Generazione di genomi batterici interi da campioni clinici utilizzando un flusso di lavoro di arricchimento del target

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per consentire il sequenziamento dell'intero genoma delle infezioni batteriche sessualmente trasmissibili da campioni clinici utilizzando l'arricchimento del bersaglio. Questo nuovo metodo basato su pannelli sindromici supera le sfide dell'abbondanza di DNA umano e della bassa carica batterica, facilitando la sorveglianza genomica per Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum e Mycoplasma genitalium.

Abstract

Ottenere genomi completi delle infezioni batteriche sessualmente trasmissibili (IST) direttamente da campioni clinici è difficile a causa della presenza di DNA umano, microbiota e cariche batteriche di agenti patogeni molto basse. La coltura spesso non è un'opzione, poiché queste specie sono esigenti e la maggior parte dei campioni viene prelevata in mezzi di trasporto che lisano i microrganismi, rendendoli non vitali per la coltura. Per affrontare questi problemi, abbiamo utilizzato un pannello di sonde progettato su quattro specie per generare sequenze dell'intero genoma di IST batteriche e abbiamo eseguito l'arricchimento del bersaglio, una procedura di ibridazione di due o tre giorni prima del sequenziamento del genoma. I nostri risultati iniziali hanno prodotto eccellenti dati genomici utilizzando campioni per i quali il sequenziamento diretto non ha avuto successo. L'arricchimento del bersaglio si è dimostrato altamente efficace per il sequenziamento dei genomi batterici delle IST, in particolare quando la carica patogena era elevata (Ct < 30). I campioni testati contenenti Mycoplasma genitalium avevano spesso valori di Ct superiori a 30, portando a minori tassi di successo del recupero del genoma; sono stati osservati miglioramenti dopo l'ottimizzazione della temperatura di ibridazione da 65 °C a 62,5 °C. Oltre a consentire la sorveglianza genomica, la disponibilità di genomi completi può fornire preziose informazioni sulla resistenza antimicrobica, come l'identificazione dei determinanti di resistenza acquisiti associati a Neisseria gonorrhoeae. Questo metodo ha già portato all'identificazione di un nuovo lignaggio di Chlamydia trachomatis lymphogranuloma venereum a Buenos Aires, ompA-genotipo L4, evidenziando il potenziale di questo approccio per scoprire nuove diversità genomiche e migliorare la sorveglianza delle IST.

Introduzione

L'avvento delle tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha facilitato il sequenziamento dell'intero genoma batterico (WGS), consentendo il sequenziamento di isolati clinici all'interno di molte specie di patogeni batterici umani. La tecnologia ha permesso numerosi studi comparativi attraverso la generazione di genomi completi su una scala senza precedenti. Ciò ha avuto un grande impatto sulla microbiologia clinica e della salute pubblica, poiché l'accesso ai dati del genoma da campioni clinici attraverso WGS consente la tipizzazione e il rilevamento di geni di resistenza antimicrobica. Inoltre, gli approcci metagenomici consentono il rilevamento diretto di patogeni associati alla malattia da campioni clinici. Tali informazioni creano nuove opportunità per strategie di trattamento personalizzate per i pazienti. Inoltre, il WGS è un potente strumento che fornisce informazioni sull'evoluzione dei ceppi circolanti di uno specifico agente patogeno, nonché sui loro modelli di trasmissione, consentendo alle autorità sanitarie pubbliche di comprendere e rispondere meglio alle epidemie di agenti patogeni ^1,2,3.

Per ottenere una qualità di sequenziamento sufficiente per la WGS, è tipicamente necessario l'isolamento batterico attraverso la coltura per ottenere le quantità di DNA microbico richieste ^4,5,6. Ciò rappresenta un fattore limitante per quegli organismi che sono difficili da coltivare, quelli che non possono essere coltivati a causa di un'elaborazione diagnostica del campione non vitale o quelli esposti agli antibiotici durante il trattamento del paziente. Esempi di tali microrganismi difficili da coltivare includono patogeni batterici sessualmente trasmissibili, come Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum e Mycoplasma genitalium ^7,8,9. Queste specie sono difficili da coltivare a causa di diversi fattori, tra cui la loro natura intracellulare, la fragilità, i requisiti di crescita meticolosi e i tassi di riproduzione lenti. Per questi motivi, lo sviluppo e l'implementazione di tecniche che consentano la WGS nonostante il basso contenuto di DNA, come spesso accade nei campioni dei pazienti, è fondamentale per l'esecuzione di analisi genomiche in contesti clinici.

L'arricchimento del bersaglio è il metodo più promettente per il sequenziamento del genoma quando il DNA microbico è scarso¹⁰. Ad esempio, nel contesto di agenti patogeni che causano infezioni sessualmente trasmissibili (IST), solo una piccola frazione del DNA presente in un campione di paziente proviene dall'agente patogeno. Nel caso delle infezioni da C. trachomatis, è stato riscontrato che il DNA patogeno comprende fino a un massimo dello 0,6% del DNA totale, ma i valori sono in genere molto più bassi¹¹. Il metodo di arricchimento del bersaglio consiste nel catturare selettivamente il DNA microbico di interesse prima dell'NGS. Ciò si ottiene utilizzando sonde di RNA marcate con biotina appositamente progettate che sono complementari al DNA microbico bersaglio. La legatura dell'adattatore viene eseguita per generare una libreria genomica, prima dell'ibridazione, durante la quale queste sonde si legano al DNA microbico complementare. Successivamente, le microsfere magnetiche rivestite di streptavidina vengono utilizzate per catturare i complessi di acidi nucleici marcati con biotina, sfruttando la forte interazione biotina-streptavidina. Infine, una reazione a catena della polimerasi (PCR) amplifica i frammenti di DNA selezionati. Questi passaggi concettuali chiave sono necessari per comprendere la strategia di arricchimento target. Tuttavia, l'intero protocollo^10,12 prevede anche ulteriori passaggi procedurali, come il lavaggio e il controllo di qualità.

Prima di avviare il protocollo di sequenziamento, è importante valutare la quantità di DNA in ingresso e assicurarsi che le condizioni durante il flusso di lavoro ne preservino l'integrità. Secondo le raccomandazioni del produttore, il protocollo standard richiede 10-200 ng di DNA in un volume di 7 μL, che corrisponde a un intervallo di concentrazione compreso tra circa 1,4 e 28,6 ng/μL. Quando la concentrazione di DNA è inferiore, si consiglia una versione modificata del protocollo che utilizza 17 μL, consentendo concentrazioni comprese tra 0,6 e 11,8 ng/μL mantenendo la quantità di input richiesta¹². Date le basse concentrazioni spesso ottenute da campioni clinici, abbiamo implementato di routine la variante del protocollo da 17 μL. Le prestazioni di ibridazione e sequenziamento sono associate alla qualità del DNA, sottolineando l'importanza di condizioni appropriate di conservazione e trasporto del campione per preservare l'integrità dell'acido nucleico. Pertanto, pratiche di manipolazione adeguate come la stabilizzazione dei terreni di raccolta, la lavorazione rapida, il mantenimento delle condizioni della catena del freddo e la riduzione al minimo dei cicli di gelo-scongelamento sono misure importanti per ottimizzare la qualità del DNA. Oltre alle concentrazioni di DNA richieste, la lunghezza del frammento di DNA è un indicatore di integrità. Si consiglia di ridurre al minimo la degradazione del DNA durante la manipolazione e la conservazione dei campioni per ottenere frammenti più lunghi e ottimizzare i risultati del sequenziamento. Ciò è particolarmente rilevante in ambito clinico, dove la variabilità nei metodi di raccolta, nel terreno e nella manipolazione è comune. Abbiamo applicato con successo questo protocollo al DNA estratto sia dal terreno 2-SP che dal mezzo di trasporto NAAT, con lunghezze medie dei frammenti fino a 1kb, come dettagliato nei risultati rappresentativi. Infine, il successo del sequenziamento è stato definito come il raggiungimento di una copertura genomica superiore al 95% con una profondità media di lettura superiore a 10x¹⁰.

Ad oggi, l'arricchimento del bersaglio è stato applicato con successo da vari gruppi di ricerca a un'ampia gamma di microrganismi e virus, inclusi agenti patogeni che causano malattie sessualmente trasmissibili, norovirus, virus del bestiame e patogeni delle piante 10,13,14,15,16. Tuttavia, finora, la progettazione delle sonde è stata generalmente limitata a singoli agenti patogeni piuttosto che a un pannello mirato a genomi completi di più patogeni sindromicamente collegati. I bersagli ideali sono organismi con genomi piccoli e conservati, che includono effettivamente C. trachomatis, T. pallidum e M. genitalium. Mentre N. gonorrhoeae ha un genoma più diversificato e un pan-genoma più ampio, le sonde per coprirlo possono ancora essere razionalizzate in un progetto con gli altri tre batteri. C'è una certa divergenza in %G+C tra questi batteri e altri che possono essere collegati sindromicamente, il che significa che potrebbe essere necessario ottimizzare le condizioni.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di ottenere genomi completi direttamente da campioni clinici per consentire analisi filogenetiche ed epidemiologiche. Dimostriamo una strategia nuova ed efficace utilizzando un pannello di sonde su misura per C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum e M. genitalium per recuperare genomi completi utilizzando il DNA estratto da campioni clinici come tamponi urogenitali e anorettali. Questo approccio si è dimostrato efficace ed è stato applicato nella caratterizzazione dell'epidemia di linfogranuloma venereo (LGV) a Buenos Aires, consentendo la descrizione di un nuovo lignaggio di C. trachomatis LGV^10,13.

Verrà descritta la procedura di arricchimento del bersaglio, compreso l'uso di un metodo di cattura del DNA disponibile in commercio con pooling post-cattura per il sequenziamento di nuova generazione (NGS) impiegato per ottenere genomi completi direttamente da campioni clinici di pazienti con diagnosi di C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum e/o M. genitalium Infezioni. Per un successo ottimale, si consiglia di selezionare campioni con un valore Ct inferiore a 30, poiché valori Ct più elevati riflettono cariche di agenti patogeni inferiori e hanno meno probabilità di produrre genomi completi. L'estratto di DNA per il metodo può essere ottenuto da campioni clinici di vari tipi di campioni e mezzi di raccolta. Le procedure di estrazione del DNA possono essere eseguite sia manualmente che con sistemi automatizzati, utilizzando kit progettati per l'isolamento di DNA patogeno o virale da campioni di tampone umano (vedi Tabella dei Materiali).

Il set di sonde utilizzato nella procedura di arricchimento del bersaglio (vedi Tabella dei materiali) è stato specificamente progettato per catturare la diversità genomica di C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum e M. genitalium. Le sonde personalizzate sono state generate utilizzando più genomi completi per ciascuna specie, ottimizzando la copertura dei loro pan-genomi noti¹⁰. I criteri di progettazione includevano un'omologia minima di sequenza del 90% rispetto alle sequenze di riferimento e una frequenza di affiancamento di 1x-2x per migliorare l'efficienza di cattura del bersaglio. Per ottimizzare l'efficacia in termini di costi, l'algoritmo utilizzato nella progettazione delle sonde ha ridotto al minimo il numero di sonde, mantenendo al contempo una rappresentazione genomica completa. Il set di sonde finale consisteva in 242.000 sonde per i progetti multiplex mirati a C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium e T. pallidum. L'intero protocollo di arricchimento target può essere eseguito in 2 o 3 giorni. Vengono fornite indicazioni chiare dei punti di arresto sia per le opzioni di flusso di lavoro di due giorni che per quelle di tre giorni.

DICHIARAZIONE ETICA
Questo studio propone miglioramenti metodologici basati sui protocolli precedentemente pubblicati ^10,13. Le procedure descritte riguardano solo campioni anonimizzati e non includono i dati dei pazienti; Pertanto, non è stata richiesta alcuna approvazione etica specifica per gli aspetti metodologici. I risultati rappresentativi sono stati ottenuti da due serie di campioni precedentemente studiati: campioni argentini raccolti secondo il protocollo approvato Detección de C. trachomatis en pacientes con rectitis infecciosa: prevalencia y tipificación (Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires, approvazione n. 201723), con consenso informato scritto ottenuto da tutti i partecipanti; e campioni finlandesi anonimizzati, per i quali non era richiesta alcuna approvazione etica specifica. Prima dell'invio al database di qualsiasi dato di sequenziamento risultante, le letture umane devono essere rimosse.

Protocollo

NOTA: Lo spazio di lavoro deve essere diviso in una zona pre-PCR (spazio di lavoro privo di ampliconi) e una zona post-PCR (spazio di lavoro per la manipolazione degli ampliconi) per evitare la contaminazione. Se non diversamente specificato, tutti i passaggi devono essere eseguiti in una delle due aree di lavoro controllate. Tutte le master mix e le miscele di reazione PCR devono essere preparate nell'area di lavoro priva di ampliconi, mentre tutte le fasi successive che coinvolgono il DNA amplificato devono essere condotte nell'area di lavoro di manipolazione degli ampliconi. Tutte le quantità di questo protocollo sono calcolate per elaborare otto campioni.

1. Frammentazione del DNA

1. Misurare la concentrazione di DNA degli estratti di DNA da campioni clinici contenenti DNA patogeno bersaglio (DNA) utilizzando un metodo sensibile, accurato e basato sulla fluorescenza (saggio del DNA a doppio filamento [dsDNA], utilizzando 1 μL di campione, con un intervallo di rilevamento fino a 120 ng/μL; vedere la Tabella dei materiali). Questo metodo di quantificazione viene utilizzato in modo coerente in tutto il protocollo ogni volta che viene misurata la concentrazione di DNA.
2. Diluire ogni campione di DNA a una concentrazione di 10 - 200 ng utilizzando acqua priva di nucleasi, garantendo un volume finale di 17 μl in ciascuna striscia di provetta PCR. Per ottenere risultati di sequenziamento ottimali, utilizzare la massima quantità possibile di DNA in ingresso entro l'intervallo consigliato.
   NOTA: Nei casi in cui la concentrazione di DNA totale è inferiore al minimo raccomandato di 10 ng in 17 μL, l'integrazione con DNA di fondo (ad esempio, DNA genomico umano) può essere utilizzata per soddisfare i requisiti di input, come suggerito dal produttore. Questo può aiutare a stabilizzare la reazione di preparazione della libreria e migliorare le prestazioni di sequenziamento in campioni clinici a basso input.
3. Scongelare il tampone di frammentazione (5x), vortice e posizionare sul ghiaccio.
4. Programmare il termociclatore secondo la Tabella 1. Avviare il programma e mettere immediatamente in pausa.
   NOTA: La durata della fase di incubazione a 37 °C può variare a seconda della dimensione iniziale del frammento di DNA e della lunghezza di lettura NGS desiderata. Per campioni di DNA di alta qualità, si consiglia un tempo di incubazione di 15 minuti per ottenere frammenti da 150 a 200 bp adatti per 2 letture da 100x e 10 minuti per ottenere frammenti da 180 a 250 bp per 2 letture da 150x.
5. Recuperare le fiale necessarie per la miscela master di frammentazione dalla conservazione a -20°C. Preparare il master mix in base alla Tabella 2. Sigillare il tubo e vorticare ad alta velocità per 5-10 s. Centrifugare brevemente per rimuovere le bolle e mantenere il master mix sul ghiaccio.
6. Aggiungere 3 μl di miscela master di frammentazione a ciascun pozzetto contenente 17 μl di DNA in ingresso. Mescolare pipettando su e giù 20 volte, sigillare la striscia della provetta PCR, agitare ad alta velocità per 5-10 s e centrifugare brevemente.
7. Posizionare la striscia di provette per PCR nel termociclatore (vedere la Tabella dei materiali) e riprendere il programma illustrato nella Tabella 1 all'inizio del passaggio 1.
8. Una volta raggiunta la fase di mantenimento di 4 °C, rimuovere la striscia di provette per PCR dal termociclatore e aggiungere 30 μl di acqua priva di nucleasi. Posizionare la striscia di provette per PCR sul ghiaccio.

Tabella 1: Programma del termociclatore per la frammentazione enzimatica. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Preparazione del Master Mix di frammentazione Fare clic qui per scaricare questa tabella.

2. Preparazione della biblioteca

1. Preparazione del master mix di legatura
   NOTA: A questo punto la miscela master di legatura dovrebbe essere preparata perché ha bisogno di 30-45 minuti per equilibrarsi a temperatura ambiente.
   1. Recuperare il tampone di legatura dalla conservazione a -20°C e scongelare con ghiaccio. Recuperare la DNA ligasi T4 dalla conservazione a -20°C, mescolare capovolgendo la fiala e conservare in ghiaccio.
   2. Preparare il master mix di legatura secondo la Tabella 3. Sigillare il tubo e vorticare ad alta velocità per 10-20 s, centrifugare brevemente e mantenere a temperatura ambiente per 30-45 minuti prima dell'uso.
2. Riparazione finale e frammenti di coda dA
   1. Programmare il termociclatore secondo la Tabella 4.
   2. Recuperare il tampone di coda di riparazione finale dallo stoccaggio a -20 °C e scongelarlo con ghiaccio. Una volta scongelato, vortice ad alta velocità, girare brevemente. Recuperare la miscela di enzimi di coda End Repair-A, mescolare capovolgendo la fiala e tenere in ghiaccio.
   3. Preparare la miscela master di riparazione finale/dA-tailing secondo la Tabella 5 (vedi Tabella dei materiali). Mescolare sigillando saldamente il tubo e il vortice ad alta velocità per 10-20 s, girare brevemente e tenere in ghiaccio.
   4. Pipettare 20 μl di miscela master end repair/dA-tailing in ciascun pozzetto contenente 50 μl di frammenti di DNA (dai passaggi 1.1-1.8). Sigillare la striscia di provette per PCR, mescolare accuratamente agitando ad alta velocità per 5-10 s. Far girare brevemente la striscia di provette per PCR e inserirla nel termociclatore. Riprendere il programma della Tabella 4.
3. Legatura di adattatori marcati con MBC
   1. Una volta che il programma nella Tabella 4 ha completato la sua fase finale, posizionare la striscia di provette PCR sul ghiaccio. Impostare il termociclatore in base ai parametri della Tabella 6. Avvia il programma e mettilo immediatamente in pausa.
   2. Aggiungere 25 μl di master mix di legatura a temperatura ambiente a ciascun campione preparato al punto 2.1. Sigillare la striscia della provetta PCR, vorticare per 5-10 s e centrifugare brevemente.
   3. Recuperare la miscela di oligo adattatore per librerie con tag MBC (vedere la tabella dei materiali) dallo stoccaggio a -20 °C e scongelare su ghiaccio. Una volta scongelato, vorticare ad alta velocità per 5-10 s. Gira brevemente e mantieni il ghiaccio.
   4. Aggiungere 5 μl di miscela oligo adattatore per librerie con tag MBC a ciascun campione. Sigillare la striscia di provette PCR e vorticare ad alta velocità per 5-10 s, centrifugare brevemente. Posizionare immediatamente la striscia di provette per PCR nel termociclatore e continuare a eseguire il programma come specificato nella Tabella 6.
4. Pulizia della legatura
   1. Eseguire la purificazione del DNA utilizzando biglie magnetiche. Recuperare le perle dalla conservazione a 4 °C e lasciarle raggiungere la temperatura ambiente prima dell'uso.
   2. Preparare 4 ml di etanolo al 70% utilizzando acqua priva di nucleasi. Conservare a temperatura ambiente.
      NOTA: Si consiglia vivamente di preparare una soluzione di etanolo al 70% da utilizzare nelle fasi di pulizia per garantire prestazioni ottimali. Per la preparazione al 70% di etanolo, utilizzare acqua priva di nucleasi immediatamente prima dell'uso.
   3. Agitare accuratamente la sospensione della perlina magnetica fino a quando la miscela è uniforme e il colore appare coerente.
   4. Quando il programma nella Tabella 6 raggiunge la fase di mantenimento di 4 °C, trasferire la striscia di provette PCR dal termociclatore a temperatura ambiente. Aggiungere 80 μl di sospensione di perline in ciascun pozzetto. Sigillare la striscia della provetta PCR e vorticare per 5-10 s, centrifugare brevemente.
   5. Incubare le sospensioni di perle per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire la striscia di provette per PCR su un supporto magnetico (vedere Tabella dei materiali) e attendere 5-10 minuti fino a quando la soluzione diventa limpida.
   6. Mantenendo la striscia di provette per PCR nel supporto magnetico, rimuovere ed eliminare con cura la soluzione chiarificata da ciascun pozzetto, evitando il contatto con le perline.
   7. Con la striscia di provette per PCR nel supporto magnetico, eseguire due lavaggi con etanolo al 70% nel modo seguente: aggiungere 200 μL di etanolo al 70% a ciascun campione. Attendere 1 minuto e rimuovere l'etanolo al 70%. Evitare di toccare le perle durante la rimozione della soluzione.
   8. Dopo il secondo lavaggio, sigillare la striscia della provetta PCR e centrifugare brevemente i campioni per raccogliere l'etanolo residuo. Posizionare la striscia di provette per PCR nel supporto magnetico per 30 s.
   9. Rimuovere l'etanolo raccolto evitando di toccare le perline. Per rimuovere l'etanolo residuo, rimuovere la striscia di provette PCR dal supporto magnetico e tenerla aperta (idealmente all'interno di una cappa) per un massimo di 5 minuti. Assicurarsi che le perline siano completamente asciutte ma non screpolate nell'aspetto; Ciò ridurrebbe l'efficienza del processo di eluizione.
   10. Eluire il DNA aggiungendo 35 μL di acqua priva di nucleasi a ciascun pozzetto del campione. Miscelare accuratamente pipettando su e giù 10x-15x, sigillare le provette e agitare per 5-10 s. Confermare l'assenza di grumi visibili. Nel caso ce ne fossero, vorticare fino a quando non si scioglie.
   11. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 5 minuti. Posizionare la striscia di provette per PCR in un supporto magnetico e attendere circa 5 minuti fino a quando la soluzione non si chiarisce.
   12. Rimuovere con cautela il surnatante chiarificato (~34 μL) da ciascun pozzetto e trasferirlo in un pozzetto corrispondente in una striscia di provette PCR fresca. Tenere i campioni sul ghiaccio e scartare le perline.
       NOTA: Per un protocollo di 3 giorni, questo segna la fine del Giorno 1. Conservare i campioni a 4 °C per una notte.
5. Amplificazione e doppio indice
   NOTA: Selezionare la coppia di primer indice appropriata per ciascun campione per garantire una corretta identificazione durante il sequenziamento. Ogni sequenza di indice è costituita da un tag da 8 bp incorporato all'interno dei primer utilizzati per l'amplificazione delle librerie di pre-cattura.
   1. Recuperare il tampone DNA polimerasi ad alta fedeltà con dNTP (5x) da una conservazione a -20 °C e scongelarlo su ghiaccio. Recuperare i primer di sequenziamento indicizzati selezionati da una conservazione a -20 °C e conservarli in ghiaccio.
      NOTA: Assicurarsi di registrare il codice a barre specifico assegnato a ciascun campione per un'identificazione e una tracciabilità accurate durante tutto il processo di sequenziamento.
   2. Programmare il termociclatore secondo la Tabella 7. Avviare il programma e mettere immediatamente in pausa.
      NOTA: Il produttore consiglia di eseguire da 8 a 14 cicli di PCR pre-acquisizione a seconda della qualità e della quantità di DNA in ingresso. In questo protocollo, sono stati implementati 11 cicli seguendo le raccomandazioni del produttore, ottenendo dati di sequenziamento di alta qualità^10,12.
   3. Recupera l'enzima di fusione ad alta fedeltà per l'amplificazione della PCR da una conservazione a -20 °C. Pipettare l'enzima su e giù per miscelarlo evitando un'eccessiva agitazione e agitare il tampone DNA polimerasi ad alta fedeltà per garantire l'omogeneità. Preparare la miscela di reazione PCR pre-cattura (come descritto nella Tabella 8). Agitare la miscela finale e girare brevemente, mantenendo il ghiaccio.
   4. Erogare 11 μl della miscela di reazione PCR pre-cattura (preparata come descritto nella Tabella 8) in ciascun pozzetto del campione contenente la libreria di DNA purificato. Aggiungere 5 μl della coppia di primer indice selezionata a ciascuna reazione. Sigillare la striscia della provetta PCR e il vortice per 5 s, quindi centrifugare rapidamente.
   5. Riprendere il programma del termociclatore come specificato nella Tabella 7. Una volta che la temperatura raggiunge i 98 °C, posizionare la striscia di provette per PCR nel termociclatore e chiudere saldamente il coperchio.
6. Pulizia della biblioteca
   1. Lasciare che le perle magnetiche si equilibrino a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima dell'uso. Preparare 4 ml di etanolo al 70% utilizzando acqua priva di nucleasi. Conservare a temperatura ambiente.
   2. Agitare accuratamente la sospensione della perlina magnetica fino a quando la miscela è uniforme e il colore appare coerente.
   3. Quando il programma nella Tabella 7 raggiunge la fase di mantenimento di 4 °C, trasferire la striscia di provette per PCR dal termociclatore a temperatura ambiente. Aggiungere 50 μl di sospensione di perline a ciascun campione. Sigillare la striscia di provette PCR e vorticare per 5-10 s, girare brevemente (senza pellettare le perle magnetiche).
   4. Incubare le sospensioni di perle per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire la striscia di provette per PCR su un supporto magnetico e attendere 5-10 minuti fino a quando la soluzione diventa limpida.
   5. Mantenendo la striscia di provette per PCR nel supporto magnetico, rimuovere ed eliminare con cura la soluzione limpida da ciascun pozzetto. Evitare di toccare le perle durante la rimozione della soluzione.
   6. Con la striscia di provette per PCR nel supporto magnetico, eseguire due lavaggi con etanolo al 70% nel modo seguente. Aggiungere 200 μl di etanolo al 70% a ciascun campione. Attendere 1 minuto e rimuovere l'etanolo al 70%. Evitare di toccare le perle durante la rimozione della soluzione.
   7. Dopo il secondo lavaggio, sigillare la striscia di provette per PCR e farla girare brevemente per raccogliere l'etanolo residuo. Posizionare la striscia di provette per PCR nel supporto magnetico per 30 s. Rimuovere l'etanolo residuo evitando di toccare le perline.
   8. Per rimuovere l'etanolo residuo, rimuovere la striscia di provette PCR dal supporto magnetico e tenerla aperta (idealmente all'interno di una cappa) per un massimo di 5 minuti. Assicurarsi che le perle siano completamente asciutte ma non incrinate nell'aspetto, in quanto ciò ridurrebbe l'efficienza del processo di eluizione.
   9. Eluire il DNA della libreria aggiungendo 15 μL di acqua priva di nucleasi a ciascuna provetta del campione. Miscelare accuratamente pipettando su e giù 10x-15x, sigillare la striscia della provetta PCR e agitare per 5-10 s. Confermare l'assenza di grumi visibili. Nel caso ce ne fossero, vorticare fino a quando non si scioglie.
   10. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 5 minuti. Posizionare la striscia di provette per PCR in un supporto magnetico e attendere circa 5 minuti fino a quando la soluzione non si chiarisce.
   11. Rimuovere con cautela il surnatante chiarificato (~15 μL) da ciascun pozzetto e trasferirlo in un pozzetto corrispondente in una striscia di provette PCR fresca. Tenere i campioni sul ghiaccio e scartare le perline.
7. Controllo qualità
   1. Misura la concentrazione di DNA del DNA purificato della libreria. A causa della maggiore sensibilità, utilizzare un metodo basato sulla fluorescenza per quantificare il DNA in 1 μL.

Tabella 3: Preparazione del master mix di legatura. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4: Programma del termociclatore per la riparazione finale/dA-tailing. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 5: Preparazione della riparazione finale/dA tailing master mix. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 6 Programma del termociclatore per la legatura. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 7: Programma di termociclatore PCR pre-acquisizione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 8: Preparazione della miscela di reazione per PCR pre-cattura. Clicca qui per scaricare questa tabella.

3. Ibridazione/cattura del campione

1. Librerie di ibridazione da sondare
   1. Programmare il termociclatore secondo la Tabella 9. Avviare il programma e mettere immediatamente in pausa.
      NOTA: Il produttore raccomanda una temperatura di ibridazione di 65°C. Questa temperatura è stata ridotta a 62,5 °C, con conseguente miglioramento dei risultati.
   2. Recuperare il tampone di ibridazione dalla conservazione a -20 °C, scongelare con ghiaccio e conservare a temperatura ambiente fino al momento dell'uso. Recuperare sia il bloccante della RNasi che la miscela di bloccanti degli oligonucleotidi dalla conservazione a -20 °C e scongelare su ghiaccio. Tenere queste fiale sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
   3. Calcolare il volume necessario affinché ciascun campione contenga 500-1000 ng di libreria di DNA, in base alla concentrazione di DNA misurata al punto 2.7. Trasferire il volume calcolato in una nuova striscia di provette per PCR e regolare il volume totale a 12 μl con acqua priva di nucleasi.
   4. Vorticare e far girare rapidamente la miscela di bloccanti degli oligonucleotidi. Aggiungere 5 μl a ciascuna provetta del campione. Sigillare la striscia di provette per PCR e trasferirla al termociclatore. Riprendere il programma di cicli termici descritto nella Tabella 9 ed eseguire fino alla fase 3, in cui è necessario aggiungere ulteriori reagenti direttamente ai pozzetti del campione nel termociclatore.
   5. Preparare la soluzione di blocco di RNasi al 25% secondo la Tabella 10. Sigillare il tubo e vorticare ad alta velocità per 10-20 s, girare brevemente e tenere in ghiaccio fino all'uso.
      NOTA: Evitare l'esposizione prolungata di soluzioni contenenti sonde a temperatura ambiente. Conservare a temperatura ambiente solo durante le fasi di preparazione.
   6. Recuperare la fiala della sonda dalla conservazione a -80 °C e conservare la fiala in una griglia di raffreddamento quando non è in uso. Trasferire sul ghiaccio per lo scongelamento. Si consiglia di utilizzare le sonde come fornito, ma possono essere diluite se testate ^10,13.
   7. Una volta che tutti i reagenti elencati nella Tabella 11 hanno raggiunto la temperatura ambiente, combinare per preparare la miscela di ibridazione della sonda. Mescolare la soluzione agitando ad alta velocità per 5 s, centrifugare brevemente e procedere immediatamente al passaggio successivo.
   8. Quando il termociclatore raggiunge la fase 3 del programma descritto nella Tabella 9, aggiungere 13 μl della miscela di ibridazione della sonda a temperatura ambiente a ciascun pozzetto del campione, mantenendo le provette nel termociclatore per tutta la durata del processo. Miscelare accuratamente pipettando lentamente 8x-10x.
   9. Sigillare saldamente la striscia della provetta per PCR, vorticare brevemente e far girare le provette. Assicurarsi che non siano presenti bolle, quindi rimettere prontamente i tubi del nastro al termociclatore. Verificare che i tubi siano adeguatamente sigillati.
   10. Riprendere il programma di cicli termici per eseguire l'ibridazione dei campioni di DNA preparati con le sonde. L'ibridazione procede da un giorno all'altro
       NOTA: Per un protocollo di 2 giorni, questo segna la fine del Giorno 1. Per un protocollo di 3 giorni, questo segna la fine del Giorno 2.
2. Preparazione delle perle di streptavidina
   1. Recuperare le perle magnetiche rivestite di streptavidina (perle di streptavidina) da una conservazione a 4 °C. Agitare accuratamente la fiala per assicurarsi che le perle siano completamente risospese. La sospensione deve essere omogenea.
   2. Per ogni campione di ibridazione, trasferire 50 μl di perle completamente risospese in singole provette di una nuova striscia di provette per PCR.
   3. Lavare le perle di streptavidina nel modo seguente: aggiungere 200 μl di tampone legante a ciascuna provetta, mescolare pipettando su e giù. Sigillare i tubi, vorticare ad alta velocità per 5-10 s e girare brevemente. Posizionare la striscia di provette per PCR in un supporto magnetico. Lasciare che la soluzione si limpidi per 5 minuti, quindi rimuovere con cura e gettare il surnatante. Ripetere i passaggi 2 volte, completando un totale di tre lavaggi.
   4. Risospendere le perle in 200 μL di tampone legante.
3. Acquisizione di librerie ibridate
   1. Una volta che il programma di cicli termici di ibridazione indicato nella Tabella 9 ha completato la sua fase finale, trasferire la striscia di provette PCR a temperatura ambiente.
   2. Trasferire l'intero volume (~30 μL) da ciascuna provetta alle provette corrispondenti contenenti 200 μL di perle di streptavidina prelavate. Miscelare accuratamente pipettando su e giù 5x-8x, quindi sigillare saldamente la provetta a strisce.
   3. Posizionare la provetta su un miscelatore a piastre a 96 pozzetti e mescolare energicamente a 1800 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi che il liquido si mescoli correttamente all'interno dei pozzetti.
      NOTA: Se non è disponibile un miscelatore a piastre a 96 pozzetti o i campioni non si miscelano in modo efficace, prendere in considerazione metodi alternativi come fissare i tubi di striscia orizzontalmente sulla superficie superiore del miscelatore o utilizzare un agitatore a temperatura controllata (con l'opzione di riscaldamento disattivata) per garantire un'agitazione completa del campione.
   4. Durante questo periodo di incubazione, preparare sei aliquote da 200 μL di tampone di lavaggio ad alta temperatura per ciascun campione (cioè, in questo caso, 6 x 8 provette a strisce ciascuna con 200 μL). Sigillare le provette e incubare nel termociclatore tenuto a 70 °C fino al momento del bisogno.
   5. Una volta completata l'incubazione di cattura di 30 minuti, centrifugare brevemente la striscia della provetta PCR per raccogliere il liquido. Posizionare la striscia di provette PCR in un supporto magnetico per raccogliere le perline. Attendere che la soluzione diventi limpida (circa 2 minuti), quindi rimuovere e scartare con cura il surnatante evitando di toccare le perline.
   6. Dopo aver rimosso la striscia di provette per PCR dal supporto magnetico, aggiungere 200 μl di tampone di lavaggio a temperatura ambiente. Pipettare su e giù fino a quando le perle di streptavidina non sono completamente risospese (15x-20x).
   7. Posizionare la striscia di provette PCR nel supporto magnetico e attendere che la sospensione si svuoti (circa 1 minuto). Quindi, rimuovere e scartare il surnatante.
      NOTA: Per garantire la specificità della cattura, è fondamentale mantenere la sospensione del cordone a 70 °C durante la procedura di lavaggio descritta di seguito. Pertanto, verificare che il tampone di lavaggio ad alta temperatura sia preriscaldato a 70 °C prima dell'uso.
   8. Lavare le perle di streptavidina 6 volte con aliquotato e preriscaldato a 70 °C di tampone di lavaggio ad alta temperatura come descritto di seguito.
      1. Rimuovere la provetta della striscia PCR contenente le perle dal supporto magnetico. Aggiungere 200 μl di tampone di lavaggio ad alta temperatura preriscaldato a 70 °C in ciascuna provetta contenente le perle. Pipettare su e giù fino a quando le perle non sono completamente risospese (15x-20x). Sigillare accuratamente la striscia di provette per PCR, agitare ad alta velocità per 8 s e girare rapidamente senza pellettare le perline.
      2. Posizionare la provetta della striscia di campione contenente le perle risospese nel blocco del termociclatore a 70 °C per 5 minuti. Trasferire il tubo di striscia dal termociclatore al supporto magnetico a temperatura ambiente.
      3. Attendi 1 minuto affinché la soluzione si liberi. Quindi, rimuovere e scartare il surnatante. Ripetere 5 volte per un totale di sei lavaggi.
   9. Assicurarsi che tutto il tampone di lavaggio sia stato completamente rimosso, quindi aggiungere 25 μl di acqua priva di nucleasi a ciascuna provetta del campione. Risospendere lentamente le perle pipettando su e giù 8 volte, cercando di evitare la formazione di bolle.
   10. Conservare la striscia PCR contenente i campioni sul ghiaccio fino a quando non sono pronti per essere utilizzati nelle reazioni PCR descritte di seguito.
4. Librerie arricchite con amplificazione
   1. Programmare il termociclatore secondo la Tabella 12. Avviare il programma e mettere immediatamente in pausa.
      NOTA: Il produttore consiglia di eseguire da 10 a 16 cicli di PCR post-acquisizione a seconda delle dimensioni del design della sonda. In questo protocollo, sono stati implementati 22 cicli, con conseguente successo del recupero del genoma del patogeno^10,12.
   2. Recuperare sia il tampone DNA polimerasi ad alta fedeltà con dNTP (5x) che la miscela di primer post-cattura (vedere la Tabella dei materiali) da conservazione, scongelamento e conservazione in ghiaccio a -20 °C. Vorticare ad alta velocità e girare rapidamente verso il basso prima dell'uso.
   3. Recuperare l'enzima di fusione ad alta fedeltà per l'amplificazione della PCR (vedere la Tabella dei materiali) dalla conservazione a -20 °C. Per miscelare correttamente la soluzione enzimatica, pipettare su e giù per il liquido per evitare un'eccessiva agitazione. Quindi, preparare la miscela di reazione PCR post-cattura combinando tutti i reagenti secondo la Tabella 13. Agitare la miscela finale e girare brevemente, mantenendo il ghiaccio.
   4. Aggiungere 25 μl della miscela di reazione PCR post-cattura a ciascuna provetta del campione (ciascuna contenente 25 μl di DNA arricchito con target legato a microsfere). Pipettare su e giù per mescolare le reazioni fino a quando la sospensione del cordone è uniforme. Sigillare saldamente la striscia della provetta PCR. Non centrifugare la striscia della provetta per PCR in questa fase.
   5. Posizionare la striscia di provette per PCR nel termociclatore e riprendere il programma del termociclatore come specificato nella Tabella 12. Una volta che il programma raggiunge la fase finale, far girare brevemente la striscia di provette per PCR. Posizionare la striscia di provette per PCR nel supporto magnetico, attendere circa 2 minuti affinché la soluzione si liberi.
   6. Trasferire circa 50 μl di surnatante da ciascuna striscia di provette per PCR nel pozzetto corrispondente di una nuova striscia di provette per PCR. Il tubo di striscia contenente le perle di streptavidina può essere scartato.
5. Pulizia delle librerie finali
   1. Lasciare che le perle magnetiche si equilibrino a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima dell'uso. Preparare 4 ml di etanolo al 70% utilizzando acqua priva di nucleasi. Conservare a temperatura ambiente.
   2. Agitare accuratamente la sospensione della perlina magnetica fino a quando la miscela è uniforme e il colore appare coerente.
   3. Aggiungere 50 μl di sospensione a microsfere in ciascuna provetta del campione. Sigillare i tubi e il vortice per 5-10 s, girare brevemente (senza pellettare le perline magnetiche).
   4. Incubare le sospensioni di perle per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire la striscia di provette per PCR su un supporto magnetico e attendere 5-10 minuti fino a quando la soluzione diventa limpida.
   5. Mantenendo la striscia di provette per PCR nel supporto magnetico, rimuovere ed eliminare con cura la soluzione limpida da ciascun pozzetto. Evitare di toccare le perle durante la rimozione della soluzione.
      1. Con la striscia di provette per PCR nel supporto magnetico, eseguire due lavaggi con etanolo al 70% nel modo seguente: aggiungere 200 μL di etanolo al 70% a ciascun campione. Attendere 1 minuto per consentire alle perle disturbate di depositarsi e rimuovere l'etanolo al 70%. Evitare di toccare le perle durante la rimozione della soluzione.
   6. Dopo il secondo lavaggio, sigillare le provette e far girare brevemente la striscia di provette PCR per raccogliere l'etanolo residuo. Posizionare la striscia di provette PCR sul supporto magnetico per 30 s.
   7. Per rimuovere l'etanolo residuo, rimuovere la striscia di provette PCR dal supporto magnetico e tenerla aperta (idealmente all'interno di una cappa) per un massimo di 5 minuti. Assicurarsi che le perle siano completamente asciutte ma non incrinate nell'aspetto, ciò ridurrebbe l'efficienza del processo di eluizione.
   8. Eluire il DNA della libreria aggiungendo 25 μL di acqua priva di nucleasi a ciascuna provetta del campione. Miscelare accuratamente pipettando su e giù 10x-15x, sigillare la striscia della provetta PCR e agitare per 5-10 s. Confermare l'assenza di grumi visibili.
   9. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 5 minuti. Posizionare la striscia di provette per PCR in un supporto magnetico e attendere circa 5 minuti fino a quando la soluzione non si chiarisce.
   10. Rimuovere con cautela il surnatante chiarificato (circa 25 μl) da ciascun pozzetto e trasferirlo in un pozzetto corrispondente in una striscia di provette PCR fresca. Tenere i campioni sul ghiaccio e scartare le perline.
6. Controllo qualità
   1. Misura la concentrazione di DNA del DNA purificato della libreria. Per ottenere una migliore sensibilità, utilizzare un metodo basato sulla fluorescenza per quantificare il DNA in 1 μL.
7. Sequenziamento di nuova generazione
   NOTA: A seconda della capacità della piattaforma utilizzata e della quantità di dati di sequenziamento necessari per campione, le librerie indicizzate di diversi batch possono essere multiplexate in un'unica esecuzione di sequenziamento.
   1. Prima di raggruppare i campioni, regolare la concentrazione di DNA di ciascun campione a 5 ng/μL. Raggruppare le librerie in quantità equimolari per mantenere una rappresentazione bilanciata.
   2. Sequenziare le librerie preparate utilizzando un sistema di sequenziamento a lettura breve ad alta produttività con, ad esempio, una configurazione di lettura paired-end a 150 bp (vedere la Tabella dei materiali).

Tabella 9: Programma del termociclatore per l'ibridazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 10: Preparazione della soluzione di blocco di RNasi. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 11: Preparazione della miscela di ibridazione della sonda. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 12: Programma di termociclatore PCR post-acquisizione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 13: Preparazione della miscela di reazione PCR post-cattura. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Risultati

Uno studio sull'epidemia di LGV di C. trachomatis a Buenos Aires, in Argentina, ha mostrato alcune nuove caratteristiche nei campioni, vale a dire, 10 sostituzioni nucleotidiche nel gene ompA rispetto al genotipo L1 di ompA e un'insolita sequenza di tipo 2 Multi-Locus Sequence Typing (MLST)^17,18,19. Abbiamo mirato a studiare i genomi di questi campioni clinici, inserendoli nel contesto dei dati globali. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo confrontato le prestazioni di un approccio di arricchimento target con il sequenziamento metagenomico diretto per WGS di IST batteriche da campioni clinici, nel tentativo di superare le sfide poste da basse cariche batteriche e abbondante DNA umano e microbico.

Il DNA utilizzato proveniva da campioni di tampone rettale raccolti tra il 2017 e il 2023 a Buenos Aires, in Argentina, posti in terreno 2-SP (terreno saccarosio-fosfato) integrati con siero fetale di vitello (FCS) al 2% e antibiotici (gentamicina 25 μg/mL, vancomicina 0,5 mg/mL e amfotericina B 2,5 μg/mL) e conservati a -80 °C, oppure in pool uretrale, anorettale, e tamponi faringei raccolti presso l'Ospedale Universitario di Zurigo (USZ) in tampone NAAT (Nucleic Acid Amplification Tests). Il DNA dai campioni di Buenos Aires è stato estratto utilizzando un kit di estrazione manuale a base di silice, mentre il DNA dai campioni USZ è stato estratto utilizzando un sistema automatizzato basato su microsfere magnetiche.

Tutti i campioni clinici inclusi in questo studio sono stati confermati positivi da un test PCR multiplex in tempo reale sviluppato internamente (vedi Tabella dei materiali) con valori di soglia del ciclo qPCR (Ct) che variano come segue: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae: 24-31, T. pallidum: 27-36 e M. genitalium: 30-37. La concentrazione di DNA è stata quantificata utilizzando un test fluorimetrico ad alta sensibilità prima del sequenziamento per caratterizzare il materiale in ingresso dei campioni clinici (vedi Tabella dei materiali).

Per confrontare il sequenziamento metagenomico diretto con l'arricchimento del bersaglio, abbiamo utilizzato 32 campioni, di cui 29 erano positivi per C. trachomatis, nove per N. gonorrhoeae, cinque per T. pallidum e tre per M. genitalium. Il sequenziamento metagenomico diretto non ha portato ad alcun genoma completo e anzi ha raggiunto a malapena i dati target al di sopra del basale osservato nei campioni negativi. L'arricchimento del bersaglio con ibridazione a 65 °C ha portato a risultati di gran lunga migliori per ciascun patogeno e in molti casi sono stati ottenuti genomi di successo con questo metodo (Figura 1).

Per valutare la selezione ottimale del campione per l'arricchimento target, abbiamo valutato la relazione tra i valori diagnostici di qPCR Ct e l'efficienza del recupero del genoma, misurata dalla percentuale di letture on-target (%OTR). Questa metrica riflette la proporzione di letture di sequenziamento che mappano il genoma dell'organismo bersaglio ed è comunemente utilizzata per valutare le prestazioni di arricchimento. È stata trovata una correlazione significativa tra il carico patogeno e il successo del sequenziamento per C. trachomatis, con un cut-off Ct per il successo intorno a Ct30. Sebbene i dati per gli altri patogeni bersaglio fossero limitati, è stata osservata una tendenza simile, in cui il successo del sequenziamento del genoma si è verificato prevalentemente in campioni con carico patogeno inferiore a Ct30 (Figura 2).

Questo esperimento con una temperatura di ibridazione di 65 °C ha fornito tassi di successo del sequenziamento del genoma con un arricchimento target del 75%-80% per C. trachomatis, N. gonorrhoeae e T. pallidum, sulla base di campioni con valori di Ct inferiori a 30. I tre campioni positivi di M. genitalium avevano valori Ct di 30-37 e hanno raggiunto una copertura genomica e una profondità di lettura media inferiori. Al fine di migliorare questi risultati, abbiamo sperimentato la riduzione della temperatura di ibridazione, che migliora l'ibridazione a causa del basso contenuto di %G+C nel genoma di M. genitalium . Utilizzando temperature di ibridazione più basse, come la temperatura ora raccomandata di 62,5 °C, possiamo migliorare il recupero dei genomi di M. genitalium senza compromettere il recupero di altri genomi (Figura 3). Questi risultati dimostrano che l'arricchimento del bersaglio è un approccio efficace per ottenere preziose informazioni genomiche da campioni clinici e può essere adattato a un'ampia gamma di genomi, anche attraverso un disegno basato su pannelli.

L'analisi filogenetica dei genomi arricchiti con successo di C. trachomatis ha mostrato che la maggior parte dei campioni di Buenos Aires si raggruppa all'interno del clade ompA-genotipo L2b, suggerendo un lignaggio di successo con circolazione globale. L'analisi ha anche rivelato la presenza di un nuovo lignaggio distinto in Argentina, che causa l'LGV. I campioni di questo clade differiscono di circa 600 SNP dagli altri lignaggi LGV, e questo lignaggio è proposto come ompA-genotipo L4 (Figura 4). Una descrizione dettagliata dei campioni utilizzati nella Figura 1, Figura 2 e Figura 4 è fornita nella Tabella supplementare 1.

Questi risultati sottolineano il valore dell'arricchimento del bersaglio nello studio della diversità dei patogeni e dimostrano un alto grado di successo del sequenziamento del genoma da campioni clinici.

Figura 1: Arricchimento dei genomi utilizzando l'arricchimento del bersaglio rispetto al sequenziamento metagenomico diretto. La percentuale di reads on-target (%OTR), definita come la percentuale di reads di sequenziamento mappate sul genoma dell'organismo target, mostra il grado di arricchimento raggiunto con l'arricchimento target. La linea rappresenta la mediana di tutti i punti dati e la casella indica l'intervallo interquartile (IQR) del 50%. I colori dei punti dati corrispondono alla fonte del campione: azzurro pallido per l'Argentina e rosso per la Svizzera. Il successo del sequenziamento del genoma, definito come copertura >95% e profondità media di lettura >10, è rappresentato da punti grandi, mentre il fallimento è indicato da punti piccoli. Notare le diverse scale sull'asse y. Abbreviazioni: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Questa cifra è stata modificata da¹⁰. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Correlazione della %OTR dall'arricchimento del target con i valori diagnostici di qPCR Ct. I colori dei punti dati rappresentano la fonte del campione: azzurro pallido per l'Argentina e rosso per la Svizzera. Il successo del sequenziamento del genoma, definito come copertura >95% e profondità media di lettura >10, è indicato da punti grandi, mentre il fallimento è rappresentato da punti piccoli. Notare le diverse scale sull'asse y. Abbreviazioni: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Questa cifra è stata modificata da¹⁰. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Effetto della temperatura di ibridazione sul recupero di genomi completi in tutti i patogeni batterici IST in dieci campioni. Il DNA umano nell'intervallo di quello nei campioni clinici è stato addizionato con concentrazioni note di DNA batterico bersaglio separatamente (singolo) e anche complessivamente per rappresentare un campione con infezioni multiple (aggregato). Sono stati eseguiti due esperimenti, ciascuno con i cinque patogeni/combinazioni: 0,01% e 0,03% per rappresentare la percentuale approssimativa di DNA di ciascun microrganismo rispetto al DNA totale nel campione (il DNA rimanente corrisponde al DNA umano). Il recupero di M. genitalium è migliorato a temperature più basse. C. trachomatis Il DNA è stato addizionato a una bassa concentrazione; ulteriori esperimenti dimostrano che le temperature non hanno influenzato il recupero dei genomi di C. trachomatis (dati non mostrati). Abbreviazioni: CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Filogenesi aggiustata per la ricombinazione di ceppi di LGV provenienti dall'Argentina. L'analisi include tutti i genomi LGV disponibili con i dati pubblicati. I metadati visualizzati a destra della filogenesi includono campioni di pazienti duplicati, analisi bayesiana della struttura della popolazione (BAPS; cluster = clade, con il cluster polifiletico BAPS 6 che rappresenta la diversità genetica della popolazione), metodo di sequenziamento del genoma (dati di questo studio), genotipo ompA , paese e anno, come indicato nella chiave in alto a sinistra. I dati mancanti vengono visualizzati in bianco. I nomi dei genomi di questo studio sono evidenziati in blu chiaro per l'Argentina e in blu scuro per la Finlandia (non ottenuti mediante arricchimento del bersaglio). Questi colori sono utilizzati esclusivamente per distinguere i genomi generati in questo studio. I valori di bootstrap di 1000 bootstrap ultraveloci vengono visualizzati come percentuali sui rami principali. Questa cifra è stata modificata da¹³. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Descrizione dei materiali, dei reagenti, degli strumenti e delle attrezzature utilizzati nello studio. La tabella include informazioni dettagliate sul nome commerciale, il produttore e il numero di catalogo dei componenti utilizzati per l'estrazione del DNA, la preparazione della libreria, l'arricchimento del bersaglio e il sequenziamento. Include anche articoli utilizzati per i saggi qPCR interni e le procedure di biologia molecolare generale. Alternative equivalenti possono essere utilizzate per gli articoli contrassegnati da un asterisco (*). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

La generazione di dati completi sul genoma batterico da campioni clinici è particolarmente impegnativa. Eppure abbiamo bisogno di questi dati per ottenere informazioni sui cloni circolanti e per studiare i profili di resistenza antimicrobica, in particolare nei batteri esigenti e difficili da coltivare. Utilizzando metodi alternativi come il sequenziamento profondo o il sequenziamento adattivo con Oxford Nanopore Technologies, non è possibile ottenere dati sufficienti per l'analisi della sequenza dell'intero genoma. In casi come i campioni di IST, l'arricchimento del bersaglio è la tecnica ottimale per accedere all'intero genoma e questo metodo può essere utilizzato su un pannello di patogeni batterici IST. Sebbene non sia una procedura economica, i risultati che può offrire non possono essere ottenuti in nessun altro modo¹⁰.

I campioni appropriati devono essere selezionati con cura, idealmente per rispondere a domande pertinenti e importanti nella diagnostica e nella ricerca. Il mezzo utilizzato per la raccolta non gioca necessariamente un ruolo critico, con sequenze di successo ottenute sia da supporti 2-SP che NAAT. La conservazione dei campioni è importante, con l'obiettivo di mantenere l'integrità del DNA. Il fattore più importante è risultato essere il carico diagnostico, con l'obiettivo di ottenere valori di Ct approssimativi inferiori a Ct30. Per i campioni con valori di Ct superiori a 30, il successo del sequenziamento completo del genoma è meno probabile, ma in alcuni casi i dati parziali possono fornire informazioni rilevanti.

La procedura non è banale, e prevede molti passaggi tra cui cicli di PCR, ibridazione e molti lavaggi delle perline. Per ottenere risultati ottimali è necessaria un'attenta attenzione alla procedura. Le fasi critiche del protocollo - frammentazione del DNA, ibridazione con sonde di cattura e cattura basata su biglie magnetiche con lavaggio - richiedono un'attenta esecuzione e una corretta gestione. Il protocollo può essere appreso da ricercatori e tecnici dopo un paio di tentativi. Nei primi turni, durante l'apprendimento, il protocollo di 3 giorni può essere un vantaggio; Con utenti più esperti, il protocollo di 2 giorni può accelerare i risultati. Poiché i reagenti sono costosi, può valere la pena eseguire un test senza i componenti costosi, ad esempio le sonde. Per set di esche alternativi, la temperatura di ibridazione può essere regolata, il che può migliorare la sensibilità o la specificità dell'arricchimento. Se vengono generati dati sufficienti e si osserva una percentuale considerevole di duplicati PCR, è possibile regolare anche il numero di cicli PCR pre-acquisizione e post-acquisizione.

I dati ottenuti da questi esperimenti possono essere utilizzati per la tipizzazione, con MLST e altri target pertinenti estratti. Può essere ulteriormente analizzato in un contesto epidemiologico, a livello globale o locale, confrontandolo con genomi rilevanti per approfondimenti contemporanei. La ricombinazione e l'analisi degli elementi mobili in tutto il genoma deducono anche cambiamenti nel tempo e sotto pressione selettiva e possibili co-infezioni. Con dati sufficienti e metadati associati, è possibile effettuare calcoli temporali e dedurre gli antenati di caratteristiche e lignaggi specifici, nonché possibili vie e meccanismi di trasmissione. Tutti questi progressi nella nostra conoscenza di un importante gruppo di agenti patogeni possono informare le strategie di salute pubblica. Il nostro protocollo e i risultati rappresentativi mostrano l'uso di set di sonde target del pannello sindromico, che sono efficaci nei campioni batterici di IST e potrebbero essere estesi ad altri tipi di campioni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
pipetta 8 canali 0,5-10 &; micro; L	Eppendorf	3125000010	Eppendorf Research  più, 8 canali, 0,5-10 e micro; L, grigio medio, volume variabile.
pipetta 8 canali 10-100 µ L	Eppendorf	3125000036	Eppendorf Research  più, 8 canali, 10-100 e micro; L, giallo, volume variabile.
Adattatore Oligo Mix per librerie con tag MBC	Tecnologie Agilent	5500-0147	Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (pre PCR).
Sistema automatizzato di estrazione dell'acido nucleico con un kit di estrazione del DNA virale/patogeno	Qiagen	937036 (kit) / 9001297 (strumento)	Strumento QIAsymphony SP/AS utilizzato con il kit virus/patogeno QIAamp DSP per l'estrazione automatizzata del DNA.
Buffer di associazione	Tecnologie Agilent	5190-9687	Parte del kit di arricchimento del bersaglio SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (post PCR).
Kit di estrazione del DNA e strumento automatizzato	Società di ricerca Zymo	D3024/D3025	Kit Quick-DNA Miniprep utilizzato per l'estrazione totale del DNA da campioni clinici. Compatibile con il flusso di lavoro manuale o automatizzato.
End Repair: un mix di enzimi di coda	Tecnologie Agilent	5500-0147	Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (pre PCR).
Termina la riparazione del buffer di coda	Tecnologie Agilent	5500-0147	Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (pre PCR).
Etanolo	VWR Prodotti chimici BDH	20816.298	Etanolo assoluto ≥ 99,5% Ph. Eur., USP
Fluorimetro con saggio dsDNA ad alta sensibilità / Metodo basato sulla fluorescenza per quantificare il DNA	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	Q33238, Q33231	Fluorimetro Qubit 4 con kit di test 1X dsDNA ad alta sensibilità (HS).
Buffer di frammentazione	Tecnologie Agilent	5191-4080	Parte del kit di frammentazione enzimatica SureSelect con il nome ''5X Fragmentation Buffer''.
Enzima di frammentazione	Tecnologie Agilent	5191-4080	Parte del kit di frammentazione enzimatica SureSelect.
Tampone DNA polimerasi ad alta fedeltà	Tecnologie Agilent	5500-0147	Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (Pre PCR) con il nome ''Herculase II Buffer''.
Tampone DNA polimerasi ad alta fedeltà con dNTP (5X)	Tecnologie Agilent	5190-9687	Parte del kit di arricchimento del bersaglio SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con il nome ''Herculase II Buffer''.
Enzima di fusione ad alta fedeltà per l'amplificazione della PCR	Tecnologie Agilent	5191-5688	Parte del kit di arricchimento del bersaglio SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con il nome ''Herculase II''.
Tampone di lavaggio ad alta temperatura	Tecnologie Agilent	5190-9687	Parte del kit di arricchimento target SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con il nome ''Wash buffer 2''.
Tampone di ibridazione	Tecnologie Agilent	5500-0147	Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (pre PCR).
Primer di sequenziamento indicizzati	Tecnologie Agilent	5500-0147	Parte delle coppie di primer indice SureSelect XT HS2 1-96 per ILM (pre PCR).
Test PCR in tempo reale multiplex interno	Tib Molbiol	N/A	Test sviluppato e accreditato internamente basato su kit Lightmix per il rilevamento di IST
Tampone di legatura	Tecnologie Agilent	5500-0147	Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (pre PCR).
Perline magnetiche per la pulizia	Tecnologie Agilent	5191-5740	Perline SureSelect DNA AMPure XP.
Supporto magnetico	Articoli da laboratorio Permagen	MSRLV08	0.2mL PCR 8 Separatore Magnetico a Strisce 5 & micro; L ~0,2 ml di volume.
Sequenziamento di nuova generazione (NGS): sistema di sequenziamento a lettura breve ad alta produttività	Illumina, Inc.	N/A	Sequenziamento paired-end a 150 bp (PE150) eseguito su piattaforme Illumina NextSeq1000 e MiSeq.
Acqua priva di nucleasi	Bioconcetto	3-07F04-H	Acqua per Biologia Molecolare, senza DNA/DNAsi/RNasi, sterile, senza inibitori della PCR.
Mix di bloccanti di oligonucleotidi	Tecnologie Agilent	5500-0147	Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (pre PCR).
Striscia di provette per PCR	avantor, consegnato da VWR	732-3608	Strisce di provette per PCR con tappi piatti collegati.
Miscela di primer post-cattura	Tecnologie Agilent	5190-9687	Parte del kit di arricchimento del bersaglio SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (post PCR).
Sonda per RNA	Tecnologie Agilent	5191-6916	Sonda SureSelect Custom Tier4 6Mb-11.9Mb, ad es. ID progetto S3465164).
Bloccante della RNasi	Tecnologie Agilent	5500-0147	Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (pre PCR).
Tampone di lavaggio a temperatura ambiente	Tecnologie Agilent	5190-9687	Kit di arricchimento target SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) con il nome ''Wash buffer 1''.
Perline di streptavidina	Tecnologie Agilent	5191-5742	Perline di streptavidina SureSelect.
T4 DNA ligasi	Tecnologie Agilent	5500-0147	Parte del kit di preparazione della libreria SureSelect XT HS2 per ILM (Pre PCR) .
Metodo di arricchimento del bersaglio / Metodo di cattura del DNA	Tecnologie Agilent	G9983-90000	Kit DNA SureSelect XT HS2 con preparazione della libreria, arricchimento del target Fast-Hyb e flusso di lavoro di pooling post-acquisizione. Versione del protocollo F0, maggio 2023. Per Illumina Platform NGS
Sonda di arricchimento target impostata per C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum e M. genitalium	Agilent Technologies / Laboratorio di Microbiologia Arricchente (IMM, UZH)	ID disegno S3465164	Set di sonde progettato su misura (~242.000 sonde) per la cattura multiplex di quattro agenti patogeni IST. Progettazione basata su più genomi di riferimento.
Termociclatore	Thermofischer	4375305	Termociclatore a 96 pozzetti Veriti.