Questo studio si concentra sull'induzione sottocutanea in vivo di cellule tumorali colorettali luminescenti in un modello murino e sulla successiva misurazione della luminescenza utilizzando un sistema di imaging. La procedura mira a stabilire un modello di crescita tumorale riproducibile per il monitoraggio in tempo reale e la valutazione terapeutica.
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Articolo metodologico
Iniezione sottocutanea di cellule tumorali del colon-retto umano in topi nudi atimici per valutare l'efficacia antitumorale
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cancro del colon-retto (CRC) è una delle principali cause di decessi correlati al cancro in tutto il mondo, evidenziando l'urgente necessità di migliorare i modelli preclinici per valutare le potenziali terapie. I modelli animali sono essenziali per chiarire la biologia dei tumori e valutare nuovi interventi terapeutici. I modelli murini offrono vantaggi chiave rispetto ai modelli esistenti, tra cui la manipolabilità genetica, la riproduzione rapida, l'economicità e la disponibilità di ceppi immunocompetenti e immunodeficienti, consentendo una modellazione precisa dei tumori umani.
Questo protocollo si concentra sull'induzione sottocutanea della linea cellulare bioluminescente di cancro colorettale HCT-116 in un modello murino immunodeficiente, seguita da imaging a bioluminescenza non invasivo utilizzando il sistema IVIS e il calibro per monitorare la progressione e la crescita del tumore. L'utilizzo di cellule luminescenti fornisce un approccio quantificabile in tempo reale per monitorare lo sviluppo del tumore e la risposta agli interventi terapeutici, riducendo la necessità di procedure invasive. Per l'impianto delle cellule tumorali è necessaria una coorte di topi (n = 12) e l'intensità della luminescenza viene misurata per stabilire un modello standardizzato per i test terapeutici. Il volume del tumore viene in genere calcolato utilizzando solo le misure di lunghezza e larghezza o larghezza.
L'attuale metodologia garantisce l'insediamento coerente del tumore riducendo al minimo la variabilità, migliorando in ultima analisi l'affidabilità della valutazione preclinica. I risultati di questo studio contribuiranno a perfezionare i modelli tumorali per i test farmacologici e a migliorare il potenziale traslazionale della ricerca preclinica nelle applicazioni cliniche. Utilizzando tecniche di imaging avanzate e un disegno sperimentale riproducibile, questo studio mira a migliorare l'accuratezza e l'efficienza della valutazione dei farmaci in vivo per il trattamento del cancro del colon-retto.
Introduzione
Il cancro del colon-retto (CRC) è un importante onere sanitario globale, classificandosi tra le neoplasie maligne più diffuse e mortali1. Lo sviluppo di modelli preclinici affidabili è essenziale per valutare nuovi approcci terapeutici, poiché i saggi in vitro tradizionali non riescono a catturare completamente la complessità della crescita tumorale e della risposta ai farmaci in un sistema vivente. I modelli in vivo , in particolare i modelli murini, sono stati utilizzati per fornire preziose informazioni sulla biologia dei tumori, consentendo ai ricercatori di valutare l'efficacia di potenziali trattamenti in un ambiente controllato.
L'uso di cellule CRC luminescenti in modelli murini rappresenta un progresso significativo nella ricerca preclinica, consentendo il monitoraggio in tempo reale e non invasivo della progressione tumorale2. Questo studio mira a stabilire un protocollo standardizzato per l'induzione tumorale sottocutanea e l'imaging IVIS per monitorare dinamicamente la crescita del tumore. È stato scelto un modello di iniezione sottocutanea per la sua semplicità tecnica, riproducibilità e facilità di monitoraggio longitudinale del tumore. Sfruttando l'imaging a bioluminescenza, i ricercatori possono ottenere dati precisi e quantificabili sullo sviluppo del tumore e sulle risposte terapeutiche senza la necessità di sopprimere gli animali in più punti temporali3.
Il sistema di imaging IVIS è un potente strumento per valutare il carico tumorale con elevata sensibilità e specificità, migliorando la riproducibilità e l'accuratezza degli studi in vivo . Questo studio servirà come base per future valutazioni terapeutiche, fornendo un approccio standardizzato ed efficiente ai test farmacologici preclinici per il trattamento del cancro del colon-retto. Perfezionando i metodi di induzione tumorale e implementando tecniche di imaging avanzate, questa ricerca contribuisce a colmare il divario tra le applicazioni precliniche e cliniche in oncologia4.
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Protocollo
Gli animali sono stati mantenuti in condizioni specifiche prive di agenti patogeni secondo le linee guida stabilite dal comitato etico dell'Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria (IMIB, Murcia) (n. A13240502). Le ispezioni sono state condotte settimanalmente da personale qualificato in conformità al R. D. 1201/2005.
1. Animali
NOTA: Tutti gli animali devono essere trattenuti in modo sicuro prima dell'iniezione. Se si lavora con topi immunodeficienti (cioè topi atimici nudi come Crl: NU(NCr)-Foxn1nu), è essenziale mantenere la sterilità. Il presente studio ha utilizzato 12 topi nudi atimici, di 5 settimane di età (20-22 g per le femmine e 22-26 g per i maschi) all'inizio dell'esperimento (50% maschi). Tutte le procedure anestesiologiche e sperimentali sono state condotte nella Guía de Ética y Buena Práctica en Investigación del centro, con l'approvazione del comitato etico istituzionale (Protocollo n. A13240502) e in conformità con la legislazione spagnola (R.D. 1201/2005).
- Prima di iniziare il test, acclimatare i topi, di 4 settimane, al centro per animali per circa 1 settimana. Successivamente, eseguire le seguenti procedure.
2. Preparazione del brodo di D-luciferina
- Preparare una soluzione di lavoro da 15 mg/mL di substrato bioluminescente di sale di potassio D-luciferina in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) preriscaldata in una provetta conica all'interno di una cabina di biosicurezza. Capovolgere più volte il tubo per omogeneizzare bene la soluzione.
- Trasferire la soluzione attraverso un filtro per siringa da 0,2 μm per la sterilizzazione.
- Aliquotare la soluzione sterilizzata in microprovette opache da 1 mL e conservare a -20 °C.
NOTA: La luciferina è sensibile alla luce.
3. Preparazione della matrice extracellulare
- Scongelare l'idrogel di matrice extracellulare commerciale (ECM) privo di rosso fenolo per una notte su ghiaccio all'interno di un frigorifero a una temperatura compresa tra 2 °C e 8 °C5.
- Il giorno dell'iniezione, mantenere la ECM in ghiaccio e, utilizzando una micropipetta P1000 preraffreddata, aliquotare 200 μl di ECM in provette sterili.
NOTA: Si consiglia di utilizzare microprovette a foro largo. Ridurre al minimo le variazioni di temperatura ed evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo. - Preraffreddare le siringhe e gli aghi con ghiaccio prima di preparare le iniezioni per evitare sbalzi di temperatura improvvisi della MEC.
4. Distacco e conteggio delle celle
- Piastre di cellule bioluminescenti HCT-116 (linea cellulare ATCC CCL-247-LUC2) in fiasche T75 alcuni giorni prima dell'induzione del tumore per garantire un numero sufficiente di cellule. Mantenere la coltura cellulare a 37 °C, 5% di CO2 e, se necessario, sostituire il terreno6.
- Il giorno dell'esperimento, aspirare attentamente il terreno di coltura per evitare di disturbare le cellule aderenti.
- Lavare le cellule con 8 mL di PBS sterile (preriscaldato a 30 °C a bagnomaria) per rimuovere il siero residuo.
- Aggiungere 2 mL per pallone di Tripsina-EDTA calda (0,05%) e incubare a 37 °C per 4-5 min. Monitorare il distacco delle cellule al microscopio invertito. Se le cellule rimangono attaccate, picchiettare delicatamente il lato del pallone per facilitare il distacco.
- Neutralizzare la tripsina aggiungendo 10 ml di terreno di coltura completo contenente siero fetale bovino (FBS).
- Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL. Sciacquare i flaconi con altri 2 ml di terreno fresco per raccogliere eventuali cellule rimanenti e aggiungere i lavaggi nella provetta da 15 ml.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare con cura il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 3 mL di terreno di semina per ottenere una sospensione omogenea.
- Contate le cellule in una camera Neubauer o in un contatore automatico di cellule. Determinare la vitalità cellulare mescolando 10 μl di sospensione cellulare con 10 μl di blu di tripano e contare le cellule vitali al microscopio invertito.
NOTA: Preparare un numero sufficiente di cellule per lo studio: almeno 3 × 106 cellule vitali per topo. - Risospendere le cellule in PBS sterile (preriscaldato a 30 °C in bagnomaria) e modificare la concentrazione di cellule vitali a una concentrazione finale di 2 × 107 cellule/mL con PBS. Preparare aliquote da 200 μL.
5. Installare gli elementi dell'attrezzatura e anestetizzare gli animali.
- Accendere il sistema di imaging almeno 4 ore prima dell'imaging.
NOTA: Seguire le istruzioni del sistema per consentire la fase di inizializzazione, inclusa la regolazione delle impostazioni per l'intensità della luce e il tempo di esposizione della fotocamera in base al rapporto segnale/rumore. Questa impostazione deve essere impostata manualmente in base alle condizioni sperimentali. - Pesare gli animali e calcolare il volume di D-luciferina che deve essere somministrato (200 μL di una soluzione da 15 mg/mL per 20 g di animale).
- Pulire e disinfettare le camere di imaging e l'armadio.
- Identificare e trattenere in sicurezza ogni topo per l'anestesia.
NOTA: Indossare due paia di guanti per proteggere le mani da punture accidentali di aghi durante l'iniezione sottocutanea. - Anestetizzare i topi con isoflurano al 2% in ossigeno a un flusso di 1,8-2,0 L/min. Accendere la pompa di aspirazione contemporaneamente alla pompa per anestesia.
6. Preparazione delle cellule per l'iniezione
- Miscelare 200 μl di 2 ×10 7 cellule CRC bioluminescenti/mL con 200 μL di ECM in un crioviale all'interno di una cappa di biosicurezza. Pipettare delicatamente con una pipetta P1000 per evitare la formazione di bolle d'aria e la dissociazione.
- Trasferire la miscela da 400 μl in una siringa da 1 mL, rimuovere le bolle d'aria e procedere immediatamente all'iniezione.
- Stappare l'ago in modo sicuro, mantenendo sempre la sterilità dell'ago.
NOTA: Si consiglia di utilizzare aghi individuali per ogni animale per ridurre al minimo la contaminazione. Un nuovo ago viene utilizzato per ogni topo per prevenire l'infezione cross-mouse. - Inserire un ago da 25 G e regolare il contenuto della siringa a 200 μL, rimuovendo eventuali bolle d'aria.
NOTA: Le iniezioni vengono solitamente eseguite con 200 μl, portando a 2 × 106 cellule per iniezione. - Far scorrere l'ago di nuovo nel cappuccio senza stringere senza maneggiare né il cappuccio né l'ago mentre l'animale è trattenuto.
7. Induzione tumorale sottocutanea
- Rimuovere il topo dalla camera una volta anestetizzato e posizionare il muso dell'animale in una presa che fornisce lo stesso anestetico.
NOTA: Nel nostro caso, l'ugello è stato realizzato utilizzando un guanto. - Posiziona l'animale sul lato destro su una superficie piana. Usando la punta delle dita della mano non dominante, pizzicare delicatamente e sollevare la pelle dell'animale nel quadrante inferiore sinistro.
- Prima dell'iniezione, aspirare prima per garantire il posizionamento appropriato dell'ago. Inserire l'ago smussato con la mano dominante, per due terzi nella pelle sollevata, parallelamente al corpo, facendo molta attenzione a non pungere le dita o perforare i doppi guanti.
NOTA: Il posizionamento corretto dovrebbe produrre una pressione negativa e nessuna aspirazione nel mozzo dell'ago. - Iniettare il contenuto della siringa (200 μL) nella pelle sollevata, proprio tra le due dita. Tenere premuto brevemente prima di ritirare lentamente l'ago. Rimuovere l'ago dopo l'iniezione sottocutanea e gettarlo in modo sicuro in un contenitore per oggetti taglienti.
8. Iniezione intraperitoneale di D-luciferina
- Prima di rimettere l'animale nella camera di anestesia, somministrare D-luciferina per via intraperitoneale (IP) a una concentrazione di 150 mg/kg di peso corporeo con la soluzione madre da 15 mg/mL in una siringa da insulina da 30 G (200 μL per 20 g di animale).
NOTA: L'iniezione fino a 0,5 mL è ben tollerata. - Contenzione manuale, decubito dorsale (lato addome rivolto verso l'alto), con l'estremità cranica (testa) dell'animale rivolta verso il basso. Lasciare che il contenuto intestinale si muova verso il basso.
- Mantenendo l'ago con il lato smussato rivolto verso l'alto e leggermente angolato a 15-20°, spingere l'ago nella cavità addominale in modo che la punta dell'ago penetri appena nella parete addominale del quadrante addominale inferiore sinistro dell'animale.
- Iniettare lentamente la D-luciferina nella cavità intraperitoneale, rimuovere l'ago e gettarlo in modo sicuro.
- Metti il topo nella camera di anestesia e lascialo stabilizzare per circa 5 minuti. Dopo 15 minuti, procedere con l'imaging in vivo .
NOTA: Costruire una curva cinetica della D-luciferina per ogni nuovo modello animale per determinare il tempo di picco del segnale. Nel nostro caso, l'emissione di luce ha raggiunto il picco a circa 15 minuti nell'imaging in vivo .
9. Analisi di imaging in vivo
- Posizionare l'animale completamente anestetizzato nella camera del sistema di imaging, sul fianco destro. Assicurati che l'animale sia correttamente allineato con la fotocamera e la fonte di luce per catturare l'area del tumore.
- Aprire il software collegato. Scegli la modalità di imaging visivo o fotografico per confermare la posizione dell'animale. Salva i dati e modifica il nome della cartella.
- Scegli la modalità di imaging a bioluminescenza e impostala su automatica. Cattura immagini di bioluminescenza e monitora la luce del tumore sullo schermo del computer.
- Una volta completato l'imaging, rimetti l'animale nella sua gabbia e osserva eventuali complicazioni.
- Eseguire la post-elaborazione, prima scalare la luce bioluminescente in modo che tutti i tumori dei topi mostrino la stessa scala, solitamente tra 1e6 e1e 8.
- Imposta una regione di interesse (ROI) attorno al tumore per l'analisi e copiala per ulteriori analisi. Misura la luce del ROI ed esporta questi risultati per ulteriori analisi. Incolla il ROI precedentemente creato e copiato della stessa dimensione per i tumori successivi.
- Spegnere il sistema secondo le istruzioni del produttore e pulire la camera di imaging. Spegnere le pompe di estrazione e anestesia, insieme al flusso di ossigeno.
10. Misurazione del volume tumorale
- Anestetizzare gli animali con isoflurano per la misurazione del tumore. Metti l'animale in una posizione stabile e coprigli la testa. Immobilizza rapidamente l'animale.
- Misura la lunghezza, la larghezza e la profondità del tumore utilizzando un calibro digitale calibrato.
NOTA: Eseguire rapidamente le misurazioni, poiché l'animale inizierà a risvegliarsi circa 1 minuto dopo la rimozione dalla camera di anestesia. - Ripeti le misurazioni e calcola una media.
- Calcola il volume secondo la formula per i tumori sferici o ellittici:
Per tumori sferici 7
(1)
Per tumori ellissoidi 8
(2)
NOTA: Per ridurre al minimo il bias di misurazione, tutte le misurazioni del tumore all'interno dello studio devono essere eseguite dallo stesso operatore. Inoltre, va notato che il giorno dell'induzione del tumore, una misurazione accurata è spesso impegnativa perché la massa tumorale non è ancora completamente solidificata.
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Risultati
Questo protocollo consente l'introduzione di cellule umane in un modello murino immunodeficiente, consentendo la crescita di queste cellule tumorali in vivo, che è sempre più fisiologicamente rilevante che in vitro. È fondamentale garantire che le condizioni sperimentali siano il più riproducibili possibile, che i tumori contengano un numero simile di cellule vitali e che siano impiantati in una posizione comparabile e costantemente accessibile.
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Discussione
Il protocollo per l'induzione sottocutanea di cellule tumorali colorettali luminescenti in un modello murino nudo atimico presenta un approccio standardizzato e riproducibile per la formazione del tumore e il monitoraggio in tempo reale. Innanzitutto, è importante notare che tali studi sono in genere condotti nell'arco di 28 giorni, con misurazioni della luminescenza eseguite il giorno dell'induzione del tumore e successivamente settimanalmente. Al contrario, le misurazioni a calibro del...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che potrebbero influenzare il lavoro riportato in questo studio.
Ringraziamenti
ACS e CNN appartengono al "Programma di dottorato in Scienze della salute, Universidad Católica de Murcia (UCAM), Campus de los Jerónimos nº 135, Guadalupe 30107, Murcia, Spagna" e sono titolari di borse di dottorato dell'UCAM. Gli autori sono grati alle piattaforme Animal Facility dell'IMIB (Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria, Murcia), dove è stato condotto il test preclinico.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubi microtubulari opachi da 1 mL | Eppendorf | 30125215 | Conservazione della D-luciferina |
| Valvola conica da 15 mL | Falcon, Thermo Fisher Scientific | 11507411 | Materiale per colture cellulari |
| Dulbecco avanzato' s Eagle Medium Modificato (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 1152046 | Reagente per colture cellulari |
| Topo Nudo Atimico | Fiume Charles | Crl:NU(NCr)-Foxn1nu | Topo nudo immunodeficiente |
| Cellule bioluminescenti del cancro del colon umano HCT116 | ATCC | CCL-247-LUC2 | HCT 116-Luc2 è ideale per la bioluminescenza in vivo |
| D-luciferina Pierce | Thermo Fisher Scientific | 15215733 | Per la misurazione della bioluminescenza |
| Matrice Extracellulare (ECM) | Corning | 356231 | Matrigel Matrix per l'invasione cellulare |
| Siero bovino fetale | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Reagente per colture cellulari |
| Punte per pipette filtro | Finntip, Thermo Fisher Scientific | 94056710 | Per evitare la formazione di bolle d'aria |
| Siringa per insulina 25 g 1 mL | Iberomed | JERINRAYS29 | Per l'impianto di linea cellulare con HCT-116 |
| Siringa per insulina 30 G 0,5 mL | DH Material medico | 9.41652E+15 | Per l'amministrazione della D-luciferina |
| Sistema di immagini IVIS con software Living Image | PerkinElmer/Revvity | 128201 | Scanner per bioluminescenza e fluorescenza |
| Eparina Stericana ad Ago | VWR | 612-0153 10 | Somministrazione di D-luciferina e impianto di HCT-116 |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | VWR | 392-0042P | Soluzione di sospensione cellulare per il distacco e l'impianto di HCT-116 |
| Tripsina-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 11590626 | Reagente per colture cellulari |
| Fiaschetta T-75, trattata con TC | STARLAB | CC7682-41 | Materiale per colture cellulari |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
