Articolo metodologico

Tomografia al microscopio elettronico a scansione a trasmissione in virologia: imaging 3D di campioni congelati ad alta pressione, liofilizzati

DOI:

10.3791/68568

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6 agosto 2025

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1Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, 2Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 3Institute of Molecular Virology, Ulm University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo video illustra come eseguire la tomografia al microscopio elettronico a scansione a trasmissione di campioni virologici. Per ottenere risultati ottimali, i campioni vengono preparati mediante congelamento ad alta pressione e successiva sostituzione con congelamento.

Abstract

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La microscopia elettronica (EM) e in particolare le tecniche EM tridimensionali (3D) sono diventate metodi consolidati nella virologia strutturale. Lo studio dell'alterazione dell'ultrastruttura cellulare indotta dal virus, come le fabbriche di replicazione indotte dal virus Zika (ZIKV) o gli organelli di replicazione del coronavirus, richiede l'imaging 3D. La tomografia al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) è un metodo ampiamente utilizzato, nonostante la sua limitazione a campioni con uno spessore fino a 200 nm. La microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato (SEM)-tomografia può produrre dati 3D di volumi maggiori con risoluzione isotropa, anche se in genere inferiore. Per l'imaging di volumi maggiori vengono utilizzate tecniche alternative, come la microscopia elettronica a scansione facciale a blocchi (BF-SEM), la tomografia a matrice SEM o l'imaging TEM di sezioni seriali. Tuttavia, rispetto alle tecniche precedentemente menzionate, queste tecniche hanno il costo di una risoluzione molto più bassa lungo l'asse Z del campione. Una tecnica che fornisce informazioni 3D su campioni fino a 1 μm di spessore con risoluzione isotropa di pochi nanometri è la tomografia al microscopio elettronico a scansione a trasmissione (STEM).

Qui presentiamo un protocollo per la preparazione di campioni virologici congelati ad alta pressione, liofilizzati e incorporati in resina e la loro analisi mediante tomografia STEM. Questo protocollo beneficia dei vantaggi dell'imaging a temperatura ambiente, preservando l'ultrastruttura biologica in uno stato quasi nativo. Mostriamo due esempi rappresentativi di domande a cui è possibile rispondere utilizzando la tomografia STEM. In primo luogo, applichiamo il protocollo per lo studio della morfogenesi del virione di un virus della stomatite vescicolare ricombinante (VSV). I tomogrammi STEM offrono informazioni sulla gemmazione ricombinante di VSV che altrimenti non sarebbero accessibili con l'imaging 2D. In secondo luogo, mostriamo la microscopia ottica ed elettronica correlativa (CLEM) utilizzando l'imaging a trasferimento di energia di risonanza di Foerster (FRET) e la tomografia STEM (FRET-3D-CLEM) di nanofibrille peptidiche EF-C. Questa combinazione pubblicata di recente fornisce nuove informazioni sull'assorbimento e lo smontaggio delle nanofibrille peptidiche che aumentano l'infezione, in particolare traendo vantaggio dall'ampio volume accessibile dalla tomografia STEM.

Introduzione

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Figura 1: Confronto tra diverse tecniche di microscopia 3D, considerando la risoluzione, la strumentazione, il tempo di acquisizione e lo sforzo. Il volume massimo possibile delle tecniche è compreso tra la tomografia crio-TEM tecnicamente impegnativa, che offre una risoluzione molecolare, e la microscopia ottica, in cui la risoluzione è limitata dal limite di diffrazione della luce. Abbreviazioni: TEM = microscopia elettronica a trasmissione; STEM = TEM a scansione; SEM = microscopia elettronica a scansione; FIB = fascio ionico focalizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le strutture e i sistemi correlati ai virus si estendono su una scala che va dal regime sub-angstrom (ad esempio, piccole molecole per la viroterapia, proteine virali isolate) a diversi metri (ad esempio, interi organismi infetti). Le particelle virali sono nell'intervallo 20-1.000 nm e sono principalmente studiate nel loro contesto biologico, come le cellule ospiti e le linee cellulari produttrici di virus, che sono nell'intervallo dei μm. La visualizzazione di specifiche strutture correlate al virus dipende quindi dalla scelta di una tecnica che fornisca un campo visivo sufficiente e una risoluzione adeguata. Lo studio delle cellule infettate da virus e dei pezzi di tessuto si basa su tecniche di microscopia (Figura 1). Mentre le immagini panoramiche di cellule e tessuti possono essere acquisite utilizzando la microscopia ottica classica, le strutture intracellulari coinvolte nella replicazione del virus sono spesso studiate utilizzando la microscopia elettronica (EM). Sebbene oggi sia utilizzato principalmente nella ricerca virologica di base, l'EM è utilizzato anche nella diagnostica 1,2 e ha trovato la sua strada anche nelle applicazioni biofarmaceutiche3.

Spesso, gli approcci EM 2D come la microscopia elettronica a trasmissione classica (TEM) non possono rispondere in modo sufficiente a una determinata domanda biologica. In virologia, questo è particolarmente vero quando si studiano le interazioni virus-ospite-cellula come l'attacco e l'ingresso del virione, la formazione di fabbriche virali o la morfogenesi del virione 4,5,6,7,8,9. Pertanto, la tomografia EM viene utilizzata per analizzare l'ultrastruttura 3D dei campioni biologici. In linea di principio, ci sono due modi per acquisire un tomogramma di un determinato campione: 1) imaging graduale di fette seriali che vengono successivamente combinate in una pila di immagini 3D, o 2) acquisizione di proiezioni da diversi angoli di visione del campione seguite dalla ricostruzione computazionale delle informazioni in una pila di immagini virtuale.

Le tecniche del primo tipo includono l'imaging di sezioni seriali mediante TEM o SEM (tomografia a matrice SEM), SEM a blocchi seriali e tomografia a fascio ionico focalizzato (FIB)-SEM. L'imaging SEM e TEM di sezioni seriali manca della risoluzione in z, che è limitata dallo spessore della sezione, ma fornisce un ampio campo visivo e si basa su apparecchiature prontamente disponibili nella maggior parte dei laboratori EM4. La tomografia FIB-SEM può produrre una risoluzione isotropa, ma i costi del dispositivo e della manutenzione possono essere impegnativi e l'imaging di intere cellule a risoluzione isotropa richiede molto tempo 9,10.

Il secondo tipo di tomografia si basa esclusivamente sulla trasmissione del fascio di elettroni attraverso un campione. Questo può essere fatto utilizzando due diverse modalità di imaging: TEM o microscopia elettronica a trasmissione a scansione (STEM). Mentre la tomografia TEM è più diffusa e più facile da implementare, lo spessore della sezione è limitato a ~200 nm. Pertanto, le strutture più grandi dello spessore della sezione, come i mitocondri, le vescicole o i virioni, non possono essere visualizzate all'interno di un singolo tomogramma. La tomografia STEM offre la possibilità di visualizzare campioni fino a 1 μm di spessore 11,12. Tuttavia, richiede uno STEM con un'elevata tensione di accelerazione (≥200 kV) e una configurazione che supporti angoli di inclinazione elevati e un piccolo angolo di semiconvergenza13. Sebbene l'imaging STEM sia una tecnica comune nella scienza dei materiali, rimane una tecnica rara nei laboratori biologici EM.

Qui, presentiamo un approccio basato sull'applicazione per utilizzare la tomografia STEM per campioni virologici. A causa dell'elevata complessità e della natura laboriosa della tomografia EM, la preparazione dei campioni di alta qualità è fondamentale. Mentre la TEM criogenica (tomografia) è senza dubbio il gold standard per le indagini a livello molecolare, l'imaging a temperatura ambiente di cellule congelate ad alta pressione e liofilizzate fornisce una solida conservazione e chiarezza dell'ultrastruttura cellulare 7,14. In breve, le cellule aderenti vengono coltivate su un disco di zaffiro e infettate o altrimenti trattate come desiderato. Le celle vengono quindi immobilizzate congelandole ad alta pressione a velocità di raffreddamento molto elevate, con conseguente vetrificazione dell'acqua all'interno. Successivamente, l'acqua viene sostituita da un solvente mentre i campioni vengono contrastati e riportati lentamente a temperatura ambiente. I campioni vengono poi gradualmente incorporati nella resina.

Esistono molti protocolli per il congelamento ad alta pressione e la sostituzione del congelamento, che differiscono per il macchinario, il sistema di trasporto e la composizione del campione. Sono stati pubblicati protocolli dettagliati per il congelamento ad alta pressione, tra cui uno di Walther et al.15 e un protocollo video di Steyer et al.16, che si concentra sulla preparazione dei tessuti per FIB-SEM utilizzando il miglioramento del contrasto assistito da microonde. Per la ricerca virologica, Read et al.17 e Romero-Brey18 hanno pubblicato protocolli dettagliati per la preparazione di cellule infettate da virus mediante congelamento ad alta pressione con dischi di zaffiro e successiva analisi mediante tomografia elettronica. Anche il sezionamento ultrasottile è stato precedentemente descritto15,17. Fare riferimento alla letteratura citata per maggiori dettagli su questi approcci.

Qui presentiamo un flusso di lavoro che è una versione adattata e aggiornata dei protocolli15,17 precedentemente pubblicati abbinati per la prima volta a una guida video dettagliata. Il protocollo fornisce un flusso di lavoro per la preparazione del campione utilizzando il congelamento ad alta pressione, la sostituzione del congelamento e l'inclusione in resina epossidica. Le sezioni di spessore 800 nm-1.000 nm vengono tagliate utilizzando un ultramicrotomo. Una serie di inclinazioni viene acquisita con uno stelo da 200 kV, utilizzando gli strumenti EM software. Questo protocollo è ottimizzato per le cellule aderenti e fornisce un flusso di lavoro completo, consentendo al contempo modifiche per altri tipi di campioni, come i tessuti o le cellule in sospensione. Per la tomografia STEM in condizioni criogeniche, fare riferimento al lavoro del gruppo di Michael Elbaum 19,20.

Protocollo

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1. Coltura cellulare

  1. Preparazione dei dischi di zaffiro
    1. Pulire i dischi di zaffiro lavandoli 3 volte in etanolo al 100% per 20 minuti. Rimuovere l'etanolo rimanente tirando i dischi su una carta da filtro asciutta. Lasciare i dischi in una camera di essiccazione a 37 °C per almeno 30 minuti, o fino a completa asciugatura.
      NOTA: In questo protocollo vengono utilizzati dischi in zaffiro con un diametro di 3 mm e uno spessore di 0,16 mm. Per altri sistemi, un flusso di lavoro ottimizzato per cellule tissutali o in sospensione, fare riferimento a Walther et al.15. Alcuni "suggerimenti e trucchi" per le cellule in coltura e altri sistemi sono forniti da McDonald et al.21.
    2. Rivestire i dischi di zaffiro posizionando circa 50 dischi di zaffiro su un vetro dell'orologio pulito e rivestendoli con uno strato di carbonio spesso 10-15 nm utilizzando un dispositivo di rivestimento in carbonio. Cuocere i dischi per una notte a 120 °C per stabilizzare lo strato di carbonio.
      NOTA: Per gli approcci EM correlati, introdurre un sistema di coordinate: posizionare una griglia di ricerca sopra i dischi di zaffiro prima del rivestimento in carbonio, in modo che la griglia sia visibile come negativo sul disco21.
    3. Per essere in grado di identificare successivamente il lato rivestito di carbonio del disco di zaffiro, utilizzare uno strumento affilato (ad esempio, la punta di una pinzetta) per graffiare un segno nel carbonio che può essere letto correttamente solo da un lato.
      NOTA: Si consiglia il numero "2" o simile (Figura 2A, B). Salta questo passaggio per i dischi in zaffiro con un sistema di coordinate rivestito.
    4. Conservare i dischi di zaffiro in una camera di essiccazione a 37 °C fino a nuovo utilizzo.
      NOTA: Si sconsiglia di riutilizzare i dischi in zaffiro in quanto ciò aumenta la probabilità che si rompano durante il congelamento ad alta pressione.
  2. Coltura cellulare
    1. Poco prima del posizionamento in coltura cellulare, scaricare a bagliore il lato rivestito di carbonio dei dischi con un dispositivo di scarica a bagliore per renderli idrofili (ad esempio, 0,26 mbar con una corrente di 20 mA per 40 s). Quindi, sterilizzare i dischi esponendoli alla luce UV per 15 minuti.
      NOTA: L'esposizione ai raggi UV per più di 30 minuti può danneggiare il rivestimento in carbonio.
    2. Utilizzare una pinzetta sterile per posizionare i dischi sul fondo di un piatto di coltura contenente terreni, assicurandosi che i dischi non galleggino. Semina con cura le celle sopra. Nel caso in cui i dischi di zaffiro galleggino nel terreno di coltura cellulare, scaricare il bagliore per un tempo più lungo quando si ripete l'esperimento.
      NOTA: È fondamentale che il "2" sia orientato correttamente, il che significa che il lato rivestito in carbonio è rivolto verso l'alto. Si desidera un monostrato di celle sui dischi con una confluenza finale di ~80%. La crescita cellulare sui dischi di zaffiro può differire da quella nel piatto di coltura circostante. Controllare la distribuzione e la qualità delle cellule sui dischi con un microscopio a luce invertita prima di continuare con il protocollo. La distribuzione delle cellule può essere migliorata facendo oscillare delicatamente la piastra durante la semina delle cellule.
      Per le celle di sospensione, coprire i dischi in zaffiro rivestiti di carbonio con poli-L-lisina o utilizzare capillari, come descritto alpunto 15. Non esporre i dischi ricoperti di poli-L-lisina ai raggi UV, poiché ciò può danneggiare il rivestimento in poli-L-lisina.
    3. Eseguire qualsiasi trattamento desiderato delle cellule (ad esempio, infezione, trattamento farmacologico) mantenendo i dischi di zaffiro in posizione. Maneggiare i dischi con cura per evitare il distacco delle celle o graffiare il rivestimento di carbone. Incubare le cellule di conseguenza. Effettuare la prefissazione chimica con, ad esempio, glutaraldeide al 2,5%, saccarosio all'1% in tampone fosfato 0,1 M (pH 7,3) o paraformaldeide al 4%, secondo le normative locali, prima di trasportare i campioni al congelatore ad alta pressione 1,7,22.
      NOTA: Prima che i campioni infetti lascino i laboratori con livello di biosicurezza, rispettare tutte le normative locali di biosicurezza applicabili al sistema modello.

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Figura 2: Congelamento ad alta pressione. (A) Dischi in zaffiro che mostrano un rivestimento di carbonio con "2" (a sinistra) o un sistema di coordinate per la microscopia elettronica e ottica correlativa (a destra). (B) Rappresentazione schematica di un sandwich SD-gold spacer-SD mentre viene preparato per il congelamento ad alta pressione. Le cellule cresciute sui dischi sono una di fronte all'altra e sono quindi protette nella cavità stretta. (C) Supporto per congelamento ad alta pressione che contiene un panino SD. (D) Materiali e dispositivi per il caricamento del supporto HPF: (1) Piastra riscaldante, (2) Stereomicroscopio, (3) Carta da filtro, (4) Tubo di reazione contenente 1-esadecene, (5) Pinzette, (6) SD non rivestite, (7) Piastra di Petri con distanziatori dorati, (8) Supporto HPF. (E) Messa a punto del sistema HPF: (1) LN-box per il trasferimento di campioni congelati (vedi anche F), (2) asciugacapelli per accelerare il riscaldamento del supporto HPF dopo il congelamento, (3) dewar con azoto per riempire la LN box. (F) LN-box per la conservazione di campioni congelati dopo il congelamento ad alta pressione con un trogolo centrale (contorno tratteggiato) in cui è possibile aprire il supporto HPF e maneggiare in sicurezza le SD. Materiali necessari subito dopo il congelamento ad alta pressione: (1) Supporto per un massimo di sei contenitori per campioni, (2) Pinzette isolate, (3) Contenitori per campioni con coperchio. I contenitori contengono piccoli fori e piccoli pesi (ad esempio, una vite) in modo che si immergano nell'azoto liquido. Abbreviazioni: SD = disco di zaffiro; HPF = congelatore ad alta pressione; LN = azoto liquido. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Preparazione del campione per microscopia elettronica

  1. Surgelazione ad alta pressione
    NOTA: Questo protocollo descrive il congelamento ad alta pressione con il congelatore ad alta pressione di riferimento (HPF, Tabella dei materiali). I passaggi descritti non dovrebbero differire molto per altre macchine, poiché hanno lo stesso scopo.
    1. Seguire le istruzioni del produttore per configurare il congelatore ad alta pressione. Garantire un'adeguata alimentazione di azoto liquido (Figura 2E), accendere la macchina ed eseguire un ciclo di prova.
    2. Impostare un'area di lavoro per caricare i dischi nel supporto HPF (Figura 2D). Tieni a portata di mano i seguenti oggetti: una piastra riscaldante (1), uno stereomicroscopio (2), pezzi di carta da filtro (3), una provetta di reazione con esadecene come riempitivo (4), pinzette (5), dischi di zaffiro vuoti/non rivestiti per congelare un numero dispari di SD con celle (6), distanziatori d'oro (7) e il supporto HPF (8, dettaglio nella Figura 2C).
    3. Preparare un'area di lavoro per la gestione dei campioni congelati (Figura 2E, F). Prima di iniziare il congelamento ad alta pressione, preparare le seguenti attrezzature:
      1. Preparare la scatola LN e riempirla con azoto liquido (Figura 2E, F) in preparazione per la manipolazione e il trasferimento dei dischi di zaffiro congelati dal supporto HPF alle capsule di conservazione.
      2. Preparate un piccolo dewar (3 in Figura 2E) e riempitelo con azoto liquido: preparatevi a riempire più volte la LN-box con azoto liquido durante il processo di congelamento.
      3. Tenere pronte le pinzette isolanti (2 nella Figura 2F).
      4. Preparare i contenitori per campioni che conterranno i dischi di zaffiro dopo il congelamento ad alta pressione (capsule di conservazione, 3 nella Figura 2F). Assicurati che abbiano un coperchio e diversi fori per il versamento dell'azoto liquido e piccoli pesi (ad esempio, piccole viti o simili) per assicurarti che non galleggino. Etichettare i contenitori prima dell'uso e preraffreddarli nella LN-box.
        NOTA: Utilizziamo le capsule BEEM come capsule di conservazione.
    4. Conservare i campioni in un incubatore vicino al congelatore ad alta pressione se le cellule non sono state prefissate o, se non è possibile, su una piastra riscaldata (1 nella Figura 2D), per mantenere le condizioni fisiologiche (37°C, 5% CO2) il più a lungo possibile.
    5. Assicurarsi che un numero sufficiente di celle sui dischi in zaffiro e una buona qualità delle celle prima di iniziare il congelamento ad alta pressione. A tale scopo, ispezionare i dischi utilizzando un microscopio a luce invertita.
    6. Eseguire il congelamento ad alta pressione.
      1. Prelevare un disco di zaffiro dalla piastra di coltura con una pinzetta e posizionarlo nel supporto HPF (Figura 2C) con il lato rivestito in carbonio rivolto verso l'alto ("2" è leggibile). Prima di ciò, rimuovere il terreno in eccesso immergendo rapidamente il disco sulla carta da filtro, ma fare attenzione a non lasciare che le celle si secchino.
      2. Immergi un distanziatore d'oro nell'esadecene e mettilo con cura sopra il disco di zaffiro. Prendi un secondo disco di zaffiro e posizionalo sopra il distanziatore d'oro con il lato rivestito di carbonio rivolto verso il basso, formando un sandwich di disco di zaffiro - distanziatore d'oro - disco di zaffiro con le celle rivolte l'una verso l'altra. Assicurarsi che non vi sia aria intrappolata nella cavità del sandwich.
      3. Chiudere il supporto HPF. Eseguire questo passaggio con attenzione ma rapidamente per ridurre al minimo lo stress sul campione, in particolare per le cellule viventi che non sono state prefissate.
        NOTA: Per i campioni contenenti sostanze cancerogene, mutagene o tossiche per la riproduzione (CMR), come i fissativi chimici, caricare il supporto HPF sotto una cappa aspirante per ridurre al minimo l'esposizione.
      4. Avvia il processo di congelamento. Inserire rapidamente il supporto HPF nel congelatore ad alta pressione, bloccarlo secondo le istruzioni del produttore e avviare il processo di congelamento.
    7. Rimuovere i campioni vetrificati dal supporto HPF. Trasferisci rapidamente la punta del supporto HPF che trasporta i dischi di zaffiro ora congelati nella scatola LN preraffreddata. Rimuovere con cautela i dischi dal supporto HPF nel canale centrale della scatola LN (linea tratteggiata nella Figura 2F). Successivamente, riscalda il supporto HPF e rimuovi eventuali residui di etanolo o esadecene prima di iniziare ad assemblare il panino successivo.
      NOTA: D'ora in poi, assicurarsi che tutto ciò che tocca i dischi sia preraffreddato in azoto liquido. Eseguire rapidamente le fasi di trasferimento in atmosfera di azoto e conservare i dischi in azoto liquido per evitare lo scongelamento del campione. Esercitarsi in anticipo nel trasferimento del supporto dall'HPF alla LN-box per garantire una transizione fluida e rapida. Il processo di riscaldamento del supporto può essere accelerato dopo il congelamento utilizzando un asciugacapelli (2 nella Figura 2E).
    8. Dopo aver rimosso i dischi di zaffiro dal supporto, inserirli nei contenitori etichettati per il trasferimento al dispositivo di sostituzione del congelamento o per la conservazione dell'azoto liquido fino a ulteriore lavorazione. Se i dischi di zaffiro sono strettamente impilati insieme dopo l'HPF, utilizzare un bisturi per separare i dischi di zaffiro prima della sostituzione del congelamento.
      NOTA: Fare attenzione a non rompere i dischi ed evitare forze di taglio. Pianifica abbastanza tempo per questo passaggio.
  2. Congelamento-sostituzione
    1. Installare il dispositivo di sostituzione del congelamento seguendo le istruzioni del produttore. Riempire il dewar di azoto liquido e avviare il programma per preraffreddare la camera del campione a -90 °C. Assicurarsi che ci sia abbastanza azoto liquido per l'intero processo di sostituzione.
      NOTA: Le sostanze chimiche coinvolte sono pericolose. Eseguire tutti i passaggi sotto una cappa aspirante e rispettare le linee guida locali in materia di ambiente, salute e sicurezza (EHS).
    2. Preparare la soluzione di sostituzione del congelamento contenente lo 0,1% (p/v) di acetato di uranile, lo 0,2% (p/v) di tetrossido di osmio (OsO4) e il 5% (v/v) di acqua in acetone. Per preparare un volume di 6 ml (sufficiente a riempire 24 crioviali, che equivale alla capacità massima del dispositivo di sostituzione qui utilizzato), attenersi alla seguente procedura:
      1. Pesare 6 mg di acetato di uranile in un recipiente di vetro con un coperchio ermetico.
      2. Aggiungere 300 μl di tetrossido di osmio al 4% (p/v) in acqua.
      3. Chiudere il recipiente e sonicare per 5 minuti per sciogliere l'acetato di uranile.
      4. Aggiungere 5,7 mL di acetone, mescolare e dividere uniformemente la soluzione in crioviali compatibili con il dispositivo di sostituzione del congelamento.
    3. Collocare i crioviali chiusi contenenti la soluzione di sostituzione del congelamento nel dispositivo di sostituzione del congelamento preraffreddato a -90 °C e attendere che anche la soluzione si raffreddi a -90 °C (per circa 20 minuti).
    4. Riempire la LN-box con azoto liquido. Per trasferire i dischi di zaffiro nel dispositivo di sostituzione del congelamento, preraffreddare una pinzetta, un bisturi e pinze (o pinzette grandi) in azoto liquido.
    5. Utilizzare le pinzette grandi preraffreddate per trasferire le capsule di stoccaggio con i campioni congelati ad alta pressione dal serbatoio di stoccaggio nella LN-box.
      NOTA: Lavorare rapidamente per evitare lo scongelamento dei campioni. Quando si elaborano i campioni direttamente dopo il congelamento ad alta pressione, questo passaggio può essere saltato.
    6. Trasferire i campioni congelati ad alta pressione nel dispositivo di sostituzione del congelamento. Separare i dischi di zaffiro uno per uno mantenendoli in azoto liquido. Trasferire rapidamente ogni disco singolarmente in un crioviale con soluzione di sostituzione a freddo, assicurandosi che il disco sia completamente immerso. Chiudere il crioviale e reinserirlo immediatamente nel dispositivo di sostituzione del congelamento.
      NOTA: Durante il trasferimento, mantenere il crioviale nell'atmosfera di azoto liquido per evitare che la soluzione di sostituzione si riscaldi, ma non in azoto liquido per evitare che si congeli. Tenere il flaconcino con le dita vicino al coperchio per evitare il riscaldamento della soluzione sostitutiva. Maneggiare la soluzione sostitutiva con cura, poiché contiene sostanze tossiche.
    7. Una volta che tutti i dischi sono stati trasferiti nel dispositivo di sostituzione, avviare il processo di sostituzione del blocco. Impostare il dispositivo in modo che aumenti gradualmente la temperatura durante 16 ore da -90 °C a 0 °C, con una fase di incubazione di 1 ora a 0 °C, seguita da un aumento graduale a 20 °C in 1 ora.
    8. Non appena i campioni raggiungono i 20 °C, continuare direttamente con il lavaggio dei campioni per 3 x 30 minuti con acetone al 100%.
      NOTA: Non lasciare che le celle sui dischi cadano asciutte. Eseguire tutti i passaggi successivi sotto una cappa aspirante. Raccogliere tutti i rifiuti in un contenitore adatto e smaltirli secondo le normative EHS locali.
  3. Incorporamento
    1. Preparare la resina epossidica appena secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: Eseguire tutti i passaggi con resina epossidica sotto una cappa aspirante. Si consiglia di preparare resina fresca per ogni procedura di inclusione a causa della minore viscosità e quindi di una migliore infiltrazione del campione.
    2. Per pre-incorporare i campioni, incubare i campioni in una soluzione contenente 1/3 di resina epossidica e 2/3 di acetone per 1 ora. Sostituire la soluzione con 2/3 di resina epossidica e 1/3 di acetone e incubare per 3 ore. Sostituire la soluzione con resina epossidica al 100% e lasciarla incubare per una notte con il coperchio della fiala aperto per consentire l'evaporazione dell'acetone rimanente.
    3. Il giorno successivo, trasferire i dischi di zaffiro in nuove provette di reazione etichettate riempite con resina epossidica appena preparata. Posizionare i dischi orizzontalmente, sostenuti dalla parete del tubo di reazione, e assicurarsi che il lato con le celle sia rivolto verso l'alto nel tubo di reazione (il "2" è leggibile al microscopio stereo). Porre le provette di reazione con il coperchio aperto in forno a 60 °C e lasciare polimerizzare la resina epossidica per almeno 48 h.
      NOTA: Se è necessario incorporare un frammento di disco di zaffiro, incorporarlo con l'aiuto di una punta polimerizzata di un blocco di resina di un esperimento precedente: posizionare la punta nel tubo di reazione, riempire il tubo con resina fresca e posizionare il disco rotto sopra la punta polimerizzata.
      Tutti i materiali di consumo monouso contaminati da resina epossidica devono essere posti in un forno a 60 °C per consentire alla resina di polimerizzare completamente prima dello smaltimento. Pinzette e altri oggetti possono essere puliti in anticipo con etanolo.
    4. Immergere la punta di una provetta di reazione chiusa nell'azoto liquido per circa 10 s. Successivamente, rimuovere il blocco di resina dal tubo di reazione colpendo il tubo di reazione sul tavolo. Il disco in zaffiro si separa facilmente dal rivestimento di carbonio che rimane sopra le celle incorporate.
      NOTA: Assicurarsi che il mezzo di inclusione tolleri le variazioni di temperatura indotte dal trattamento con azoto liquido.
  4. Preparazione di sezioni di tomografia STEM
    1. Preparare sezioni molto più spesse di quelle ultrasottili per l'imaging TEM, di solito tra 800 nm e 1 μm.
      NOTA: La preparazione delle sezioni per la tomografia STEM differisce leggermente dall'ultramicrotomia convenzionale. Per un protocollo dettagliato che descrive la preparazione delle sezioni di tomografia STEM, fare riferimento a Walther et al.15 e Villinger et al.10.
      Prima di procedere con la preparazione delle sezioni di tomografia STEM, assicurarsi che la qualità delle cellule sia buona. A tal fine, eseguire il sezionamento ultrasottile (~70 nm) e l'analisi TEM (Figura 3D, E).
    2. Raccogliere le sezioni su griglie di rame a barre parallele, in modo che nessuna barra della griglia blocchi il fascio di elettroni quando si inclina il campione ad angoli elevati. Per un migliore fissaggio della sezione, trattare le griglie con poli-L-lisina allo 0,01%: preparare una piccola aliquota di poli-L-lisina allo 0,01% da una soluzione madre allo 0,1%, immergere le griglie nell'aliquota, asciugarle accuratamente trascinando il bordo della griglia su una carta da filtro. Scarica le griglie a bagliore e usale per raccogliere le sezioni.
    3. Trattare le sezioni con oro colloidale come marcatori fiduciali per l'allineamento della serie di inclinazione (vedere sezione 3).
    4. Applicare uno strato di carbonio sulle sezioni per stabilizzarle e renderle più conduttive.

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Figura 3: Controllo di qualità mediante diversi aspetti TEM delle cellule dopo l'inclusione, il taglio e il sezionamento ultrasottile. (A) Celle incorporate in resina epossidica dopo la rimozione della SD. Lo strato di carbonio con il "2" graffiato rimane sulle celle incorporate nella resina ed è chiaramente visibile. Le celle quasi trasparenti sono distribuite uniformemente sulla faccia del blocco. (B) Faccia del blocco rifilata prima della microtomia. Parte del 2 graffiato è ancora visibile sulla superficie del blocco di resina. (C) sezioni sottili 70 nm montate su una griglia TEM. (D) Panoramica TEM di un'intera sezione ultrasottile. Si notino i fori nella sezione (punte di freccia bianche) che derivano da un'infiltrazione di resina incompleta e sono un artefatto comune. (E) Vista ingrandita di una cella selezionata contrassegnata da un rettangolo bianco in (D). Simile a (D), l'inclusione incompleta è visibile sulla membrana plasmatica (punte di freccia bianche); Tuttavia, il resto della cella mostra una buona conservazione e incorporamento. Barre di scala = 100 μm (D), 10 μm (E). Abbreviazioni: SD = disco di zaffiro; TEM = microscopia elettronica a trasmissione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Imaging

  1. Acquisizione serie di inclinazioni STEM
    1. Impostare il microscopio secondo le linee guida del produttore. Assicurarsi che il raggio sia allineato correttamente.
    2. Riempire con cura il dewar di azoto liquido al microscopio.
    3. Selezionare il supporto per tomografia corretto nel software operativo del microscopio.
    4. Inserire la griglia nel supporto. Prestare attenzione che le barre della griglia siano orientate perpendicolarmente all'asse di inclinazione per evitare che le barre blocchino il fascio di elettroni ad alti angoli di inclinazione.
    5. Inserire il supporto nel microscopio.
    6. Allineare la trave eseguendo i seguenti passaggi:
      1. Caricare il file di allineamento fornito dal produttore. Aprire la valvola a fascio e lavorare in modalità TEM per ora. Impostare un ingrandimento di circa 20.000x e impostare la messa a fuoco standard premendo STD Focus.
      2. Cercare un foro nel campione. Questa operazione è più semplice in modalità a basso ingrandimento (premere LowMag).
      3. Assicurarsi che non sia inserita alcuna apertura. Impostare la dimensione del punto su 1 e Alfa su 3. Ridurre al minimo il raggio sullo schermo di visualizzazione ruotando il pulsante della luminosità in senso antiorario e centrarlo con i pulsanti di spostamento del raggio.
      4. Allineamento corretto della pistola: Nel pannello di allineamento del software operativo del microscopio, selezionare Pistola e oscillazione dell'anodo. Regolare la simmetria del raggio con i pulsanti DEF/STIG . Verificare che il movimento del raggio sullo schermo fluorescente sia omogeneo. Sposta il punto più luminoso al centro dello schermo con i pulsanti MAIUSC ; Deseleziona tutto al termine.
      5. Stigmatori del condensatore corretti: nello stesso pannello di allineamento , selezionare CLA e HT wobbler. Regolare con i pulsanti DEF/STIG per ottenere un movimento omogeneo.
      6. Impostare l'apertura della lente del condensatore: Massimizzare il raggio sullo schermo fluorescente ruotando il pulsante della luminosità in senso orario. Inserire l'apertura più piccola della lente del condensatore e assicurarsi che sia allineata correttamente nel raggio alternando la luminosità. Se il raggio si muove in modo asimmetrico sullo schermo di visualizzazione, regolare manualmente l'apertura utilizzando gli azionamenti manuali dell'apertura. Se l'apertura appare distorta sullo schermo fluorescente, correggere nuovamente gli stigmatori del condensatore CLA con DEF/STIG (passaggio precedente 3.1.6.5).
      7. Passa alla modalità STEM (seleziona ASID).
        NOTA: È possibile interrompere il dialogo di rilassamento dell'obiettivo dopo 5-10 s.
      8. Spostare il tavolino in una regione sottile e ricca di contrasto del campione. Premere STD Focus e rimuovere tutte le aperture. Passa a 25.000 ingrandimenti con una dimensione dello spot di 1,5 nm, imposta la lunghezza della fotocamera tra 80 e 120 cm e seleziona la modalità spot.
      9. Modificare il valore z del goniometro fino a quando il ronchigramma non è visibile sullo schermo di visualizzazione. Modificare la lunghezza della fotocamera se il ronchigramma è debole. Se non è rotondo, utilizzare il pulsante COND Stig per regolarlo.
      10. Inserire l'apertura più piccola della lente del condensatore. Utilizzare le unità di apertura manuali per centrare l'apertura attorno al ronchigramma.
    7. Inserire il rilevatore appropriato. Sulla base della domanda della ricerca, utilizzare il rilevatore di campo chiaro e/o il rilevatore di campo scuro. Attivare la modalità di scansione e acquisire una prima immagine di prova del campione.
    8. Selezionare un ingrandimento maggiore di quello desiderato per il tomogramma (superiore a 800.000x). Messa a fuoco e astigmatismo corretti: eseguire questa operazione in prossimità ma non direttamente nella regione di interesse (ROI) per evitare danni al fascio nelle aree critiche del campione.
      NOTA: I pennarelli fiduciali in oro possono facilitare questo passaggio.
    9. Imposta l'altezza eucentrica per assicurarti che la ROI rimanga centrata sull'intero intervallo di inclinazione (ad esempio da -72 ° a 72°). Seleziona una funzione vicino al ROI, portala al centro, metti a fuoco, correggi l'astigmatismo e inclina il tavolino in modo graduale a - 72 °. Regolare la posizione z del supporto per mantenere la funzione centrata e regolare il contrasto e la luminosità se necessario. Se necessario, ripetere l'operazione inclinandola gradualmente a +72°.
    10. Scegliere il campo visivo tornando alla ROI, mettere a fuoco e acquisire un'immagine panoramica (Figura 4). Impostare l'ingrandimento desiderato per l'acquisizione della serie di inclinazione.
    11. Imposta l'acquisizione automatica in serie di immagini da -72° a +72° e immagini ogni 1,5°.
    12. Per contrastare gli effetti meccanici che si verificano quando si cambia la direzione dell'inclinazione del tavolino, iniziare la serie di inclinazioni con un angolo maggiore di quello con cui si inizia l'imaging. Se si esegue l'imaging da -72° a 72°, iniziare inclinando il tavolino da 0° a -74° e quindi avviare l'acquisizione dell'immagine sulla strada per +72°, acquisendo la prima immagine a -72°.
    13. Avvia l'acquisizione automatica della serie di inclinazione. Assicurarsi di abilitare la messa a fuoco dinamica nel software di acquisizione.
      NOTA: Se l'acquisizione della serie di inclinazione viene interrotta prematuramente, correggere l'altezza eucentrica. Soprattutto a un ingrandimento più elevato, ciò può causare problemi con l'acquisizione automatica della serie di inclinazione a causa della migrazione del ROI fuori dal campo visivo.
      Un software comunemente usato per la tomografia STEM e TEM è SerialEM. Kirchweger et al.20 hanno pubblicato un protocollo video per la tomografia Cryo-STEM utilizzando SerialEM, che può essere facilmente adattato per la tomografia STEM a temperatura ambiente.

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Figura 4: Acquisizione in serie Tilt . (A) 200 kV STEM. (B) Panoramica STEM di una cella congelata ad alta pressione, liofilizzata, incorporata in resina epossidica. La serie di inclinazione mostrata in (C-E) è stata acquisita nella posizione contrassegnata con il rettangolo bianco. (C-E) Immagini selezionate di una serie di inclinazioni acquisite da -72° a +72°. I fiduciali d'oro su entrambi i lati della sezione sono utilizzati per la ricostruzione computazionale del tomogramma. I fiduciali raggruppati come quelli contrassegnati con le ellissi bianche non possono essere utilizzati per la ricostruzione del tomogramma, ma sono ben riconoscibili ad alti angoli di inclinazione. Queste o strutture simili al di fuori della regione di interesse sono utili per impostare l'altezza eucentrica. Barra di scala = 1 μm (B). Abbreviazione: STEM = microscopia elettronica a scansione e trasmissione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Ricostruzione e segmentazione del tomogramma

  1. Eseguire la ricostruzione del tomogramma (ad es. con il software Etomo del pacchetto software IMOD23).
    1. Eseguire il primo allineamento della serie di inclinazione e ricostruire il tomogramma utilizzando la retroproiezione ponderata.
      NOTA: Un protocollo dettagliato è disponibile sul sito Web IMOD: Guida alla tomografia IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/tomoguide.html). Per l'elaborazione delle immagini acquisite con il rivelatore di campo oscuro, fare riferimento al lavoro precedentemente pubblicato11,13.
  2. Segmentare le strutture cellulari (ad esempio, con software come 3DMOD dal pacchetto IMOD o soluzioni basate sull'intelligenza artificiale).

Risultati

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La tomografia STEM offre la possibilità di visualizzare sezioni più spesse rispetto alla tomografia TEM con una risoluzione isotropa nell'ordine dei nanometri e, rispetto alla tomografia FIB-SEM, fornisce un flusso di lavoro di imaging relativamente efficiente in termini di tempo. In virologia, questo è particolarmente utile in quanto consente l'imaging di un gran numero di caratteristiche ultrastrutturali per l'analisi statistica in 3D o durante la ricerca di eventi rari. Qui, mostriamo due risultati rappresentativi che dimostrano come la tomografia STEM possa essere utilizzata in relazione a questi due aspetti.

Visualizzazione di virioni VSV ricombinanti in gemmazione

Esiste un'ampia varietà di virus che formano particelle di diverse forme e dimensioni. Per analizzare la forma dei virioni in una sospensione virale, spesso è sufficiente un metodo semplice come la TEM con colorazione negativa. Caratterizzare la morfologia dei virioni nel contesto cellulare è più difficile. Ciò è particolarmente vero per i virus che formano particelle con morfologia anisotropa, come i rhabdoviridae. VSV è un rabdovirus che forma virioni a forma di proiettile di ~180 nm di lunghezza. Nelle celle di sospensione, i virioni sono orientati in modo casuale, rendendo difficile distinguere sempre la forma del proiettile nelle immagini 2D (Figura 5A-C). Per definire correttamente la forma del proiettile di tutti i virioni VSV ricombinanti in un campione, è necessario un metodo 3D con risoluzione isotropa, in grado di fornire anche informazioni volumetriche su un'area di campionamento sufficientemente ampia. Un tomogramma STEM può includere molti virioni completi in un unico set di dati (Figura 5D, E). In questo modo, è possibile visualizzare un numero elevato di virioni per l'analisi statistica, anche se viene acquisito un solo tomogramma per cellula. In confronto, un tomogramma TEM di una sezione spessa 200 nm catturerebbe solo alcuni virioni VSV ricombinanti completi (come indicato nella Figura 5E).

figure-results-1
Figura 5: Tomografia STEM di siti di gemmazione VSV ricombinanti. (A-C) I dettagli di una sezione virtuale di un tomogramma STEM ottenuto da una sezione spessa 800 nm mostrano che la forma del proiettile non è sempre visibile a causa dei diversi orientamenti (A,B) dei virioni. (C) Solo i virioni orientati parallelamente al piano di osservazione presentano come proiettili ben definiti. (D) I siti di gemmazione di VSV ricombinante assomigliano a grandi ammassi di virioni senza orientamento preferito. (E) La vista laterale del tomogramma dimostra la capacità di catturare molti virioni VSV ricombinanti completi in una sezione utilizzando la tomografia STEM. Lo stack di immagini virtuali ha uno spessore di circa 600 nm in questa posizione. Le linee tratteggiate rappresentano lo spessore approssimativo di una sezione per la tomografia TEM (200 nm), dove sarebbero inclusi solo alcuni virioni completi a forma di proiettile. Barra della scala = 500 nm (D). Abbreviazioni: STEM = microscopia elettronica a scansione di trasmissione; VSV = virus della stomatite vescicolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Degradazione delle nanofibrille del peptide EF-C

Nel contesto della terapia genica, le nanofibrille peptidiche che aumentano la trasduzione sono diventate un argomento di interesse. In uno studio pubblicato di recente24, l'imaging correlativo utilizzando l'imaging a trasferimento di energia di risonanza Foerster (FRET) e la tomografia STEM (FRET-3D-CLEM) è stato utilizzato per studiare l'assorbimento e lo smontaggio delle nanofibrille peptidiche EF-C. Elevate efficienze FRET, corrispondenti a coppie FRET vicine tra loro, emettono fluorescenza rossa corrispondente alle fibrille assemblate. Basse efficienze FRET, corrispondenti a coppie FRET distanti l'una dall'altra, emettono fluorescenza verde, che rappresenta fibrille disassemblate. Entrambi i segnali compaiono nelle cellule quando sono in procinto di assorbire e degradare le nanofibrille del peptide EF-C. Le aree in cui si riscontrano efficienze FRET alte e basse sono visualizzate in giallo (Figura 6A).

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Figura 6: Imaging della degradazione delle nanofibrille del peptide EF-C mediante imaging FRET correlativo e tomografia STEM (FRET-3D-CLEM). (A) Microscopia confocale di una cellula incubata con nanofibrille EF-C marcate con una coppia di FRET. I segnali verdi corrispondono a fibrille putativamente smontate. Il rosso corrisponde a fibrille putativamente intatte. Il giallo corrisponde alle aree in cui viene rilevata una miscela del segnale rosso e verde. Nu nucleo. (B) Panoramica STEM di una sezione spessa 800 nm proveniente dalla stessa cella. (C) Viene indicata la posizione del tomogramma. L'immagine è un composto di due immagini acquisite su sezioni diverse, perché la cella era parzialmente bloccata dalla griglia a barre su una delle sezioni. Il nucleo è marcato con Nu in A, B e C. (C) Sezione virtuale dal tomogramma. Le punte di freccia rosse segnano le regioni che si sovrappongono ai segnali di fluorescenza rossi. La tomografia STEM conferma la presenza di fibrille intatte. La punta della freccia verde indica una regione con fibrille smontate. (D) Segmentazione del tomogramma. Un filopodium endocitoso sta pizzicando la membrana della vescicola (freccia bianca). Il grande volume che può essere studiato con un tomogramma STEM (qui circa: 7 μm x 7 μm x 550 nm) rende più facile osservare un evento così raro. (E) Sezioni virtuali 19, 24 e 29 del tomogramma. Con una dimensione dei pixel di 6,8 nm, le sezioni sono distanti 27,2 nm ciascuna. La figura è riprodotta dai dati pubblicati da Rauch-Wirth et al.24 . Barre di scala = 5 μm (A), 1 μm (C). Abbreviazioni: STEM = microscopia elettronica a scansione di trasmissione; FRET = Trasferimento di energia per risonanza di Foerster. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La visualizzazione è stata eseguita con questo approccio correlativo per confermare che le fibrille EF-C vengono assorbite dalla cellula e successivamente degradate. La microscopia ottica ci permette di scegliere le celle per la microscopia elettronica che forniscono segnali rossi e verdi, per confrontare l'aspetto ultrastrutturale correlato con i diversi segnali di fluorescenza. I tomogrammi STEM della stessa cellula mostrano che il segnale rosso può provenire da fibrille che sono ancora al di fuori della cellula o che sembrano essere appena internalizzate dalla macropinocitosi (Figura 6C). Inoltre, CLEM ha verificato che il segnale verde ha effettivamente origine da fibrille degradate (Figura 6B, C che si trova nei lisosomi (Figura 6C, vescicola più grande). A causa dell'ampio volume accessibile dalla tomografia STEM e della visualizzazione 3D delle strutture, è più facile correlare il segnale della microscopia ottica con le caratteristiche ultrastrutturali e interpretarle. Inoltre, con questo approccio possono essere rilevati eventi rari, come il pizzicamento dei filopodi all'interno del lisosoma (Figura 6D, E, freccia bianca).

Discussione

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La tomografia STEM offre una risoluzione paragonabile alla tomografia TEM combinata con la capacità di studiare volumi con spessore fino a 1 μm. Lo consideriamo quindi ideale per l'imaging di cambiamenti indotti da virus delle strutture intracellulari, come il rimodellamento della membrana 4,6,25, la gemmazione dei virioni 7 o l'endocitosi5. A seconda della domanda di ricerca, potrebbero essere prese in considerazione altre tecniche VolumeEM. Per una tecnica che fornisce un campo visivo più ampio con una risoluzione comparabile, si consiglia la tomografia FIB-SEM. La tomografia FIB-SEM sarà più lenta della tomografia STEM quando si esegue l'imaging di un volume comparabile con risoluzione simile, poiché il tempo di imaging aumenta all'aumentare della risoluzione. Spesso, questo viene poi contromisurato dall'imaging di campi visivi più piccoli. Inoltre, una risoluzione z di 6,8 nm (Figura 6) sarebbe tecnicamente impegnativa con la fresatura a fascio ionico. Pertanto, FIB-SEM è ottimale per l'imaging di strutture più grandi come cellule intere e tessuti 9,10,26,27, anche se di solito con dimensioni dei pixel (isotrope) di diverse decine di nanometri. Inoltre, i tomogrammi FIB-SEM non mostrano effetti di "cuneo mancante", tipico dei tomogrammi ricostruiti da una serie di inclinazione. Inoltre, con lo sviluppo delle macchine FIB al plasma, vengono attualmente introdotte sul campo alternative che forniscono una fresatura più rapida e precisa.

Se un'alta risoluzione in z non è cruciale, l'imaging TEM o SEM di sezioni seriali può essere un'alternativa che consente di indagare un campo visivo molto ampio in breve tempo28,29, tuttavia, di solito con risoluzione anisotropa. Nella tomografia TEM, è possibile combinare tomogrammi diversi da sezioni spesse seriali 30,31. Lo stesso è possibile nella tomografia STEM; Tuttavia, dato lo spessore delle sezioni che possono essere indagate, c'è meno bisogno di combinare un certo numero di tomogrammi. In virologia, la tomografia TEM è spesso utilizzata per caratterizzare il rimodellamento della membrana indotto da virus 32,33,34,35. Sebbene la tomografia TEM fornisca informazioni preziose sul ciclo di replicazione dei virus, la maggior parte dei casi d'uso trarrebbe vantaggio dalla capacità della tomografia STEM di visualizzare volumi più spessi. Ciò vale in particolare per i virioni con una morfologia anisotropa, come i rabdoviridae, dove la tomografia TEM può catturare solo pochi virioni completi in un tomogramma35 o per l'imaging di diversi virioni inviluppo in un compartimento di replicazione con una dimensione del complesso di assemblaggio virale citoplasmatico (cVAC) del citomegalovirus umano (HCMV)4.

La tomografia STEM in condizioni criogeniche offre ulteriori approfondimenti funzionali19 ed è disponibile un protocollo video20. Il nostro protocollo differisce nel flusso di lavoro di preparazione del campione, che, invece di conservare il campione nello stato nativo, fornisce una conservazione ultrastrutturale quasi nativa. Sebbene la tomografia STEM di campioni congelati ad alta pressione e liofilizzati non possa raggiungere la conservazione ultrastrutturale e la risoluzione atomica osservate nell'EM criogenica, beneficia dei vantaggi di apparecchiature più semplici, campioni più stabili e una maggiore produttività.

I seguenti passaggi sono fondamentali per il successo del metodo:

Innanzitutto, un chiaro obiettivo dell'esperimento di imaging. A causa della natura laboriosa della tecnica, è necessario un esperimento ben pianificato con un obiettivo chiaro per l'imaging. Una conoscenza dettagliata del sistema modello - linea cellulare e virus - dovrebbe essere generata in anticipo utilizzando altri metodi meno difficili da eseguire. Pertanto, incoraggiamo l'ottimizzazione dei tassi di infettività nei pre-esperimenti basati sulla microscopia ottica e la regolazione delle condizioni sperimentali per adattarle al sistema biologico. I parametri di ottimizzazione includono il numero di cellule, la molteplicità dell'infezione (MOI) e i punti temporali basati sul virus e sull'evento da visualizzare. Ciò garantirà un'elevata percentuale di cellule valutabili nel campione.

In secondo luogo, la preparazione dei campioni di alta qualità. Sottolineiamo l'importanza di una preparazione del campione di qualità. Al momento, consideriamo la vitrificazione mediante congelamento ad alta pressione come il gold standard per campioni spessi come le cellule. La sostituzione del congelamento, l'inclusione e la successiva imaging a temperatura ambiente sono un modo robusto per acquisire risultati di alta qualità se combinati con la tomografia STEM. Pertanto, è fondamentale stabilire una routine stabile per la preparazione dei campioni. Per questo, vorremmo evidenziare la letteratura sul congelamento ad alta pressione14,21. Se si desidera utilizzare una soluzione di sostituzione del congelamento meno tossica, si consiglia di utilizzare il permanganato di potassio come sostituto del tetrossido di osmio, come descritto da Schauflinger et al.36.

Infine, un flusso di lavoro regolare per l'acquisizione di serie di inclinazione, incluso un microscopio ben allineato, dovrebbe essere stabilito in conformità con le istruzioni per l'utente dello STEM e differirà da microscopio a microscopio. La creazione di un flusso di lavoro fluido dipende anche dal generatore di scansione e dal software di acquisizione delle immagini.

Dichiarazioni

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JGW, RH, EP, JSR e MD sono dipendenti di Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG, un'azienda farmaceutica interessata allo sviluppo e alla produzione di prodotti a base di virus. Questo non ha avuto alcuna influenza sul design della carta; Pertanto, non segnaliamo conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa pubblicazione fa parte della Global Development Technology Strategy ed è stata supportata dal Global Technology Management di Boehringer Ingelheim Development CMC Biologicals. Ringraziamo Renate Kunz e Jana Apolloni per l'eccellente assistenza tecnica e l'utile discussione sulla preparazione dei campioni. Ringraziamo Reinhard Weih per l'eccellente assistenza in caso di problemi tecnici e di manutenzione del dispositivo. Ringraziamo Torsten Friedrich per l'utile discussione e per l'aiuto nella configurazione del microscopio. Il lavoro di Clarissa Read, Julia LaRoche e Jan Münch è stato finanziato da un Cooperative Research Centre Grant della German Research Foundation (SFB1279).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1-EsadecenoMerck KGaA8220640500
Griglia di rame da 200 con barre parallelePlano GmbHG2014C
37 & deg; Camera di asciugatura a CBinder GmbH9010-0323
AcetoneVWR international GmbH20066330
DDSAScienze della microscopia elettronica13710
Coltello a diamanteDiatome Ltdhttps://www.diatomeknives.com/ultra-35
DMP-30Scienze della microscopia elettronica13600
Embed-812 ResinaScienze della microscopia elettronica14900
Strumenti EMTVIPS GmbHSoftware TVIPS: EM-Tools; https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/
Etanolo al 100%Merck KGaA1.00983.2511
Carta filtroVWR international GmbH516-0812
Flaschen mit Schnappdeckelglas 11 mLVWR international GmbH548-0625
FormvarScienze della microscopia elettronica15830-25
Unità di sostituzione del congelamento Leica EM AFS2Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/
Glod Sol 25 nmReagenti e Reagenti d'Oro AURION Immuno Accessori425.011
Buca di pino dorata e oslash; 2000 e MU; mScience Services GmbHGA2000-AU
Graiticules Buchstaben-Netzchen KupferPlano GmbHNH6C
Piastra riscaldanteMEDAX GmbH & Co. KG12501
Sistema di vaporizzazione ad alto vuoto BAF 300BAL-TEC AG
Congelatore ad alta pressione Wohlwend HPF Compact 01Ufficio di Ingegneria M. Wohlwend GmbHhttps://www.wohlwend-hpf.ch/index.html
Serbatoio di azoto liquidoH.Erben GmbH94500
Azoto (fluido)VWR international GmbH-
NMAScienze della microscopia elettronica19000
Tetrossido di osmioChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH006051
Forno a 120 °C; CBinder GmbH9010-0194
PELCO easi-GlowTed Pella, Inc.91000
Poly-L-Lysin 0,1% rispetto all'aq. SoluzioneTed Pella, Inc.18026
Tubi Safe-Lock 0,5 mLEppendorf SE0030 121.023
Contenitori campione (capsule Beem)Plano GmbHG360-1
Disco zaffiro diametro 3 x 0,16 mmUfficio di Ingegneria M. Wohlwend GmbH500
Ultramicrotomo Leica EM UC7Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/
Acetato di uranyleRiedel de Haë n AG31697
Camera a luce UVDiniesELG100S

Riferimenti

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