e delle interazioni transitorie proteina-proteina. Qui, presentiamo un metodo per la marcatura risolta nel tempo di proteine con biotina situata vicino a una proteina bersaglio di interesse. Il metodo può essere facilmente adattato a diversi bersagli poiché la biotinilazione si ottiene mediante iniezione di un DNA che codifica per una proteina bersaglio fusa a una biotina ligasi ingegnerizzata. Il costrutto di fusione è espresso dal promotore del gene endogeno, consentendo un profilo di espressione stadio-specifico simile a quello della proteina nativa. In particolare, la porzione di biotina attaccata in modo covalente consente l'arricchimento selettivo delle proteine marcate utilizzando perle rivestite di streptavidina. Inoltre, con la colorazione in immunofluorescenza, dimostriamo che una marcatura efficiente richiede l'integrazione della coltura con biotina. Il vettore di espressione ingegnerizzato plug-and-play, combinato con l'efficiente procedura di iniezione qui dimostrata, consente la rapida generazione di linee di Paramecium che esprimono una proteina modificata. La procedura di biotinilazione qui dimostrata può essere seguita dalla spettrometria di massa per l'identificazione delle proteine arricchite che contengono i partner interagenti della proteina bersaglio. La biotinilazione di prossimità ha il potenziale per semplificare e accelerare la scoperta delle interazioni proteina-proteina nel Paramecium e aumentare gli sforzi per comprendere il suo meccanismo di editing genomico.

Introduzione

L'organismo unicellulare ciliato Paramecium tetraurelia ospita due tipi distinti di nuclei: un nucleo germinale per la memorizzazione a lungo termine dell'informazione genetica e un nucleo somatico per le funzioni fisiologiche della cellula1. La riproduzione sessuale in questo organismo richiede la formazione di un nuovo genoma somatico. Questo processo include l'escissione irreversibile di oltre 45.000 frammenti di DNA dal genoma somatico2 che includono elementi trasponibili3 e altre ripetizioni. Particolarmente sorprendente è il fatto che gli eventi di escissione vengono eseguiti con una precisione fino alla singola coppia di basi1. Questa accuratezza è biologicamente necessaria, poiché i frammenti di DNA asportati interrompono le regioni codificanti le proteine4 e qualsiasi escissione difettosa potrebbe evocare mutazioni frameshift, codoni di stop prematuri o alterare la sequenza codificante delle proteine. Un intricato meccanismo di confronto dell'RNA consente alla cellula di differenziare le sequenze necessarie nel nuovo genoma somatico. Viene avviato con la trascrizione dell'intero genoma germinale5, seguita dal taglio a una dimensione di 25 bp6, dal trasporto al vecchio genoma somatico7, dove tutti gli RNA complementari vengono scartati8. Gli sRNA rimanenti che mancano di sequenze complementari nel vecchio genoma somatico vengono ulteriormente trasportati al nuovo genoma somatico in via di sviluppo, dove si allineano a qualsiasi sequenza germinale limitata e dirigono la loro escissione9. Questo complesso processo a più fasi richiede un'interazione precisa e tempestiva di molti componenti cellulari e, in particolare, interazioni deboli transitorie mentre i piccoli RNA transitano tra i diversi nuclei10,11. In precedenza, i tentativi di comprendere la meccanica molecolare del processo sono stati fatti utilizzando esperimenti di knockdown per determinare se i componenti putativi sono essenziali per il processo, seguiti da approcci di immunoprecipitazione per scoprire le interazioni delle proteine essenziali 12,13,14. Sebbene questo metodo sia utile per il rilevamento di legami forti e continui che sopportano anche le condizioni non fisiologiche durante il pulldown, il rilevamento di interazioni deboli e transitorie può richiedere un'ottimizzazione noiosa. A causa della natura potenzialmente transitoria di molte interazioni coinvolte nel processo di editing del genoma, i metodi in vivo potrebbero migliorare il rilevamento di tali interazioni. Inoltre, alcune proteine non possono essere solubilizzate in modo efficiente in condizioni extracellulari15, il che rappresenta un problema che può essere risolto attraverso modifiche proteiche basate sull'interazione in vivo, come la marcatura di prossimità con biotina.

Qui, descriviamo un nuovo metodo che consente una biotinilazione specifica in vivo di proteine localizzate vicino alla proteina bersaglio desiderata. La modifica covalente della biotina può essere utilizzata per un arricchimento efficiente utilizzando approcci di pulldown basati su streptavidina. Lo sviluppo di questo metodo è stato ottenuto utilizzando la biotina ligasi TurboID16 per eseguire studi di interazione proteica in Paramecium tetraurelia. Il nostro approccio può essere facilmente applicato a qualsiasi proteina bersaglio seguendo i passaggi descritti nel protocollo. Pertanto, questo articolo fornisce una strategia efficiente e scalabile per la biotinilazione di prossimità che può essere utilizzata per studi di proteomica ad alto rendimento in un importante organismo modello di protozoi.

Protocollo

1. Metodi generali

  1. Procurarsi tamponi, reagenti e altri materiali come elencato nella Tabella 1.
  2. Coltivare linee monoclonali di Paramecium come descritto in precedenza17. In breve, trasferire una cellula in un nuovo pozzetto di scivolo di depressione che contenga un terreno leggero batterizzato (0,8 μg/mL di β-sitosterolo) in modo che la densità cellulare rimanga inferiore a 500 cellule/mL, per prevenire l'inizio prematuro del ciclo meiotico. A 50 divisioni cellulari, trasferire le cellule in un terreno ricco di colture batterizzate (con 0,8 μg/mL di β-sitosterolo) e lasciarle fino a quando tutti i batteri non sono stati consumati, inducendo così la riproduzione sessuale (autogamia)18.
    NOTA: Al termine del ciclo di riproduzione sessuale, le cellule rimarranno in uno stato postautogamico non divisore fino a quando non verrà fornita una nuova fonte di nutrienti.
  3. Costruire proteine di fusione dei geni bersaglio utilizzando un vettore contenente una sequenza turboID 3x HA ottimizzata per il codone con siti di taglio dell'enzima di restrizione a monte.
    1. Eseguire l'amplificazione PCR del gene bersaglio e della sua regione promotrice dal DNA genomico, utilizzando primer progettati con sporgenze che codificano siti di restrizione adeguati.
    2. Inserire il prodotto utilizzando la digestione di restrizione standard nei siti di taglio compatibili con il telaio19 a monte delle regioni di codifica turboID.
  4. Sezionare, verificare e amplificare il DNA plasmidico costruito in E.coli DH5α. Isolare il plasmide utilizzando un kit midiprep plasmidico e linearizzare 100 μg di DNA plasmidico mediante digestione di restrizione.
  5. Purificare mediante estrazione fenolo-cloroformio, quindi filtrare attraverso un filtro centrifugo12. Eseguire la precipitazione dell'etanolo e sciogliere il pellet di DNA in acqua per ottenere una concentrazione di 5 mg/mL.
    NOTA: Il DNA può essere introdotto nei nuclei somatici delle cellule di Paramecium utilizzando la seguente procedura di microiniezione.

2. Microiniezione nel nucleo somatico (MAC)

  1. Trasferire una cellula dalla coltura postautogama ottenuta nella fase 1.2 ad un vetrino a depressione fresco con terreno leggero batterizzato con 0,8 μg/mL di β-sitosterolo. Incubare a 27 °C per due giorni prima dell'iniezione per recuperare le cellule.
  2. Utilizzare uno stereomicroscopio per trasferire le cellule dalla coltura recuperata a un vetrino di depressione appena preparato riempito con il mezzo di lavaggio.
  3. Mentre le celle si trovano nel mezzo di lavaggio, aggiungere 20 μL di ddH2O su un vetrino di vetro e sovrapporle con un vetro di copertura.
  4. Aggiungere 200 μl di olio minerale sopra il vetro di copertura.
  5. Successivamente, trasferire le singole cellule lavate sotto le goccioline sotto l'olio minerale utilizzando il minor volume di liquido possibile. Posizionare fino a 20 bolle contenenti una singola cellula per vetrino e quindi posizionare il vetrino preparato sul piedistallo del microscopio per iniezioni.
  6. Collegare l'ago di aspirazione e spostarlo in posizione, quindi avviare il braccio robotico e la macchina per iniezione.
  7. Utilizzando un puntale per pipetta microloader, aggiungere 2-3 μL della soluzione di DNA preparata al punto 1.5 nell'ago per iniezione. Collegare l'ago al braccio robotico e spostarlo in posizione, quindi collegarlo alla valvola di pressione della macchina per iniezione.
  8. Utilizzare il braccio robotico per posizionare l'ago di iniezione in una goccia d'acqua vuota sul vetrino. Quindi premere Clean per eliminare l'aria residua nell'ago per iniezione fino a quando non si osserva il flusso di DNA.
  9. Passa a una gocciolina che contiene una cellula, quindi abbassa l'ago di aspirazione. Rimuovere delicatamente il liquido (acqua) da questa gocciolina fino a quando la cella non è immobilizzata.
  10. Sollevare l'ago di aspirazione e abbassare l'ago di iniezione, quindi passare a un ingrandimento maggiore.
  11. Assicurarsi che il nucleo somatico (MAC) sia ora visibile come una regione più scura priva di vacuoli alimentari (vedere Figura 1c) in cui deve essere inserito l'ago per iniezione.
  12. Cercare di penetrare completamente il MAC con l'ago per iniezione e ritrarre lentamente l'ago per alcuni secondi.
    NOTA: Quando l'ago si trova all'interno del MAC, il DNA fluirà nel MAC a causa della costante pressione dell'aria applicata dalla macchina per iniezione. Un vacuolo diffuso costituito dal DNA iniettato potrebbe diventare visibile all'interno dei confini del MAC.
    NOTA: È possibile iniettare la stessa cella più volte per garantire una corretta iniezione.
  13. Al termine dell'iniezione della cellula, abbassare l'ago di aspirazione contenente l'acqua aspirata al punto 2.9. Invertire il flusso per restituire abbastanza acqua alla gocciolina fino a quando la cella non ricomincia a muoversi.
  14. Continuare fino a quando tutte le goccioline che contengono una cella sono state elaborate.
  15. Recuperare ogni cellula iniettata raccogliendo le goccioline dal vetrino e trasferendo ciascuna di esse in un pozzetto separato riempito con terreno leggero batterizzato, con 0,8 μg/mL di β-sitosterolo.
  16. Incubare a 27 °C per una notte, trasferire una singola cella da ciascun pozzetto in un nuovo pozzetto e mantenere il pozzetto originale a 18 °C come backup.
  17. Coltivare le cellule trasferite durante una notte a 27 °C per 1 giorno e quindi trasferire 5 cellule da ciascun pozzetto monoclonale in una provetta per PCR. Utilizzare primer specifici per il costrutto per l'amplificazione per verificare la presenza del DNA iniettato nelle cellule.

3. Colorazione in immunofluorescenza per la verifica della corretta localizzazione proteica e della funzione della biotina ligasi

  1. Coltura dei cloni positivi alla PCR selezionati in 20 mL di terreno batterizzato con 0,8 μg/mL di β-sitosterolo.
  2. Dopo che il terreno è diventato meno torbido, prelevare un campione da 50 μl dalla coltura. Aggiungere 1 μL di soluzione DAPI (0,1 mg/mL) e 1 μL di EDTA (0,5 mM) per la colorazione del DNA per verificare l'inizio dell'autogamia.
    NOTA: L'autogamia di solito inizia con una densità cellulare di 2.000 cellule/mL.
  3. Se si desidera la biotinilazione, integrare il terreno di coltura con biotina a una concentrazione finale di 500 μM per almeno 1 ora prima di prelevare le cellule.
  4. Raccogliere le cellule allo stadio di sviluppo appropriato utilizzando una centrifuga per la misurazione dell'olio dotata di provette a forma di pera a 280 x g per 2 minuti. Scartare il terreno di coltura e aggiungere il PBS alle provette, quindi centrifugare nuovamente e rimuovere il PBS.
  5. Risospendere il pellet cellulare in PBS e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga trasparente da 1,5 mL.
  6. Preparare una diluizione di PFA al 3,7% in PBS dalla soluzione madre al 37%.
  7. Risospendere il pellet cellulare in 0,5 mL di PFA al 3,7% e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su un rotatore di provette.
  8. Centrifugare a 600 x g per 1 minuto fino a quando non si forma un pellet visibile. Gettare la soluzione di PFA nell'apposito contenitore per rifiuti speciali.
  9. Risospendere il pellet in 1 mL di 50 mM di glicina in PBS. Incubare per 5-10 minuti su un rotatore di provette.
  10. Centrifugare a 600 x g per 1 min. Rimuovere il surnatante e aggiungere 0,8 ml di 1x PBS. Facoltativamente, lavare ancora una volta con PBS.
    NOTA: A questo punto, le celle possono essere conservate a 4 °C, se necessario.
  11. Centrifugare a 600 x g per 1 minuto, rimuovere il PBS e aggiungere 500 μl di Triton X-100 allo 0,5% in PBS. Incubare per 20 minuti su un rotatore di provette.
  12. Centrifugare fino a quando il pellet diventa visibile (1.000 x g per 2 minuti), rimuovere la soluzione di Triton X-100 e risospendere le cellule in PBS.
  13. Preparare una soluzione di BSA al 5% in PBS in base al volume di anticorpi richiesto.
  14. Rimuovere il lavaggio PBS dalle cellule e aggiungere alle cellule 100 μl dell'anticorpo primario diluito in BSA al 5% in PBS. Regolare il tempo di incubazione in base all'anticorpo utilizzato.
    NOTA: L'incubazione per 2 ore a temperatura ambiente è sufficiente per la maggior parte degli anticorpi.
  15. Centrifugare a 600 x g, rimuovere la diluizione dell'anticorpo primario e lavare le cellule con 500 μL di PBS.
  16. Aggiungere 100 μl dell'anticorpo secondario diluito in BSA al 5% in PBS. Regolare il tempo di incubazione; In genere, 1 ora a temperatura ambiente è sufficiente. Coprire il tubo con un foglio di alluminio per proteggere il fluoroforo dalla luce.
  17. Aggiungere 1 μL di soluzione DAPI (0,1 mg/mL) durante gli ultimi 10 minuti di incubazione con l'anticorpo secondario.
  18. Centrifugare a 600 x g per 1 minuto, rimuovere la soluzione colorante e lavare due volte con PBS. Lasciare 20 μl del secondo lavaggio nella provetta e risospendere le cellule.
  19. Montare 10 μl su un vetrino per l'ispezione al microscopio.

4. Arricchimento selettivo di proteine biotinilate

  1. Raccogliere 1 x 106 cellule nella corretta fase di sviluppo come descritto al punto 3.4.
  2. Risospendere il pellet in 3 mL di tampone di lisi.
  3. Trasferire in un omogeneizzatore a balze e lisare le cellule con 100 colpi di pestello.
  4. Trasferire il lisato in due provette da microcentrifuga e centrifugare a 21.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
  5. Equilibrare le microsfere magnetiche rivestite di streptavidina mescolando 20 μL (per campione) di impasto-vortice di perle risospese con 1 mL di tampone di lisi in una provetta per microcentrifuga e incubando per 2 minuti.
  6. Rimuovere il tampone di lisi dalle perle utilizzando un supporto magnetico e risospendere nel tampone di lisi.
  7. Ripetere il passaggio 4.6.
  8. Rimuovere il tampone di lisi e mescolare le perle equilibrate con il surnatante (lisato chiarificato) del passaggio 4.4.
    NOTA: Le concentrazioni ottimali di sale e la percentuale di detergenti per il legame alle perle possono differire e devono essere convalidate sperimentalmente. Inoltre, è possibile incubare il pellet da 4,4 in 50 μL di SDS al 2% per 10 minuti a 60 °C per estrarre le proteine dalla frazione insolubile, seguita da centrifugazione a 21.000 x g per 10 minuti. Aggiungere questo estratto al lisato chiarificato e alle perline.
  9. Incubare per 1-2 ore a temperatura ambiente su un rotatore di provette.
  10. Centrifugare brevemente (<1s) la provetta per recuperare tutto il liquido sul fondo della provetta, raccogliere le perle su un supporto magnetico, quindi sostituire il surnatante (flowthrough) con il tampone di lavaggio 1.
  11. Incubare per 5 minuti su un rotatore di provette e poi ripetere come al punto 4.10 per un secondo lavaggio.
  12. Sostituire il tampone di lavaggio 1 con il tampone di lavaggio 2 con due lavaggi aggiuntivi (lavaggio 3 e 4).
  13. Sostituire il tampone di lavaggio 2 con il tampone di lavaggio 3 per due lavaggi finali (lavaggio 5 e 6).
  14. Dopo aver rimosso il lavaggio finale, conservare le perle a -20 °C prima della lavorazione a valle.
    NOTA: Le microsfere possono essere eluite con tampone Laemmli per l'analisi del western blot e sottoposte a servizi di spettrometria di massa per una preparazione peptidica su perlina per l'identificazione delle proteine.

Risultati

Il nostro protocollo descrive un metodo semplificato per l'introduzione di una modifica covalente della biotina nelle proteine in prossimità di una proteina bersaglio in Paramecium (Figura 1A). Queste proteine biotinilate possono quindi essere ulteriormente arricchite utilizzando un pulldown della streptavidina e identificate mediante spettrometria di massa20. Per dimostrare un caso d'uso pratico del metodo, abbiamo applicato il protocollo alla proteina Nowa1. Questa proteina è essenziale per il processo di riarrangiamento genomico e presenta alterazioni dinamiche nella sua localizzazione12. Nelle fasi iniziali, rimane nel vecchio nucleo somatico e nei frammenti, ma in seguito si trova nel nuovo nucleo in via di sviluppo. In particolare, i nostri precedenti tentativi di arricchimento mediato da tag delle proteine interagenti Nowa1 non hanno avuto successo (risultati non pubblicati). Ciò era probabilmente dovuto alle complesse ripetizioni somiglianti alla proteina prionica PrP27 che potevano causare l'autoaggregazione in condizioni non ottimali durante la procedura di pulldown21. La PCR ha amplificato la regione codificante Nowa1 insieme alla sua regione non codificante a monte contenente il promotore. Il prodotto è stato quindi inserito in un frame con una sequenza di codifica turboID ottimizzata per il codone (Figura 1B). Per evitare il silenziamento indotto dal transgene causato dall'iniezione di DNA circolare in Paramecium, il vettore è stato linearizzato prima dell'iniezione. Il DNA linearizzato e purificato è stato quindi microiniettato nel nucleo somatico (MAC) come descritto in questo protocollo. Una gocciolina dispersa confinata all'interno della regione più scura del nucleo somatico è diventata visibile in alcune delle iniezioni riuscite (Figura 1C). Il successo dell'iniezione e l'amplificazione del DNA da parte delle cellule durante la divisione cellulare sono stati quindi verificati mediante PCR. Come previsto, il 40-50% delle cellule era positivo per il DNA iniettato del costrutto Nowa1 (dimensione prevista del prodotto 685 bp) (Figura 2). Il passo successivo è stato quello di verificare la presenza della proteina codificata dal DNA iniettato. Poiché il vettore ricevente contiene la sequenza turboID affiancata da un triplo tag HA, abbiamo utilizzato la colorazione in immunofluorescenza per rilevare il tag. Questo ci ha permesso di verificare se le cellule iniettate esprimono la proteina di fusione e se è stata localizzata correttamente. Abbiamo utilizzato cellule in stadio avanzato che mostravano la localizzazione della proteina di fusione nei due nuovi nuclei in via di sviluppo, come precedentemente osservato per la proteina Nowa1 wild-type12. Le singole linee cellulari iniettate hanno mostrato livelli diversi della proteina di fusione (Figura 3). Un livello di espressione più basso può essere utile per le applicazioni in cui è desiderabile uno sfondo ridotto, ma in questo caso abbiamo optato per il segnale massimo e abbiamo proceduto con il clone 2, che ha mostrato l'espressione più alta. Abbiamo quindi raccolto campioni durante le diverse fasi di sviluppo per tracciare la localizzazione della proteina di fusione. La proteina è stata inizialmente localizzata nelle matasse formate dal vecchio nucleo somatico e nei frammenti nucleari separati durante le prime fasi dell'autogamia. Dopo la comparsa dell'anlageno nucleare, la proteina di fusione è passata verso questi nuovi nuclei in via di sviluppo (Figura 4). Per favorire la biotinilazione del proteoma prossimale nelle diverse fasi, abbiamo integrato la coltura con 500 μM di biotina per 2 ore prima di raccogliere le cellule per IF. Abbiamo visualizzato le proteine marcate con biotina tramite una colorazione IF utilizzando una streptavidina marcata in fluorescenza. Il segnale osservato corrispondeva alla localizzazione della proteina di fusione marcata con HA. È importante sottolineare che è stato possibile ottenere una localizzazione della biotinilazione specifica per le diverse fasi di sviluppo nucleare, poiché anche una breve incubazione con biotina è sufficiente per ottenere una biotinilazione significativa (Figura 4). Inoltre, senza l'aggiunta di biotina supplementare, nelle cellule iniettate era rilevabile solo una biotinilazione trascurabile. Nelle cellule wild-type, l'aggiunta di biotina supplementare non ha causato biotinilazione rilevabile (Figura 5A). In particolare, la biotina non si stava semplicemente accumulando nel nucleo in via di sviluppo, poiché anche in condizioni di denaturazione, rimane attaccata alle proteine. (Figura 5B). Utilizzando perle magnetiche rivestite di streptavidina, è stato possibile arricchire selettivamente le proteine biotinilate (Figura 6). Le proteine arricchite possono essere identificate utilizzando la spettrometria di massa. In questi successivi esperimenti di identificazione delle proteine, la coltura non integrata, così come le cellule che esprimono una proteina turboID non fusa, possono essere utilizzate come gruppi di controllo di fondo.

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Figura 1: Panoramica della procedura per la biotinilazione di prossimità in P. tetraurelia. (A) Schema generalizzato del protocollo. (B) Principio di clonaggio per il vettore ricevente turboID plug-and-play e il costrutto risultante per la proteina di fusione Nowa1. La regione 3'UTR utilizzata in questo plasmide è derivata da CenH3a. (C) Gocciolina diffusa visibile contenuta all'interno dell'area più scura corrispondente al nucleo somatico (MAC) dopo un'iniezione riuscita di DNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Test PCR per iniezione riuscita. Analisi su gel di agarosio della reazione PCR per un prodotto con un primer diretto specifico per la regione a monte che codifica per la resistenza all'ampicillina (amp start) e un primer inverso complementare a Nowa1. La punta della freccia mostra le dimensioni previste del prodotto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Colorazione in immunofluorescenza per convalidare la corretta localizzazione della proteina di fusione turboID. Colorazione in immunofluorescenza utilizzando anticorpo primario coniglio-anti-HA (1:100) e anticorpo secondario coniugato capra-anti-coniglio Alexa Fluor 568 (1:1000) di linee monoclonali di Paramecium con un segnale PCR positivo per il DNA che codifica per una proteina di fusione Nowa1-HA-turboID. Scala 20 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Biotinilazione specifica di Nowa1 in diversi stadi di sviluppo. Colorazione in immunofluorescenza della linea monoclonale 2 in fasi progressive durante la formazione del nuovo nucleo somatico. Il terreno di coltura è stato integrato con 500 μM di biotina per un'attività turboID ottimale. L'HA-tag è stato rilevato come nella Figura 3 e la biotina è stata rilevata utilizzando la streptavidina-FITC (1:200). Scala 20 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: L'efficiente marcatura di prossimità mediante turboID richiede biotina supplementare nella coltura. (A) Colorazione in immunofluorescenza di cellule wt e iniettate nella fase avanzata di sviluppo che mostra l'espressione di Nowa1-HA-turboID e la biotinilazione osservata con 500 μM di biotina supplementare. L'HA-tag e la biotina sono stati rilevati come nella Figura 4. Scala 20 μm. (B) Analisi Western blot per la biotina utilizzando HRP-streptavidina di cellule wt coltivate con 500 μM di biotina e cellule iniettate con turboID con e senza biotina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Arricchimento di proteine biotinilate con perline magnetiche di streptavidina. Analisi Western blot per la biotina di campioni provenienti da un esperimento di pulldown utilizzando perle magnetiche rivestite di streptavidina. I campioni sono: Nowa1-HA-turboID lisato cellulare (input), la frazione non legata (flowthrough), le fasi di lavaggio (wash 1-6) e le proteine legate alle perle (output). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo qui presentato descrive una tecnica per legare una porzione di biotina alle proteine in prossimità della proteina di interesse. Basato sulla forte affinità della streptavidina per la biotina, ciò consente un arricchimento rapido ed efficiente delle proteine modificate. In combinazione con la rapida adattabilità per diverse proteine di interesse, il metodo presentato può facilitare lo studio delle interazioni multiproteiche nel Paramecium. Questo organismo modello è ben consolidato per la ricerca sulle interazioni trasposone-ospite durante la riproduzione meiotica3. Inoltre, potrebbe offrire nuovi strumenti molecolari per l'editing preciso del genoma, asportando più di 45.000 sequenze durante i suoi riarrangiamenti genomici programmati. Il processo è orchestrato da un complesso macchinario multicomponente che consente un'escissione precisa di questi frammenti di DNA diretta dall'RNA con un sito di scissione riproducibile ad ogni generazione. Il metodo qui presentato offre due principali vantaggi per lo studio di questo processo. Semplifica la scoperta di interazioni proteina-proteina transitorie. Inoltre, il vettore ricevente plug-and-play consente la creazione rapida di molte proteine di fusione funzionali. Poiché è probabile che più fattori siano coinvolti nel processo in fasi diverse, l'adattabilità consente la scoperta degli interattomi di molte proteine che potrebbero far parte del meccanismo di escissione. È importante sottolineare che i costrutti di fusione sono espressi dal promotore del gene endogeno e, quindi, corrispondono strettamente all'andamento temporale dell'espressione nativa. Inoltre, l'uso dimostrato della microiniezione per la consegna di materiale genetico esogeno a questo organismo modello consente la generazione di popolazioni monoclonali omogenee. Tali popolazioni consentono un avvio più sincrono del processo di autogamia, durante il quale avviene lo sviluppo di un nuovo nucleo somatico.

Sebbene la procedura dimostrata per l'introduzione dei costrutti di fusione turboID sia robusta, potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione specifica nei protocolli di arricchimento proteico a valle, a causa del meccanismo di biotinilazione. Poiché l'enzima turboID fuso genera porzioni reattive di biotina-AMP che si diffondono lontano dall'enzima, queste possono potenzialmente reagire con qualsiasi porzione nucleofila nelle vicinanze. Pertanto, un passo essenziale in questa metodologia è l'identificazione dei veri partner di interazione dai colpi di fondo e dalle proteine localizzate nelle vicinanze generali della proteina di fusione turboID, che non sono i veri partner di interazione. Per raggiungere questo obiettivo, è possibile regolare una variazione di parametri, come la durata dell'incubazione con la biotina16. Inoltre, una configurazione sperimentale che include un gruppo di controllo senza biotina supplementare nel terreno potrebbe indicare il legame di fondo. Come dimostrato, tale gruppo di controllo sarà geneticamente identico all'esperimento reale, ma la biotinilazione da parte di turboID è fortemente ridotta a causa della bassa abbondanza di biotina. Altri importanti gruppi di controllo potrebbero includere una proteina turboID non fusa, così come un gruppo wild-type, entrambi coltivati nel terreno integrato con biotina. Inoltre, anche se la forte affinità della streptavidina per la biotina è un vantaggio significativo rispetto ai pulldown basati su anticorpi, è probabile che diverse concentrazioni di sale e detergente abbiano un'influenza sulla purezza e sull'efficienza dell'arricchimento.

Approcci proteomici superiori potrebbero migliorare la nostra comprensione dei macchinari molecolari unici del Paramecio e, potenzialmente, di altri ciliati. I componenti molecolari con nuove funzioni promettono di essere riutilizzati come strumenti nella biologia sintetica e potrebbero quindi favorire gli sviluppi biotecnologici22,23. Le proteine sintetiche ingegnerizzate sono spesso costituite da combinazioni di domini funzionali con nuove proprietà che consentono applicazioni terapeutiche precedentemente impraticabili. Le proteine ingegnerizzate possono trovare impiego anche nei processi di produzione farmaceutica24. Il sistema di escissione del genoma diretto dall'RNA dal Paramecium è di particolare interesse per tali sviluppi. Questo sistema consente l'escissione RNA-dipendente di migliaia di frammenti di DNA, con una precisione fino al singolo nucleotide25. Tali parametri rendono interessante migliorare l'accuratezza dell'editing del genoma nelle cellule umane. Il metodo di biotinilazione di prossimità presentato può essere utilizzato per accelerare e promuovere la scoperta di nuovi componenti proteici e le loro interazioni all'interno di macchine molecolari multiproteiche.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione DigiK dell'Università di Berna e da una sovvenzione del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica 229074 assegnata a B.-A.S. e la sovvenzione del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica 214853 assegnata a M.N.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microscopio Axiovert 40 CFL (lenti 10x, 40x)ZeissNa
B-sitosteroloSigma Aldrich567152
albumina sierica bovina (BSA)Sigma AldrichCodice: A9647
Olio CellTramEpendorfNa
Sequenza di DNA 3xHA-turboID ottimizzata per il codoneTwist bioscienceNaGCTAGCTATCCATAcGAaGTTC
CTGATTATGCTTATCCTTACGAT
GTTCCTGATTATGCTTATCCTTAT
GATGTACCTGATTACGCTGGATC
AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA
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DAPISigma AldrichD9542
EDTAFischer ScientificAAA151610B
Punte per microloader epT.I.P.S.Ependorf5242956003
EtanoloGrogg Chemie1009832500
FemtoJet 4iEpendorfNa
Femtopunta IICalibro Scientifico5242957000
Soluzione di formaldeideSigma AldrichF8775
GlicinaAppliChem10021259
Anticorpo IgG anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 568Thermo Fischer ScientificA-11011
HA-tag (C29F4) mAB per coniglisistemi cellulari3724
InjectMan NI 2EpendorfNa
medio leggeroNaNa0,2x soluzione di polvere di erba di grano in 2,5 mM di Na2HPO4
Olio mineraleSigma AldrichCodice: M8691
Na2HPO4Sigma Aldrich71643
Fenolo-Cloroformio-IsoamilalkoholSigma Aldrich77617
soluzione salina tamponata con fosforo Fischer Scientific10722497
Kit plasmide più midiprepQiagene12945
Ricco di terrenoNaNa1x soluzione di polvere di erba di grano in 2,5 mM di Na2HPO4
Streptavidina-FITCThermo Fisher Scientifico11-4317-87
Filtro centrifugo Ultrafree-MC GVEMD MiliporeUFC30GV00
soluzione di lavaggioNaNa0,1% BSA in acqua volvica 
soluzione di polvere di erba di granoPini internazionaliNaPreparare in 20 volte il brodo dalla polvere come descritto in precedenza (0,5 g/10 ml)
Streptavidina-HRPabcamAB7403
Perle magnatiche rivestite di streptavidinaSigma AldrichLSKMAGT02
Tampone di lisi per pulldownNaNa50 mM Tris pH 8; 150 mM di NaCl; 0,5% Sodio desossicolato; 1% Triton X-100; 5 mM di MgCl2; 2x inibitore della proteasi cOmplete (Roche);  
Tampone di lavaggio 1 per pulldownNaNa50 mM Tris pH 8; 150 mM di NaCl; 0,5% Sodio desossicolato; 1% Triton X-100; 5 mM di MgCl2;
Tampone di lavaggio 2 per pulldownNaNa10 mM Tris pH 7,4; 150 mM di NaCl; 0,01 % NP40; 1 mM di MgCl2
Tampone di lavaggio 3 per pulldownNaNa10 mM Tris pH 7,4; 150 mM di NaCl;

Riferimenti

  1. Stefanov, B. -A., Nowacki, M. Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination. Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).
  2. Swart, E. C., et al. Genome-wide analysis of genetic and epigenetic control of programmed DNA deletion. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8970-8983 (2014).
  3. Witzany, G. The Roles of transposable elements in transgenerational inheritance and genome evolution. Epigenetics in Biological Communication. Witzany, G. , Springer Cham. 369-385 (2024).
  4. Dubois, E., et al. Transposon invasion of the paramecium germline genome countered by a domesticated piggybac transposase and the NHEJ pathway. Int J Evol Biol. 2012, 436196(2012).
  5. Gruchota, J., Denby Wilkes, C., Arnaiz, O., Sperling, L., Nowak, J. K. A meiosis-specific Spt5 homolog involved in non-coding transcription. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4722-4732 (2017).
  6. Sandoval, P. Y., Swart, E. C., Arambasic, M., Nowacki, M. Functional diversification of Dicer-like proteins and small RNAs required for genome sculpting. Dev Cell. 28 (2), 174-188 (2014).
  7. Furrer, D. I., Swart, E. C., Kraft, M. F., Sandoval, P. Y., Nowacki, M. Two sets of piwi proteins are involved in distinct sRNA pathways leading to elimination of germline-specific DNA. Cell Rep. 20 (2), 505-520 (2017).
  8. Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia. Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).
  9. Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia. Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).
  10. Khanduja, J. S., Calvo, I. A., Joh, R. I., Hill, I. T., Motamedi, M. Nuclear noncoding RNAs and genome stability. Mol Cell. 63 (1), 7-20 (2016).
  11. Yao, M. -C., Chao, J. -L., Cheng, C. -Y. Programmed genome rearrangements in Tetrahymena. Microbiol Spectr. 2 (6), (2014).
  12. Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia. Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).
  13. Drews, F., et al. Two piwis with Ago-like functions silence somatic genes at the chromatin level. RNA Biol. 18 (sup2), 757-769 (2021).
  14. Singh, A., et al. ISWI1 complex proteins facilitate developmental genome editing in Paramecium. Genome Res. 35 (1), 93-108 (2025).
  15. Bernier, S. C., Cantin, L., Salesse, C. Systematic analysis of the expression, solubility, and purification of a passenger protein in fusion with different tags. Protein Expr Purif. 152, 92-106 (2018).
  16. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  17. Beisson, J., et al. Maintaining clonal Paramecium tetraurelia cell lines of controlled age through daily reisolation. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (1), pdb.prot5361(2010).
  18. Berger, J. D., Rahemtullah, S. Commitment to autogamy in Paramecium blocks mating reactivity: implications for regulation of the sexual pathway and the breeding system. Exp Cell Res. 187 (1), 126-133 (1990).
  19. Stefanov, B. -A., et al. Genetically encoded protein thermometer enables precise electrothermal control of transgene expression. Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2101813(2021).
  20. Shin, S., et al. Super-resolution proximity labeling with enhanced direct identification of biotinylation sites. Commun Biol. 7 (1), 554(2024).
  21. Leffers, K. -W., et al. Assembly of natural and recombinant prion protein into fibrils. Biol Chem. 386 (6), 569-580 (2005).
  22. Stefanov, B. -A., Ajuh, E., Allen, S., Nowacki, M. Eukaryotic release factor 1 from Euplotes promotes frameshifting at premature stop codons in human cells. iScience. 27 (4), 109413(2024).
  23. Stefanov, B. -A., Fussenegger, M. Biomarker-driven feedback control of synthetic biology systems for next-generation personalized medicine. Front Bioeng Biotechnol. 10, 986210(2022).
  24. Stefanov, B. -A., Mansouri, M., Charpin-El Hamri, G. -, Fussenegger, M. Sunlight-Controllable Biopharmaceutical Production for Remote Emergency Supply of Directly Injectable Therapeutic Proteins. Small. 18 (41), e2202566(2022).
  25. Rzeszutek, I., Maurer-Alcalá, X. X., Nowacki, M. Programmed genome rearrangements in ciliates. Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4615-4629 (2020).

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