Method Article

Imaging 3D ad alta risoluzione e analisi con apprendimento automatico senza marcatura di organoidi intestinali tramite olotomografia a bassa coerenza

DOI:

10.3791/68529

⸱

August 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Stem Cell and Regenerative Biology, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2Division of Pulmonary and Allergy Medicine, Department of Internal Medicine, Chungnam National University Hospital, 3Department of Physics, KAIST, 4KAIST Institute for Health Science and Technology, KAIST, 5Tomocube Inc., 6Center for Genome Engineering, Institute for Basic Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un protocollo passo-passo per l'imaging tridimensionale e ad alta risoluzione, label-free di organoidi utilizzando l'olotomografia a bassa coerenza. Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione della coltura di organoidi, l'acquisizione di immagini e l'analisi computazionale delle immagini, consentendo la visualizzazione in tempo reale delle dinamiche strutturali e delle risposte ai farmaci negli organoidi viventi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'imaging accurato e privo di marcatura degli organoidi intestinali è fondamentale per studiarne la morfologia, le dinamiche di crescita e le risposte agli stimoli ambientali. L'olotomografia (HT) fornisce una visualizzazione tridimensionale (3D) ad alta risoluzione di organoidi vivi senza la necessità di marcatori fluorescenti, riducendo così al minimo la fototossicità e preservando l'integrità del campione. L'imaging basato sulla fase in tempo reale consente il monitoraggio continuo e senza etichette delle modifiche strutturali e funzionali. Utilizzando l'indice di rifrazione come contrasto intrinseco di imaging, questo metodo consente la quantificazione di proprietà biofisiche come il volume, la densità e il contenuto proteico. I dati di imaging vengono ulteriormente elaborati attraverso la segmentazione basata sull'apprendimento automatico e l'estrazione delle caratteristiche per supportare un'analisi coerente e ad alto rendimento. Questo protocollo descrive in dettaglio il flusso di lavoro sperimentale completo per l'impiego dell'HT a bassa coerenza nella ricerca sugli organoidi, coprendo la preparazione degli organoidi, l'acquisizione di immagini e l'analisi dei dati basata sull'apprendimento automatico. Integrando la segmentazione computazionale e le valutazioni quantitative, questo approccio consente una valutazione imparziale delle proprietà chiave degli organoidi, tra cui la vitalità, l'organizzazione strutturale e la risposta ai farmaci. La capacità di catturare i cambiamenti morfologici in tempo reale alla risoluzione subcellulare rende questo protocollo altamente applicabile agli studi basati su organoidi in medicina rigenerativa, modellazione delle malattie e screening farmaceutico. La metodologia passo dopo passo qui delineata facilita la riproducibilità e l'ampio adattamento tra diversi sistemi di organoidi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli organoidi sono versioni miniaturizzate tridimensionali (3D) di organi cresciuti da cellule staminali, in grado di ricapitolare le caratteristiche strutturali e funzionali chiave degli organi reali in vitro1. I ricercatori hanno sviluppato sistemi di organoidi per un'ampia gamma di tessuti, tra cui intestino, cervello, polmone, fegato e reni, ognuno dei quali dimostra l'architettura auto-organizzante e la diversità dei tipi di cellule che ricordano la sua controparte in vivo . Rispecchiando l'architettura degli organi nativi e la complessità multicellulare, gli organoidi fungono da potenti sistemi modello per lo studio dello sviluppo umano, della rigenerazione dei tessuti e dei meccanismi di malattia1. Sono diventati strumenti fondamentali per la modellazione delle malattie e la scoperta di farmaci, consentendo ai ricercatori di esplorare i percorsi delle malattie e testare nuove terapie su tessuti 3D specifici per il paziente in laboratorio2. In particolare, gli organoidi sono promettenti anche nella medicina rigenerativa3: i tessuti derivati da organoidi possono essere innestati in vivo per riparare i danni, come dimostrato con gli organoidi intestinali ed epatici, sottolineando il loro potenziale per il ripristino della funzione degli organi4. Questa versatilità rende gli organoidi indispensabili nella moderna ricerca biomedica e nella medicina personalizzata.

Data la loro composizione multicellulare e la complessità strutturale 3D, l'acquisizione e l'analisi della dinamica degli organoidi è fondamentale. Tuttavia, le tecniche di imaging convenzionali incontrano limitazioni significative nella risoluzione delle strutture e delle dinamiche degli organoidi, spesso producendo istantanee 2D che non riescono a rappresentare il loro stato fisiologico completo5.

La microscopia in campo chiaro è un metodo ampiamente utilizzato e non invasivo per la cattura di organoidi. Monitora comodamente la crescita e la morfologia, ma fornisce un contrasto limitato in campioni 3D non colorati. Inoltre, manca il sezionamento ottico, con conseguente scarsa risoluzione delle strutture interne. Gli organoidi appaiono in gran parte trasparenti, ostacolando il rilevamento di caratteristiche fini sotto la superficie6. Il contrasto di fase migliora la visibilità convertendo gli spostamenti di fase in differenze di intensità, rivelando l'architettura generale (ad esempio, un lume centrale) senza macchie. Nonostante la sua utilità per l'osservazione in tempo reale, il contrasto di fase soffre di artefatti dell'alone, bassa risoluzione e profondità di penetrazione limitata, il che lo rende meno efficace per organoidi più spessi7.

Il sezionamento seriale seguito dalla colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) e dall'immunocolorazione basata su anticorpi è ampiamente utilizzato per analizzare la microstruttura degli organoidi e la composizione cellulare8. Le tecniche di lavorazione dei tessuti migliorate, come l'inclusione di paraffina fissata in formalina (FFPE) e la criosezione, migliorano la conservazione della morfologia, con FFPE che offre risultati superiori9. L'inclusione di organoidi in idrogel come l'agarosio e la centrifugazione allinea più campioni in un'unica sezione, migliorando l'efficienza dell'analisi. Le sezioni colorate con H&E di organoidi tumorali derivati da pazienti riflettono l'istologia tumorale originale, mentre la colorazione in immunofluorescenza evidenzia marcatori come CK8 per l'identificazione cellulare10. Tuttavia, queste tecniche non sono in grado di monitorare gli organoidi vivi e possono introdurre artefatti come rughe o deformazioni dei tessuti durante il sezionamento.

La microscopia a fluorescenza confocale è ampiamente utilizzata per l'imaging degli organoidi, producendo sezioni ottiche ad alta risoluzione (sub-micrometriche) che consentono una visualizzazione dettagliata dell'architettura degli organoidi e della composizione cellulare11,12. Tuttavia, l'imaging confocale di organoidi 3D è in genere limitato agli strati superficiali (fino a 100 μm di profondità) e può richiedere molto tempo ed essere fototossico a causa dell'illuminazione laser a scansione puntiforme13. La microscopia a fluorescenza a foglio di luce (LSFM) supera alcune di queste limitazioni illuminando solo il piano di imaging, ottenendo un rapido imaging volumetrico di interi organoidi con fotosbiancamento e fototossicità minimi14,15; Tuttavia, questa tecnica richiede spesso la pulizia dei tessuti per un imaging ottimale di campioni spessi. Inoltre, la profondità di imaging LSFM è limitata dalla dispersione della luce e dalle discrepanze dell'indice di rifrazione (RI), che possono essere mitigate attraverso l'ottica adattiva, l'imaging multi-vista e le lunghezze d'onda di eccitazione ottimizzate16. Il montaggio dei campioni introduce anche deformazioni strutturali, mentre i set di dati 3D di grandi dimensioni pongono sfide computazionali nell'archiviazione e nell'analisi. I recenti progressi, tra cui il miglioramento delle tecniche di marcatura genetica, i nuovi reagenti di chiarificazione, l'ottica adattiva e l'analisi delle immagini basata sull'intelligenza artificiale, stanno affrontando queste limitazioni, rendendo la LSFM sempre più fattibile per la ricerca sugli organoidi7.

Nonostante questi progressi, le tecniche di imaging a fluorescenza 3D pongono diverse sfide per il monitoraggio a lungo termine di organoidi vivi. In primo luogo, l'uso della marcatura fluorescente introduce effetti fototossici e perturba i processi biologici, ponendo sfide per studi di imaging dal vivo prolungati17. In secondo luogo, la marcatura basata su anticorpi soffre di una penetrazione limitata a causa delle barriere di diffusione all'interno di strutture organoidi dense, che richiedono metodi avanzati di permeabilizzazione e pulizia dei tessuti, che richiedono più di 10 giorni di incubazione per l'uso di anticorpi di primo e secondogrado 18. In terzo luogo, la trasfezione e l'espressione stabile di proteine fluorescenti negli organoidi rimangono inefficienti, poiché gli approcci convenzionali di consegna genica lottano con gli ambienti 3D19. In quarto luogo, le tecniche di chiarificazione ottica, essenziali per l'imaging profondo, spesso portano alla perdita del segnale di fluorescenza e alla distorsione dei tessuti, richiedendo protocolli di chiarificazione ottimizzati che bilanciano la trasparenza e la conservazione della fluorescenza20.

Per ovviare a queste limitazioni, l'olotomografia (HT) è stata introdotta come tecnica per l'imaging di organoidi vivi non marcati con un'alta risoluzione nel tempo. Conosciuta anche come imaging di fase quantitativa 3D, l'HT è una modalità ad alta risoluzione senza marcatura che consente la visualizzazione quantitativa in tempo reale degli organoidi preservandone lo stato fisiologico nativo. Il principio della HT è analogo alla tomografia computerizzata a raggi X; catturando più immagini del campo ottico 2D in varie condizioni di illuminazione, la distribuzione RI 3D di un campione non etichettato viene ricostruita attraverso la risoluzione dell'equazione d'onda inversa 21,22,23. L'HT è stata ampiamente applicata in vari campi biologici, tra cui l'ematologia24,25, la condensazione di fase nella biologia cellulare26, la microbiologia27 e l'istopatologia28. Più recentemente, la sua capacità di imaging 3D ad alta risoluzione e senza marcatura è stata sempre più utilizzata per la ricerca sugli organoidi 21,22,23,29, offrendo un approccio non invasivo allo studio delle loro dinamiche strutturali e funzionali.

In questo studio, presentiamo un protocollo dettagliato per l'uso dell'HT a bassa coerenza nel monitoraggio a lungo termine e senza marcatura degli organoidi intestinali (sIO) di topo. Questo metodo consente la visualizzazione in tempo reale della crescita degli organoidi e delle risposte ai farmaci nell'arco di 24 ore, fornendo al contempo misurazioni quantitative del volume degli organoidi, della densità e del contenuto proteico, facilitando un'analisi rigorosa e basata sui dati del comportamento degli organoidi. Per studiare le alterazioni morfologiche negli organoidi, abbiamo trattato i campioni con cisplatino, un agente chemioterapico a base di platino noto per indurre l'apoptosi formando legami incrociati del DNA e inibendo la replicazione cellulare30. Mentre l'imaging RI 3D acquisisce i dettagli strutturali, l'analisi sistematica è essenziale per quantificare la dinamica degli organoidi. Per raggiungere questo obiettivo, integriamo ilastik, un toolkit di segmentazione basato sull'apprendimento automatico31 per differenziare le regioni degli organoidi dallo sfondo. Questo protocollo delinea il flusso di lavoro completo, compresa la preparazione della coltura di organoidi, l'acquisizione HT 3D, la segmentazione basata sull'apprendimento automatico e l'analisi quantitativa dai tomogrammi RI. Offrendo un framework di imaging scalabile, riproducibile e non invasivo, questo approccio stabilisce un nuovo standard per la ricerca sugli organoidi con ampie applicazioni nella modellazione delle malattie, nella medicina rigenerativa e nello screening dei farmaci.

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Protocol

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NOTA: I dettagli relativi a tutti i materiali, gli strumenti e il software utilizzati in questo protocollo sono forniti nella Tabella dei materiali. In alternativa possono essere utilizzati prodotti equivalenti di produttori diversi. Nella Figura 1 viene presentato un processo schematico dell'intero protocollo.

1. Preparazione del campione

  1. Preparazione del terreno di coltura sIO
    1. Preparare il terreno di coltura disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore. Sterilizzare il terreno di coltura filtrandolo attraverso un'unità filtrante da 0,22 μm.
      NOTA: Se il terreno viene preparato interamente in condizioni sterili in una cappa per colture cellulari e tutti i componenti sono pre-sterilizzati (ad esempio, forniti in flaconi e fiale sterili), la filtrazione attraverso un filtro da 0,22 μm potrebbe non essere strettamente necessaria.
    2. Aliquotare 15 mL di terreno preparato in provette sterili. Riscaldare il terreno aliquotato a temperatura ambiente (15 - 25 °C) prima dell'uso in coltura di organoidi.
  2. Scongelamento delle scorte sIO
    1. Scongelare rapidamente il brodo di organoide congelato entro 2 minuti utilizzando un bagnomaria a 37 °C. Trasferire la sospensione di organoidi scongelata in una provetta da microcentrifuga e centrifugare a 150 x g per 3 minuti per pellettare gli organoidi.
    2. Rimuovere con cura il surnatante per eliminare il DMSO, riducendo al minimo i potenziali effetti citotossici.
    3. Aggiungere il terreno e la matrice extracellulare fresca (ECM) in un rapporto 1:4 e pipettare delicatamente per garantire una risospensione uniforme del pellet. Erogare 15 μl per cupola in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. Mantenere l'ECM sul ghiaccio per prevenire la polimerizzazione prematura.
    4. Posizionare la piastra capovolta in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 1 ora per consentire la polimerizzazione ECM. Dopo la polimerizzazione, aggiungere con cautela 200 μl di terreno fresco a ciascun pozzetto.
      NOTA: Questo protocollo è compatibile con varie piastre di imaging e piastre a pozzetti commerciali. Regolare il volume del supporto in base al tipo di pozzetto per assicurarsi che la cupola ECM sia completamente sommersa.
  3. Superamento delle sIO
    NOTA: Gli organoidi tendono ad aderire ai puntali delle pipette. Per ridurre al minimo l'aderenza, pre-bagnare i puntali delle pipette con il mezzo.
    1. Aspirare il mezzo esaurito. Aggiungere 200 μl di soluzione di recupero cellulare a ciascun pozzetto e incubare a 4 °C per 30 minuti per facilitare la degradazione della ECM e il recupero degli organoidi.
    2. Raccogliere la sospensione di organoidi mediante pipettaggio delicato e trasferirla in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare a 150 x g per 3 minuti, quindi rimuovere con cura il surnatante.
    3. (Facoltativo) Per il passaggio come singole cellule, eseguire uno dei seguenti metodi di dissociazione:
      1. Metodo enzimatico: Aggiungere 100 μL di soluzione di dissociazione a singola cellula al pellet e incubare a 37 °C, incubatore al 5% di CO2 per 1-2 minuti. Aggiungere 150 μL di terreno per neutralizzare. Eseguire il pipettaggio o la picchiettatura delicata. Centrifugare a 150 x g per 3 min e rimuovere il surnatante, lasciando solo il pellet.
        NOTA: Evitare l'incubazione eccessiva, poiché l'esposizione prolungata può essere altamente dannosa per le cellule.
      2. Dissociazione meccanica: Risospendere il pellet in 200 μL di terreno di coltura. Utilizzando una pipetta P200, pipettare su e giù 20x-30x per dissociare meccanicamente gli organoidi in frammenti più piccoli o singole cellule. Centrifugare a 150 x g per 3 min, quindi aspirare il surnatante e trattenere il pellet.
    4. Aggiungere il terreno e l'ECM fresco in rapporto 1:4 e pipettare delicatamente per garantire una risospensione uniforme del pellet. Erogare 15 μl per cupola in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti.
    5. Posizionare la piastra capovolta in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 1 ora per consentire la polimerizzazione dell'ECM.
    6. Dopo la polimerizzazione, aggiungere 200 μl di terreno di coltura fresco a ciascun pozzetto e riempire i pozzetti esterni vuoti con PBS per evitare l'evaporazione. Sostituire il terreno di coltura ogni 2-3 giorni e passare gli organoidi settimanalmente. Regolare l'intervallo di passaggio in base alla dimensione dell'organoide desiderata.
  4. Trattamento della tossicodipendenza
    1. Preparare una soluzione madre da 10 mM di cisplatino sciogliendo 3,00 mg di polvere di cisplatino (MW ≈ 300,05 g/mol) in 1 mL di DMSO. Agitare brevemente e proteggere la soluzione dalla luce utilizzando tubi di ambra o avvolgendoli con un foglio di alluminio.
    2. Per preparare il terreno di trattamento, diluire il 10 mM di cisplatino 1:1.000 in un terreno di coltura sIO completo per ottenere una concentrazione finale di 10 μM di cisplatino e 0,1% di DMSO.
    3. Per il controllo del veicolo, preparare lo 0,1% di DMSO in terreno di coltura in modo che corrisponda alla concentrazione finale di DMSO senza cisplatino.
    4. Rimuovere il terreno esaurito dalle colture sIO e sostituirlo delicatamente con un terreno contenente cisplatino da 10 μM o con un terreno di controllo solo DMSO.
    5. Dopo il trattamento, trasferire i campioni nell'incubatore del sistema di imaging.

2. Imaging olotomografico a bassa coerenza utilizzando software operativo

  1. Preparazione del campione per l'imaging
    1. Erogare 15 μl di cupola organoide-ECM sulla capsula di imaging #1.5 del vetrino coprioggetti seguendo la procedura descritta nei passaggi 1.3.1-1.3.4. Posiziona ogni cupola nel piatto il più vicino possibile al centro per ottenere un'immagine ottimale.
    2. Prima della polimerizzazione, incubare a temperatura ambiente per 1 minuto per consentire agli organoidi di depositarsi sul fondo.
    3. Posizionare la piastra capovolta in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 1 ora per polimerizzare l'ECM. Quindi, aggiungere delicatamente una quantità sufficiente di terreno di coltura per immergere completamente gli organoidi.
      NOTA: Regolare il volume medio per assicurarsi che gli organoidi siano completamente immersi in base alle dimensioni della capsula di imaging con fondo del vetrino.
    4. A 5 giorni dal passaggio, lavare il campione 2x-3x con PBS immediatamente prima dell'imaging per rimuovere i detriti e ridurre gli artefatti ottici.
  2. Configurazione dell'imaging
    1. Accendere il controller ambientale per mantenere la vitalità del campione. L'unità di controllo della camera regola automaticamente la temperatura a 37 °C e la concentrazione di CO2 al 5%.
    2. Premere il pulsante Sportello sulla parte anteriore dello strumento per aprire lo sportello. Aggiungere acqua per formare uno strato sottile all'interno della camera per evitare che il terreno di coltura si secchi.
    3. Posizionare la capsula di imaging in un apposito supporto del recipiente, inserirla nella camera di imaging e fissarla con uno spillo per impedirne il movimento. Assicurarsi che il piatto sia saldamente fissato al supporto del recipiente senza inclinarsi.
    4. Chiudere lo sportello dello strumento utilizzando il pulsante Sportello per bloccare le interferenze luminose esterne.
    5. Avvia il software TomoStudio X e accedi. Fare clic su Avvia per aprire la finestra principale.
    6. Fai clic su Aggiungi progetto nell'angolo in alto a sinistra e assegna i parametri sperimentali (ad esempio, nome del progetto, tipo di supporto, tipo di campione, ecc.). Il pannello dei campioni verrà creato automaticamente. Assicurarsi che sia assegnato il tipo di mezzo corretto per l'uso dell'istanza riservata appropriata nell'esperimento.
    7. Fare clic sul pozzetto desiderato nel pannello e fare clic su Crea in alto per registrare i pozzetti come campioni.
    8. Fai clic su Impostazione ROI nell'angolo in alto a destra per definire l'area di interesse (ROI) nel piatto. Una volta impostati tutti i parametri, fai clic su Esegui esperimento nell'angolo in basso a destra per aprire la finestra di acquisizione dell'immagine.
    9. Fai clic su Load Vessel nell'angolo in alto a destra. Apparirà un'immagine in campo chiaro. Regolare la posizione Z utilizzando i pulsanti +Z e -Z per mettere a fuoco.
    10. Nella scheda Imaging singolo, regolare le dimensioni del ROI. Cattura gli organoidi in un campo visivo di 160 μm x 160 μm e acquisisci pile assiali fino a 140 μm di profondità. Per organoidi più grandi, acquisire più tomogrammi RI e unire immagini selezionando la casella di controllo Tile Imaging in basso.
    11. Passare alla scheda Time Lapse Imaging per configurare l'imaging a lungo termine. Impostare la durata e l'intervallo di tempo in base alle esigenze. In questo esperimento, l'imaging time-lapse è stato eseguito a intervalli di 10 minuti per un periodo di 24 ore e l'analisi è stata condotta a intervalli di 2 ore per la stessa durata.
    12. Fai clic sull'icona Scansione per acquisire la posizione ROI corrente. Centrare manualmente la cupola ECM utilizzando l'imaging in campo chiaro. Fare clic sul pulsante BF per regolare l'intensità e i valori di esposizione per l'imaging in campo chiaro.
    13. Seleziona ROI spostando la casella ROI visualizzata nel pannello Anteprima. Una volta trovato il ROI desiderato, fai clic su Aggiungi punto in basso. Verrà visualizzato l'elenco dei punti di imaging.
    14. Fare clic su Acquisisci per avviare l'imaging. Verranno acquisiti i dati grezzi dell'immagine.
  3. Acquisizione delle immagini
    NOTA: questo processo genera un Tomocube Common File (TCF) dai dati dell'immagine non elaborata. I dati grezzi dell'immagine devono essere elaborati in un file TCF, che contiene diversi tipi di immagini, come un tomogramma RI e una proiezione di massima intensità. Il tomogramma RI rappresenta la distribuzione dell'RI 3D del campione e la proiezione dell'intensità massima mostra il valore RI più alto per ogni posizione laterale nel piano XY.
    1. Trascina e rilascia i file di immagine raw sul server di elaborazione HTX. Fare clic su Elabora per generare un file TCF dal file di immagine non elaborato.
    2. Per visualizzare i tomogrammi RI generati nel file TCF, utilizzare TomoAnalysis Viewer, MATLAB o Python. Per visualizzare un file TCF in MATLAB, utilizzare funzioni come h5info e h5read. Allo stesso modo, in Python, usa il pacchetto h5py per leggere i file H5.

3. Analisi delle immagini

  1. Segmentazione delle immagini basata sull'apprendimento automatico
    1. Esporta il file immagine TCF in formato HDF5 (Supplementary Coding File 1) per assicurarti che i dati siano in un formato multidimensionale compatibile con ilastik.
    2. Apri ilastik e vai su File > nuovo progetto. Seleziona Classificazione pixel nella sezione Flussi di lavoro di segmentazione. Salvare il file di progetto in una directory designata.
    3. Caricare il file HDF5 passando a 1. Scheda Dati di input. Fare clic su Aggiungi nuovo file, selezionare il set di dati H5 appropriato e assicurarsi che siano assegnati i canali immagine corretti.
    4. Passare a 2. Scheda Selezione funzioni per selezionare le caratteristiche pertinenti (Colore/Intensità, Bordo, Texture) per ottimizzare la segmentazione.
      NOTA: La selezione delle funzioni può variare a seconda del set di dati e delle caratteristiche dell'immagine. Per l'analisi corrente, le funzioni selezionate includevano: Colore/Intensità (σ = 1,60), Bordo (σ = 3,50) e Texture (σ = 1,60). L'ottimizzazione basata su un approccio euristico può essere necessaria a seconda della complessità dell'immagine. In alternativa, la funzione Suggerisci funzionalità > Esegui selezione funzionalità in ilastik può essere utilizzata per identificare un insieme ottimale di parametri.
    5. Nel 3. Scheda Addestramento, etichetta le regioni organoidi e non organoidi applicando pennellate di colori distinti. Per migliorare la fedeltà della segmentazione, annotate attentamente le regioni attorno ai contorni.
    6. Fai clic su Aggiornamento in tempo reale per visualizzare in anteprima i risultati della segmentazione e apportare i perfezionamenti necessari.
    7. Passare a 4. Esportazione delle previsioni. Nella selezione dell'origine, scegliere Segmentazione semplice per esportare le previsioni etichettate. Fare clic su Esporta tutto, assicurandosi che il formato di output sia impostato su .h5 o .tiff, a seconda dei requisiti di analisi a valle.
  2. Analisi quantitativa delle caratteristiche
    NOTA: Questo passaggio del protocollo viene eseguito in MATLAB, con ogni procedura descritta in dettaglio nel File di codifica supplementare 2.
    1. Combinando il tomogramma RI con l'immagine della maschera, creare un'immagine RI mascherata che includa solo la regione dell'organoide.
    2. Utilizzando l'immagine RI mascherata, è possibile calcolare parametri quantitativi come il volume degli organoidi, la densità e il contenuto proteico.
      1. Volume: calcola il volume totale dell'organoide moltiplicando il numero di pixel nella maschera segmentata per la risoluzione dei pixel per X, Y e Z. Calcola il numero di pixel contando tutti i valori voxel nell'array di maschere etichettate con l'organoide, utilizzando la funzione MATLAB Sum integrata.
        NOTA: La risoluzione dei pixel è determinata dal sistema di imaging e può essere trovata nel gruppo Dati > attributi 3D all'interno della struttura HDF5.
      2. Densità proteica: Calcola la densità proteica sottraendo il valore medio dell'RI dall'RI medio dell'organoide e dividendolo per l'incremento dell'indice di rifrazione proteica.
        1. RI del mezzo: Misurare l'RI del mezzo circostante utilizzando un rifrattometro prima dell'analisi.
        2. Valore medio dell'IR: Determina l'RI media dell'organoide facendo la media dei valori dell'RI dei voxel situati all'interno della maschera dell'organoide.
        3. Incremento dell'indice di rifrazione delle proteine (α): utilizzare una costante empirica precedentemente riportata derivata da studi sull'incremento dell'indice di rifrazione.
      3. Contenuto proteico: Calcolare il contenuto proteico totale moltiplicando il volume determinato nel passaggio 3.2.2.1 per la densità proteica ottenuta nel passaggio 3.2.2.2.

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Results

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La Figura 1 illustra il flusso di lavoro schematico per l'imaging 4D e l'analisi quantitativa delle sIO. Questo protocollo consente l'imaging continuo dal vivo e la valutazione completa delle sIO attraverso un processo in quattro fasi: coltura, imaging 4D, elaborazione delle immagini e analisi quantitativa (Figura 1D).

Dopo un periodo di incubazione di 5 giorni, le sIO mature sono state trasferite in piastre di imaging con fondo copri...

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Discussion

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L'olotomografia presenta un approccio potente per l'imaging ad alta risoluzione e senza marcatura di organoidi vivi, superando molte sfide associate alle tecniche di imaging convenzionali. In questo protocollo, descriviamo una metodologia completa per l'applicazione dell'HT a bassa coerenza alla ricerca sIO, consentendo la visualizzazione quantitativa in tempo reale della morfologia degli organoidi, delle dinamiche di crescita e delle risposte al trattamento farmacologico. L'integrazione...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.J.L., J.H.L., S.M.L. e Y.K.P. hanno interessi finanziari in Tomocube Inc., una società che commercializza strumenti per olotomografia e imaging di fase quantitativo.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea finanziata dal governo coreano (MSIT) (RS-2024-00442348, RS-2024-00440577, 2022M3H4A1A02074314), dal Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) attraverso il programma International Cooperative R&D (P0028463) e dalla sovvenzione del Fondo coreano per la medicina rigenerativa (KFRM) finanziata dal governo coreano (il Ministero della Scienza e delle TIC e il Ministero della Salute e del Welfare) (21A0101L1-12). L'acquisizione dei dati è stata condotta da M.J.L. e J.H.L., con J.H.L. responsabile dell'elaborazione dei dati e J.M.C. per l'analisi dei dati. Tutti gli autori hanno contribuito alla stesura del manoscritto. Estendiamo i nostri ringraziamenti a ChulMin Oh e Chungha Lee per le preziose discussioni tecniche e l'assistenza nella preparazione delle figure.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Piastra a 48 pozzetti Corning3548Piatto di coltura
Soluzione per il recupero cellulare Corning354253Degradazione del Matrigel 
CisplatinoSupelcoPHR1624N/A
Dimetilsolfossido (DMSO)Sigma-AldrichD2650Veicolo
Tubo di EppendorfCorningMCT-175-C-SN/A
Server di elaborazione HTXTomocube Inc., CoreaN/AServer di elaborazione dati
HT-X1Tomocube Inc., CoreaN/ASoftware operativo
IlastikN/AN/AToolkit di segmentazione basato sull'apprendimento automatico
Porta vaso per piatto di imaging Tomocube Inc., CoreaN/ASupporto per piastra di imaging
IntestiCult Terreno di Crescita Organoidi (Topo)Tecnologie STEMCELL#06005Terreno di coltura prefabbricato disponibile in commercio 
MatlabMathWorksMatlab 2024aSoftware per l'elaborazione delle immagini
MatrigelCorning356231ECM per organoidi 3D
Milliporo  Steritop  Filtro per bottiglie sottovuotoMerckS2GPT05RE0,22 μ Unità filtrante M per sterilizzazione media
Organoidi Intestinali di TopoTecnologie STEMCELL#70931N/A
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