Articolo metodologico

Germinazione asimbiotica e rigenerazione a base di espianti di foglie dell'orchidea medicinale in via di estinzione Hemipilia cucullata da semi maturi

DOI:

10.3791/68541

⸱

19 settembre 2025

 ,  ,  , 
1Zhejiang Province Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation, College of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University, 2Laboratory of Systematic & Evolutionary Botany and Biodiversity, College of Life Sciences, Zhejiang University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per ottimizzare la germinazione asimbiotica dei semi, lo sviluppo delle piantine e l'allungamento dei germogli in Hemipilia cucullata. Il protocollo consente inoltre l'induzione di corpi simili a protocorm da espianti di foglie sterili, facilitando un'efficiente propagazione in vitro per la conservazione e l'uso sostenibile di questa orchidea medicinale in via di estinzione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'Hemipilia cucullata (Orchidaceae) è un'orchidea terrestre ampiamente apprezzata per le sue proprietà medicinali e il suo fascino ornamentale, ma le sue popolazioni selvatiche sono in pericolo a causa del degrado dell'habitat, della bassa vitalità dei semi e del limitato successo dell'impollinazione. Per supportarne la conservazione e l'utilizzo sostenibile, questo studio ha sviluppato un protocollo ottimizzato per la germinazione asimbiotica di semi maturi, lo sviluppo del protocormo, l'allungamento dei germogli e l'induzione del corpo simile al protocormo (PLB) da espianti di foglie sterili. I semi coltivati in terreno liquido 1/2 MS integrato con 0,5 mg/L di NAA hanno mostrato un tasso di germinazione del 72 ± del 6%, significativamente superiore al terreno di controllo (46%) e solido (31%), con la germinazione iniziata circa 21 giorni prima in coltura liquida. I protocormi sono stati subcoltivati su terreno B5 contenente 0,5 mg/L di BA, 0,2 mg/L di NAA e 100 mL/L di acqua di cocco, portando a una proliferazione efficiente. Dopo 5-6 settimane, le piantine sono state trasferite nel terreno di allungamento dei germogli (B5 integrato con 0,5 mg/L BA e 1 mg/L di NAA), dove hanno mostrato un robusto allungamento dei germogli e una sana formazione delle foglie. Per l'induzione di PLB, il tasso di induzione più alto (44,3 ± 5,1%) è stato raggiunto su terreni MS contenenti BA (3 mg/L) e NAA (0,2 mg/L). Questo protocollo completo e riproducibile può essere una piattaforma efficace per la propagazione su larga scala e la conservazione ex situ di H. cucullata, offrendo un valido supporto per gli sforzi di recupero di questa orchidea in via di estinzione.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemipilia cucullata (L.) Y.Tang, H.Peng & T.Yukawa, comunemente nota come orchidea neottiana cuculata, è un'orchidea terrestre selvatica originaria dell'Eurasia temperata ed è ampiamente distribuita dalla Poloniaal Giappone. Inizialmente classificata nel genere Neottianthe, questa specie è stata recentemente riassegnata al genere Hemipilia, sezione Neottianthe, sulla base di prove molecolari2. La pianta cresce da tuberi sotterranei e raggiunge fino a 30 cm di altezza, producendo fiori rosati o rosso porpora disposti in una spiga unilaterale. Grazie alla forma elegante e alla colorazione attraente dei suoi fiori, possiede un notevole valore ornamentale. Inoltre, l'intera pianta è riconosciuta come erba medicinale in più paesi, dove è ampiamente utilizzata per vari scopi terapeutici, tra cui il trattamento di condizioni cardiache, il miglioramento della circolazione sanguigna, il sollievo dalle contusioni e la promozione della guarigione delle fratture 3,4. Recenti studi fitochimici hanno identificato diversi antociani in questa specie, come la cianidina 3-ossalglucoside, la crisantemia e la cianina, che possiedono proprietà antiossidanti e vasoprotettive e possono contribuire ai suoi effetti medicinali 5,6.

Attualmente, le popolazioni selvatiche di H. cucullata affrontano minacce dovute alla perdita di habitat e ai disturbi ambientali, portando a un grave declino della popolazione e, in alcune aree, portando la specie vicino all'estinzione 3,7,8. Tuttavia, la conservazione di questa specie è particolarmente impegnativa a causa delle difficoltà nella sua propagazione naturale. In natura, H. cucullata si riproduce sia clonalmente che sessualmente, ma entrambe le modalità sono inefficienti. La propagazione clonale naturale è lenta e poco frequente, mentre la riproduzione sessuale è limitata dallo scarso successo dell'impollinazione e dalla bassa vitalità dei semi 9,10. Inoltre, le indagini sul campo hanno rivelato una struttura di età marcatamente squilibrata, con una scarsità di individui giovani e un limitato reclutamento naturale, soprattutto in condizioni di stress antropico o pirogenico 7,8,11. I semi di H. cucullata, come molte orchidee, sono minuscoli, mancano di endosperma e richiedono partner fungini specifici per la germinazione, complicando ulteriormente la rigenerazione naturale. Di conseguenza, nonostante la sua ampia distribuzione geografica, le dimensioni della popolazione e la struttura per età delle popolazioni selvatiche sono in declino e i rischi di estinzione locale sono in aumento7. Pertanto, la messa a punto di un metodo efficiente per la propagazione rapida artificiale è essenziale sia per la conservazione delle risorse di germoplasma che per l'utilizzo sostenibile di questa specie di orchidea.

Tra le tecniche di propagazione disponibili, la germinazione simbiotica - che si basa sull'associazione con funghi micorrizici orchidee - può simulare da vicino i processi naturali, ma è spesso difficile da standardizzare a causa della sua dipendenza da partner fungini specie-specifici 12,13,14. Al contrario, la germinazione asimbiotica offre un'alternativa più semplice e riproducibile che è ampiamente utilizzata nei sistemi di coltura di tessuti di orchidee15. Sebbene la germinazione asimbiotica e i protocolli di propagazione rapida siano stati sviluppati per diverse orchidee medicinali come Bletilla, Dendrobium e Cypripedium 16,17,18,19, è ancora necessaria l'ottimizzazione specie-specifica dei terreni di coltura e delle condizioni di coltura tissutale per H. cucullata.

In questo studio, abbiamo utilizzato semi maturi di H. cucullata ottenuti attraverso l'impollinazione incrociata manuale di individui selvatici (Figura 1A) sul Monte Tianmu nella Cina orientale (30°20′ N, 119°22′ E) per stabilire e ottimizzare un protocollo efficace per la germinazione asimbiotica dei semi, lo sviluppo delle piantine e l'allungamento dei germogli. Inoltre, abbiamo sviluppato un sistema di rigenerazione da espianti di foglie tramite induzione di PLB, contribuendo così alla conservazione e alla coltivazione di questa orchidea medicinale in via di estinzione.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Prima di iniziare l'esperimento, indossare dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. Eseguire tutte le procedure sotto una cappa a flusso laminare per la sterilità. Maneggiare con cautela l'etanolo e l'ipoclorito di sodio e smaltire i rifiuti secondo le norme di sicurezza del laboratorio.

1. Sterilizzazione delle capsule ed estrazione dei semi

  1. Mettere la capsula in un becher. Aggiungere 1-2 gocce di detersivo e risciacquare abbondantemente con acqua di rubinetto per rimuovere i contaminanti superficiali.
  2. Lavare la capsula sotto l'acqua corrente per 5 minuti. Assorbire l'acqua superficiale con carta assorbente sterile.
  3. Trasferire la capsula su un banco da lavoro sterile per un'ulteriore disinfezione.
  4. Immergere la capsula in etanolo al 75% (v/v) per 30 s.
  5. Sterilizzare la capsula immergendola in 50 ml di soluzione di ipoclorito di sodio al 20% (v/v) (diluita da una candeggina commerciale contenente ~5% di cloro disponibile), con l'aggiunta di 2 gocce di detersivo per piatti per uso domestico non diluito per 10-12 minuti.
  6. Sciacquare la capsula cinque volte con acqua distillata sterile per rimuovere i residui di disinfettante.
  7. Utilizzando un bisturi sterile, rimuovere circa 1 mm sia dall'apice che dalla base (estremità peduncolare) della capsula.
  8. Fai una piccola incisione all'estremità superiore della capsula per esporre i semi. Mettere la capsula in una capsula di Petri sterile per l'estrazione dei semi.

2. Preparazione del terreno di coltura

  1. Preparare 1/2 terreno liquido MS: utilizzare metà delle concentrazioni di macronutrienti del terreno MS standard, conservare tutti gli altri componenti come nel terreno MS, aggiungere 20 g/L di saccarosio e acido α-naftaleneacetico (NAA, 0,5 mg/L) e regolare il pH a 5,8.
  2. Dopo l'ebollizione, erogare immediatamente il terreno in flaconi di coltura da 500 ml (il numero di flaconi può essere regolato in base alla scala di propagazione desiderata).
  3. Mettere il terreno dosato in autoclave e sterilizzare a 121 °C per 15 minuti. Dopo la sterilizzazione, rimuovere il fluido dall'autoclave e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso.

3. Germinazione dei semi

  1. Utilizzare una pinza sterile per disperdere uniformemente circa 500-600 semi in ogni bottiglia di terreno (preparato al punto 2.3). Lascia che i semi assorbano l'acqua e si depositino sul fondo del mezzo liquido.
  2. Mantenere le colture a 25 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore e un'intensità luminosa di 36 μmol·m-2·s-1.
  3. Osserva settimanalmente la germinazione dei semi, registra i cambiamenti morfologici e scatta fotografie per la documentazione.
  4. Dopo circa 12 settimane, quando la maggior parte dei semi è germogliata, conta il numero di semi germinati e calcola il tasso di germinazione. Utilizzare un ciclo di inoculazione sterile per raccogliere casualmente un anello di terreno liquido contenente semi. Trasferire i semi campionati in una capsula di Petri o in un vetrino e osservare al microscopio stereoscopico.
  5. Conta il numero di semi che hanno formato protocormi come germinati. Calcola il tasso di germinazione utilizzando la seguente formula:
    Tasso di germinazione (%) = (Numero di semi germinati/Numero totale di semi nel campione) × 100.

4. Protocorm sottocultura e proliferazione

  1. Preparare il terreno di proliferazione integrando il terreno B5 (3,21 g/L) con acqua di cocco (100 mL/L), 6-benzilamminopurina (BA, 0,5 mg/L) e NAA (0,2 mg/L). Aggiungere 20 g/L di saccarosio e 7,3 g/L di agar e regolare il pH a 5,8.
  2. Dopo l'ebollizione, erogare immediatamente il terreno in flaconi di coltura da 150 mL (il numero di flaconi può essere regolato in base alla scala di propagazione desiderata).
  3. Mettere il terreno dosato in autoclave e sterilizzare a 121 °C per 15 minuti. Lasciare raffreddare il terreno a temperatura ambiente prima dell'uso.
  4. Trasferire asetticamente 10-15 protocormi germinati (0,3-1 cm di dimensione) per bottiglia sul terreno di coltura preparato nella fase 4.3.
  5. Dopo un periodo di coltivazione di 5 settimane, valutare lo stato di proliferazione e registrare il numero di protocormi di nuova formazione per bottiglia.
  6. Continuare a coltivare i protocormi proliferati per altre 4-6 settimane per consentire lo sviluppo in piantine con apice visibile del germoglio e strutture simili a rizoidi prima del trasferimento per l'allungamento del germoglio.
    NOTA: Mantenere le colture a 25 °C, con un ciclo luce/buio di 12 ore e un'intensità luminosa di 36 μmol·m-2·s-1.

5. Allungamento dei germogli

  1. Preparare il terreno per l'allungamento dei germogli integrando il terreno B5 (3,21 g/L) con BA (0,5 mg/L) e NAA (1 mg/L). Aggiungere 20 g/L di saccarosio e 7,3 g/L di agar e regolare il pH a 5,8.
  2. Dopo l'ebollizione, erogare il terreno in flaconi di coltura da 150 mL (il numero di flaconi può essere regolato in base alla scala di propagazione desiderata).
  3. Seleziona piantine sane (di 1-2 cm di dimensione, senza annerimento evidente o ingiallimento completo) per l'allungamento dei germogli. Utilizzando una pinza sterilizzata e raffreddata, trasferire asetticamente 8-12 piantine in ciascun flacone di coltura da 150 mL contenente terreno fresco preparato nella fase 5.1. Assicurati che le piantine siano distribuite uniformemente all'interno di ogni bottiglia.
  4. Dopo un periodo di allungamento dei germogli di 5 settimane, selezionare le piantine con germogli completamente sviluppati e foglie sane per il campionamento dell'espiantazione delle foglie.
    NOTA: Mantenere le colture a 25 °C, con un ciclo luce/buio di 12 ore e un'intensità luminosa di 36 μmol·m-2·s-1.

6. Induzione di PLB da espianti fogliari

  1. Preparare il terreno di induzione dei PLB integrando il terreno basale MS (4,43 g/L) con BA (3 mg/L) e NAA (0,2 mg/L). Aggiungere 20 g/L di saccarosio e 7,3 g/L di agar e regolare il pH a 5,8.
  2. Dopo l'ebollizione, erogare il terreno in flaconi di coltura da 150 mL (il numero di flaconi può essere regolato in base alla scala di propagazione desiderata).
  3. Seleziona piantine sane dopo 5 settimane di allungamento dei germogli (passaggio 5.4). Asportare le foglie sterili completamente espanse, rimuovere la regione apicale e i margini e tagliare ogni foglia in segmenti di circa 0,5 cm × 0,5 cm utilizzando un bisturi sterile in condizioni asettiche.
  4. Posizionare i 10 segmenti fogliari sul mezzo di induzione PLB con la superficie adassiale rivolta verso l'alto, assicurando un contatto stabile con la superficie del fluido.
  5. Dopo 5 settimane di coltura, valutare il numero di PLB indotti con successo e calcolare il tasso di induzione (%). Inoltre, registra l'altezza media delle gemme (cm) e il numero di gemme formate per espianto.
    NOTA: Mantenere le colture a 25 °C, con un ciclo luce/buio di 12 ore e un'intensità luminosa di 36 μmol·m-2·s-1.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le fasi del protocollo presentate in questo studio rappresentano la metodologia ottimizzata sviluppata attraverso una serie di esperimenti comparativi volti a migliorare la germinazione asimbiotica dei semi, la proliferazione del protocormo, l'allungamento dei germogli e l'induzione di PLB in H. cucullata. Ad esempio, nella selezione dei PGR per promuovere la germinazione dei semi, il NAA migliora lo sviluppo embrionale e l'assorbimento dell'acqua, mentre il BA promuove la differenziazione delle gemme e la divis...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le capsule di orchidea contengono tipicamente numerosi semi, spesso superiori a diecimila, ma la loro germinazione naturale è estremamente limitata a causa dell'assenza di endosperma e della loro elevata dipendenza da associazioni fungine simbiotiche e da specifici segnali ambientali20. I protocolli di germinazione asimbiotica sono stati quindi ampiamente adottati per aggirare queste limitazioni e consentire un'efficiente propagazione delle piantine in condizioni ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1/2 MS Sali Base con vitamineCoolaberPM1061
6-benzilamminopurinaShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.1214-39-7
Potere AgarBeijing Chembase Technology Co., Ltd.1400
Banco pulitoSuzhou Purification Equipemnt Co., Ltd.SW-CJ-2G
Acqua di coccoBUON AGRICOLTOREhttps://e.tb.cn/h.6F8GTrHG7pif7Tj?tk=jFTyVPU3OBs
DetergenteLiby Scienza e Tecnologia6920174756784
Gamborg B5 MediumLaboratori di FitotecnologiaG398
Bottiglia di vetroMorebetter Biotechnology Co., Ltd.Pannello di controllo MBT-BL-240
Murashige & Sali basali di SkoogLaboratori di FitotecnologiaM519
PipettaEppendorf3123000268
Bilancia di precisioneMETTLER TOLEDO30834109
SPSSSocietà internazionale di macchine aziendaliSoftware utilizzato per il test di significatività statistica
SaccarosioSinopharm chemical Reagent Co., Ltd.20210802
ThidiazuronShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.51707-55-2
Acido &alfa;-naftaleneaceticoShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.86-87-3

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, X., et al. Flora of China. , Science Press and Missouri Botanical Garden Press. Beijing, St. Louis, MO. (2009).
  2. Tang, Y., Yukawa, T., Bateman, M., Jiang, H., Peng, H. Phylogeny and classification of the East Asia Amitostigma alliance (Orchidaceae: Orchideae) based on six DNA markers. BMC Evol Biol. 15 (1), 1-32 (2015).
  3. Minarchenko, M. Threatened medicinal plants of Ukraine: An assessment of the current protection status. J Plant Dev. 24, 117-131 (2017).
  4. Pant, B., Raskoti, B. Medicinal Orchids of Nepal. , Himalayan Map House Pv Ltd. Kathmandu, Nepal. (2013).
  5. Strack, D., Busch, E., Wray, V., Grotjahn, L., Klein, E. Cyanid 3oxalylglucoside in orchids. Naturforsch C. 41 (7-8), 707-711 (1986).
  6. Strack, D., Busch, E., Klein, E. Anthocyanin patterns in European orchids and their taxonomic and phylogenetic relevance. Phytochemistry. 28 (8), 2127-2139 (1989).
  7. Ilyina, N., Kozlovskaya, O. V. Dynamics of the population structure and abundance of the rare species Neottianthe cucullata (L Schlechter under conditions of pyrogenic load in the territory adjacent to the Buzuluksky Bor National Park (Samara region). Samara J Sci. 13 (2), 35-41 (2024).
  8. Khapugin, A., Chugunov, G., Silaeva, T., Kunaeva, E. Neottianthe cucullata (L Schltr. (Orchidacea Juss.), an endangered orchid in central Russia. Wulfenia. 23, 189-202 (2016).
  9. A method for the rapid propagation of Hemipilia cucullata. using its floral bracts as explants. China patent. , CN106993535A (2017).
  10. Johnson, D., Edwards, T. The structure and function of orchid pollinaria. Plant Syst Evol. 222, 243-269 (2000).
  11. Ilyina, V., Senator, S., Mitroshenkova, A., Kozlovskaya, O. Peculiarities of the Neottianthe cucullata population structure under industrial loads (Samara Oblast). AIP Conf Proc. 3184 (1), 8(2024).
  12. Zhang, L., et al. Symbiotic culture of three closely related Dendrobium species reveals a growth bottleneck and differences in mycorrhizal specificity at early developmental stages. Diversity. 14 (12), 1119(2022).
  13. Leng, C., Hou, M., Xing, Y., Chen, J. Perspective and challenges of mycorrhizal symbiosis in orchid medicinal plants. Chin Herb Med. 16, 172-179 (2024).
  14. Zoubi, L. Complexities and innovations in orchid germination: A review of symbiotic and asymbiotic techniques. J Plant Sci. 12 (4), 90-94 (2024).
  15. Chen, J., et al. Symbiotic and asymbiotic germination of Dendrobium officinale (Orchidaceae) respond differently to exogenous gibberellins. Int J Mol Sci. 21 (17), 6104(2020).
  16. JinYing, C., Xuefeng, W., Baocai, L., Yuqing, Z. Efficient germination system in asymbiotic culture of Bletilla striata (Thunb Reichb). f. Fujian J Agric Sci. 33 (2), 131-135 (2018).
  17. Mei, H., JiJun, K., ZhenYong, X., LiMing, Z., Hong, J. Study on seedlings of nonsymbiotic germination of Paphiopedilum wenshanense. J West China For Sci. 49 (3), 56-59 (2020).
  18. Teixeirada Silva, A., Cardoso, J. C., Dobránszki, J., Zeng, S. Dendrobium micropropagation: A review. Plant Cell Rep. 34, 671-704 (2015).
  19. Zeng, S., et al. Seed biology and vitro seed germination of Cypripedium. Crit Rev Biotechnol. 34 (4), 358-371 (2014).
  20. Cozzolino, S., Widmer, A. Orchid diversity: An evolutionary consequence of deception. Trends Ecol Evol. 20 (9), 487-494 (2005).
  21. Miura, C., et al. Autoactivation of mycorrhizal symbiosis signaling through gibberellin deactivation in orchid seed germination. Plant Physiol. 194 (1), 546-563 (2023).
  22. Bustam, B., Dixon, K., Bunn, E. vitro propagation of temperate Australian terrestrial orchids: Revisiting asymbiotic compared with symbiotic germination. Bot J Linn Soc. 176 (4), 556-566 (2014).
  23. Gogoi, K., Kumaria, S., Tandon, P. Ex situ conservation of Cymbidium eburneum Lindl.: a threatened and vulnerable orchid, by asymbiotic seed germination. 3 Biotech. 2, 337-343 (2012).
  24. Robinson, E. J., Kakati, J. P., Sebastinraj, S., Suriya, K. I vitro seed germination of Cymbidium aloifolium L Sw., a potential medicinal orchid from Eastern ghats of Tamil Nadu India. J Plant Biotechnol. 44, 343-348 (2017).
  25. Hossain, M., Sharma, M., Teixeirada Silva, J. A., Pathak, P. Seed germination and tissue culture of Cymbidium giganteum Wall. Lindl. Sci Hortic. 123 (4), 479-487 (2010).
  26. Ibrahim, L., Jenkinson, P. Effect of artificial culture media on germination, growth, virulence and surface properties of the entomopathogenic hyphomycete Metarhizium anisopliae. Mycol Res. 106 (6), 705-715 (2002).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Rigenerazione delle orchideecultura di espianti fogliarisviluppo del protocormoinduzione di PLBprotocollo di coltura tissutalesterilizzazione dei semiallungamento del germoglioconservazione ex situ

Articoli correlati