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Articolo metodologico

Epitelio pigmentato retinico primario di topo trasfettato con RNA Alu: un modello in vitro patologicamente rilevante per la degenerazione maculare legata all'età

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DOI:

10.3791/68570

⸱

17 ottobre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3National Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

In questo protocollo, descriviamo l'intero processo di creazione di un modello rilevante per la patologia per la degenerazione maculare legata all'età (AMD) nelle cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE) primarie di topo utilizzando la trasfezione dell'RNA Alu.

Abstract

La degenerazione maculare legata all'età (AMD), in particolare l'AMD non essudativa, richiede modelli sperimentali che replichino meglio la patologia umana. Gli attuali modelli in vivo rimangono tecnicamente impegnativi e richiedono molto tempo, mentre i sistemi convenzionali in vitro non riescono a ricapitolare i fattori scatenanti patologici specifici della malattia. Qui, presentiamo un metodo per stabilire un modello di degenerazione dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando cellule primarie di RPE di topo trasfettate con Alu RNA, un retrotrasposone direttamente implicato nella patologia dell'atrofia geografica.

Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento enzimatico delle cellule primarie di RPE di topo, seguito dalla trasfezione dell'RNA Alu per indurre la degenerazione dell'RPE. La validazione integra l'analisi morfologica (architettura esagonale), funzionale (perdita di polarità e rottura della proteina di topo ZO-1) e molecolare (PCR quantitativa). Di conseguenza, abbiamo osservato cambiamenti multifattoriali innescati dalla trasfezione dell'RNA dell'Alu: secrezione infiammatoria di citochine (geni di topo Ifn-β, Il-6, Tnf-α; p < 0,05) e senescenza cellulare (upregulation dei geni di topo p21 e p53 ; p < 0,05). Rispetto ai tradizionali modelli di stress acuto, questo sistema ricapitola le cascate infiammatorie-degenerative croniche di AMD attraverso tecniche standardizzate, garantendone la riproducibilità. Combinando aspetti di saggi in vitro semplificati e modelli complessi in vivo , questo approccio potrebbe fungere da piattaforma preliminare per esplorare i meccanismi guidati dai retrotrasposoni e lo screening di potenziali candidati terapeutici.

Introduzione

La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è una causa predominante di disabilità visiva globale. Tuttavia, i trattamenti efficaci per l'AMD non essudativa rimangono limitati. Pertanto, vi è un urgente bisogno di modelli di ricerca riproducibili ed efficienti per scoprire i meccanismi della malattia e identificare bersagli terapeutici 1,2. Al centro di questo sforzo c'è l'epitelio pigmentato retinico (RPE), un monostrato situato tra la membrana di Bruch (coroide) e i fotorecettori (retina), che svolge un ruolo fondamentale nel sostenere l'omeostasi retinica supportando la funzione dei fotorecettori, regolando la barriera emato-retinica e facilitando l'eliminazione dei rifiuti 3,4.

La disfunzione o la perdita delle cellule RPE è una caratteristica saliente di molte malattie degenerative della retina, specialmente nell'AMD, dove la disfunzione RPE rappresenta un passo precoce e critico nella sua progressione 2,4,5. In particolare, nei pazienti che manifestano atrofia geografica (GA), la fase avanzata dell'AMD, livelli ridotti dell'enzima di elaborazione dei microRNA Dicer 1 ribonucleasi III (DICER1) provocano un accumulo tossico di Alu RNA, un trascritto retrotrasposone direttamente collegato alla degenerazione dell'RPE e implicato nella patologia umana6.

I modelli tradizionali in vivo, come il modello di iodato di sodio (NaIO3) e il modello di amiloide-β (Aβ), mantengono la complessità della malattia sistemica ma devono affrontare limitazioni critiche. Il modello NaIO3 induce rapidamente stress ossidativo retinico e danno da RPE, tuttavia, la sua tossicità acuta interrompe sia l'RPE che i fotorecettori, non riuscendo a imitare la progressione cronica correlata alla patologia dell'AMD e oscurando la valutazione terapeutica della sottile disfunzione dell'RPE7. Allo stesso modo, il modello Aβ introduce fattori di stress specifici per la malattia, ma richiede un'ampia competenza tecnica e tempistiche prolungate rispetto agli approcci in vitro 8,9. I modelli convenzionali di RPE in vitro, come i modelli di esposizione a H2O2 e idrochinone, d'altra parte, mancano di rilevanza patologica, non riuscendo a ricapitolare i fattori di stress specifici della malattia come gli aggregati proteici tossici o i fattori scatenanti infiammatori1.

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per stabilire un modello di degenerazione dell'RPE nelle cellule primarie di RPE di topo utilizzando l'RNA Alu, un RNA non codificante derivato dai retrotrasposoni direttamente implicato nella patogenesi GA6. L'RNA dell'alluminio attiva le vie infiammatorie e compromette l'integrità della barriera RPE10,11, imitando così le caratteristiche patologiche associate all'AMD non essudativa. Questo metodo impiega l'isolamento enzimatico e la coltura di cellule RPE, seguite dall'induzione della degenerazione RPE utilizzando l'RNA Alu. Inoltre, forniamo un sistema di convalida completo, che combina letture morfologiche (architettura esagonale), funzionali (integrità della barriera e perdita di polarità) e molecolari (marcatori infiammatori e di senescenza) per valutare questo modello di degenerazione.

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Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Animale dell'Ospedale Generale di Shanghai, affiliato alla Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Questo protocollo segue rigorosamente il Regolamento per l'amministrazione degli affari relativi agli animali da esperimento (emesso dalla Commissione statale per la scienza e la tecnologia) e le linee guida per l'uso etico degli animali nella ricerca oftalmica e visiva stabilite dall'Associazione per la ricerca in vista e oftalmologia (ARVO). Consulta la Tabella dei materiali per maggiori dettagli relativi ai materiali utilizzati in questo protocollo.

1. Isolamento di cellule primarie di RPE di topo

  1. Preparazione delle lastre rivestite
    1. Diluire Matrigel con un rapporto di 150 μL di Matrigel e 13 mL di DMEM/F12 (concentrazione finale di circa 1,14%).
    2. Rivestire uniformemente il fondo della piastra con Matrigel diluito (circa 150 μl per una piastra a 48 pozzetti). Incubare per una notte a 37 °C per formare un gel.
  2. Preparazione della soluzione
    1. Preparare il terreno di coltura RPE completo utilizzando la miscela F-12 (DMEM/F12) Modified Eagle di Dulbecco, completata con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina.
    2. Preparare la miscela di papaina aggiungendo 4,5 ml di soluzione salina bilanciata (EBSS) di Earle a una fiala di papaina (100 unità/fiala).
    3. Preparare la miscela di DNasi I aggiungendo 500 μl di EBSS a un flaconcino di DNasi I (1.000 unità/flaconcino).
    4. Preparare la soluzione per la digestione della papaina aggiungendo 250 μL di DNase I Mix a 4,5 mL di Papaina Mix (regolare il protocollo fornito dal fornitore per ottenere una concentrazione finale di papaina di 22 UI/mL), portando il volume finale a 4,75 mL.
  3. Eutanasia e raccolta dei tessuti
    1. Eutanasia nei topi di 2-3 settimane di età tramite iniezione intraperitoneale di pentobarbital di sodio al 5% a 150-200 mg/kg di peso corporeo. Confermare l'anestesia profonda e la morte verificando la cessazione del battito cardiaco e della respirazione.
    2. Spruzzare accuratamente la regione oculare con etanolo al 70% prima dell'enucleazione per eliminare i contaminanti superficiali 12,13,14. Premere delicatamente il bordo periorbitale per sporgere il globo. Quindi, usa una pinza per estrarre il bulbo oculare, preservando il nervo ottico per una più facile dissezione.
      NOTA: Tutti gli strumenti (ad es. pinze, forbici) vengono sterilizzati in autoclave e le procedure vengono eseguite sotto una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità.
    3. Immergere immediatamente i bulbi oculari in un terreno di coltura sterile completo per RPE preriscaldato a 37 °C.
  4. Digestione enzimatica
    NOTA: Tutte le fasi, compresa la digestione enzimatica e le procedure successive, devono essere eseguite sotto una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità.
    1. Trasferisci il bulbo oculare in un piatto e usa una pinza per eliminare il tessuto connettivo aderente e i muscoli extraoculari residui sotto uno stereomicroscopio.
    2. Sciacquare delicatamente gli occhi 2 volte con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco preraffreddato (D-PBS; no Ca2+/Mg2+; a 4 °C).
      NOTA: Il terreno di coltura RPE completo residuo può compromettere l'attività enzimatica della papaina.
    3. Immergere completamente gli occhi in 1 mL di soluzione per la digestione della papaina e incubare a 37 °C per 45 min.
  5. Separazione delle cellule RPE
    1. Dopo la digestione, neutralizzare l'attività enzimatica con terreno di coltura RPE completo.
    2. Trasferisci il bulbo oculare in un piatto e, sotto uno stereomicroscopio, asporta la cornea, l'iride e il cristallino e conserva l'oculare posteriore.
      NOTA: Le cellule RPE sono state isolate e mantenute come fogli intatti (piuttosto che dissociarsi in singole cellule) durante l'intero processo.
    3. Separare il complesso retina-RPE dalla coroide, quindi staccare lo strato di RPE dalla retina sotto forma di fogli continui in un terreno di coltura RPE completo. Raccogliere gli strati di RPE staccati in modo uniforme in un terreno di coltura RPE fresco e completo come miscela e successivamente coltivarli su superfici rivestite con Matrigel.
  6. Coltura cellulare
    1. Seminare la miscela in una piastra a 24 pozzetti rivestita con Matrigel (8-10 bulbi oculari per pozzetto sul vetrino coprioggetti, per l'immunocolorazione), una piastra a 48 pozzetti rivestita con Matrigel (6-8 bulbi oculari per pozzetto, per qPCR) o una piastra a 96 pozzetti rivestita con Matrigel (5-6 bulbi oculari per pozzetto).
    2. Incubare a 37 °C con CO2 al 5%. Eseguire il primo cambio del terreno dopo 48 ore utilizzando il terreno di coltura RPE completo. Cambiare il supporto ogni 48 ore dopo la prima sostituzione.
      NOTA: Per mantenere il più possibile la polarità delle cellule RPE, evitare di farle passare quando possibile, poiché la subcoltura ripetuta può portare alla perdita della differenziazione e dell'integrità funzionale.
  7. Monitoraggio della morfologia cellulare
    1. Lasciare che le cellule formino un monostrato con caratteristica morfologia esagonale. Monitorare la morfologia con un microscopio per colture cellulari invertito.

2. Induzione del modello di degenerazione RPE

  1. Sintesi e verifica dell'RNA Alu
    1. Sintetizzare l'RNA dell'alluminio utilizzando un sistema di trascrizione in vitro .
      NOTA: La sintesi dell'RNA di Alu utilizzata nel nostro studio si è basata sul protocollo descritto dall'Ambati Lab6.
    2. Purificare l'RNA e confermarne la qualità utilizzando un microspettrofotometro.
  2. Trasfezione dell'RNA dell'alluminio
    NOTA: Abbiamo designato il giorno della semina primaria delle cellule di RPE come giorno 0. Il giorno 5, le cellule RPE primarie aderenti hanno mostrato una morfologia uniforme e hanno raggiunto oltre il 50% di confluenza cellulare, a quel punto la trasfezione dell'RNA Alu è stata effettuata utilizzando un reagente di trasfezione cationico a base di lipidi, secondo le linee guida del produttore.
    Per convalidare i risultati sono stati inclusi due gruppi di controllo: i) un controllo negativo (NC), in cui non è stato aggiunto né l'RNA di alluminio né il reagente di trasfezione e il terreno a basso contenuto di siero è stato utilizzato come sostituto; ii) controllo dei liposomi (LC), in cui l'RNA dell'alluminio è stato omesso ma la stessa quantità di reagente di trasfezione è stata miscelata con un terreno a basso contenuto di siero e applicata alle cellule, per controllare gli effetti associati alla lipofezione. I passaggi seguenti delineano la procedura di trasfezione dell'RNA Alu.
    1. Prima delle procedure di trasfezione, sostituire il terreno esistente con 300 μl di terreno di coltura RPE completo per pozzetto (piastra a 48 pozzetti).
    2. Preparare complessi di trasfezione con Alu RNA e reagente a base di lipidi cationici in terreno a basso contenuto di siero.
      1. Preparare la Miscela 1 con 1,2 μL di reagente a base di lipidi cationici e 18,8 μL di terreno a basso contenuto di siero. Mescolare delicatamente (senza vortici) e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
      2. Preparare la Miscela 2 con 6 μL di Alu RNA (100 μg/mL) e 14 μL di terreno a basso contenuto di siero.
      3. Preparare i complessi di trasfezione aggiungendo 20 μl di Miscela 2 goccia per goccia in 20 μL di Miscela 1.
        NOTA: L'RNA dell'alluminio è stato trasfettato a una concentrazione finale di 0,6 μg per pozzetto utilizzando 1,2 μL di reagente a base di lipidi cationici per pozzetto (1,2 μL di reagente: 0,6 μg di rapporto RNA).
      4. Sbattere delicatamente per mescolare. Quindi, lasciarlo a temperatura ambiente per 20 min.
    3. Aggiungere 40 μL/pozzetto dei complessi di trasfezione a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 °C/5% CO2 per 48 ore.
    4. Eseguire qPCR, immunocolorazione e altre procedure sperimentali 48 ore dopo la trasfezione.

3. Validazione del modello di degenerazione

NOTA: Il giorno 7 sono stati eseguiti esperimenti completi di convalida del modello.

  1. Colorazione in immunofluorescenza per la valutazione della polarità e dell'integrità della barriera
    1. Fissare le cellule RPE in coltura con formaldeide priva di metanolo al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare 3 x 10 min con 1x PBS.
    2. Bloccare il legame aspecifico con albumina sierica bovina al 5% (BSA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 1 ora.
    3. Incubare con gli anticorpi primari anti-ZO1 (diluizione 1:1.000 in BSA al 3%) e falloidina 488 (diluizione 1:1.000 in BSA al 3%) per una notte a 4 °C, evitando la luce.
    4. Lavare delicatamente le celle 3 x 10 minuti con PBS.
    5. Incubare con anticorpi secondari (diluizione 1:1.000 in BSA al 3%) per 1 ora a temperatura ambiente.
    6. Lavare i campioni 3 x 10 min con 1x PBS.
    7. Controcolorare con DAPI (diluizione 1:1.000 in PBS) per 10 min.
    8. Lavare i campioni per 3 x 10 minuti con 1x PBS.
    9. Rimuovere con cautela il vetrino coprioggetto dalla piastra a 24 pozzetti e posizionarlo su un vetrino precaricato con una goccia di mezzo di montaggio. Acquisizione di immagini confocali con un obiettivo 40x/0,95.
  2. PCR quantitativa (qPCR) per marcatori di senescenza e infiammatori
    NOTA: La gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (gene del topo Gapdh) è stata impiegata come gene di riferimento interno per la normalizzazione dei valori del ciclo di soglia (Ct). Tutte le reazioni di PCR quantitativa (qPCR) includevano tre repliche biologiche per gruppo sperimentale. Le sequenze di primer sono fornite nella Tabella Supplementare S1.
    1. Estrazione dell'RNA
      1. Aggiungere il tampone di lisi (Total RNA Kit) alla piastra di coltura (1 mL per 10 cm² di superficie) e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
      2. Centrifugare a 13.400 × g per 5 min a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta priva di RNasi.
        NOTA: Saltare questo passaggio se i campioni sono privi di detriti (ad esempio, lisato cellulare trasparente).
      3. Aggiungere 200 μl di cloroformio al surnatante, agitare per 15 s e incubare a temperatura ambiente per 3 minuti.
      4. Centrifugare a 13.400 × g per 10 min a 4 °C. Trasferire la fase acquosa superiore (~500 μL) in una nuova provetta.
      5. Aggiungere 0,5 volumi di etanolo alla fase acquosa. Miscelare delicatamente pipettando.
      6. Caricare la miscela su una colonna di membrana di silice (inclusa nel Total RNA Kit). Centrifugare a 13.400 × g per 30 s. Scartare il flusso.
      7. Aggiungere 500 μL di tampone per la rimozione delle proteine (Total RNA Kit) alla colonna. Centrifugare a 13.400 × g per 30 s. Scartare il flusso.
      8. Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio (Total RNA Kit) alla colonna. Centrifugare a 13.400 × g per 30 s. Scartare il flusso.
      9. Ripetere il passaggio precedente 3.2.
      10. Centrifugare la colonna vuota a 13.400 × g per 2 minuti per asciugare la membrana.
      11. Eluire l'RNA aggiungendo 30-100 μL di acqua priva di RNasi alla membrana. Incubare a temperatura ambiente per 2 min. Centrifugare a 13.400 × g per 2 min.
    2. Sintesi del DNA complementare (cDNA)
      1. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro a 260 nm e 280 nm.
        NOTA: Un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,0 è considerato associato a una purezza accettabile dell'RNA.
      2. Preparare la miscela di reazione in una provetta priva di RNasi: modello di RNA (500-1.000 ng): X μL (in relazione alla sua concentrazione), 5x tampone di trascrizione inversa: 4 μL, acqua priva di RNasi: fino a 20 μL.
      3. Incubare la miscela di reazione in un termociclatore utilizzando il seguente programma: 37 °C per 15 min, 85 °C per 5 s e mantenimento indefinito a 4 °C.
    3. qPCR
      1. Preparare la master mix qPCR per ogni reazione (10 μL in totale): TB Green (incluso in Premix Taq): 5 μL, Colorante ROX (incluso in Premix Taq): 0,2 μL, Primer diretto (1 μM): 0,2 μL, Primer inverso (1 μM): 0,2 μL, Acqua priva di RNasi: 3,4 μL, Modello di cDNA: 1 μL.
      2. Aggiungere 10 μl della miscela master in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
      3. Sigillare la piastra con un coperchio ottico adesivo. Centrifugare a 300 × g per 1 min.
      4. Eseguire il seguente programma su un sistema PCR in tempo reale: Fase 1: 95 °C per 30 s; Fase 2: 40 cicli di: 95 °C per 5 s, 60 °C per 30 s; Fase 3: Analisi della curva di fusione.
      5. Calcolare i livelli di espressione relativi degli mRNA bersaglio utilizzando il metodo 2−ΔΔCt 15.

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Risultati

Cellule primarie di RPE di topo prima della trasfezione dell'RNA dell'Alu
Il giorno 0 (Figura 1), le cellule primarie di RPE di topo sono state isolate e hanno mostrato la caratteristica morfologia esagonale, tipica delle cellule RPE sane. Queste cellule hanno mantenuto un monostrato ben organizzato. Le cellule sono state coltivate per consentire l'organizzazione strutturale iniziale e la formazione di giunzioni strette, come evidenziato dalla forma esagonale e dai confin...

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Discussione

Il nostro obiettivo era quello di stabilire un modello di lesione RPE riproducibile e accessibile che consentisse l'imaging ad alta risoluzione e l'analisi meccanicistica con vincoli minimi di risorse. Questo approccio ha fornito una chiara visualizzazione della disgregazione strutturale indotta dall'RNA Alu rispetto al gruppo di controllo, inclusa la frammentazione della giunzione stretta apicale e la disorganizzazione del citoscheletro basale attraverso l'imaging confocale Z-stack (dim...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal Piano d'azione per l'innovazione scientifica e tecnologica Progetto speciale di ricerca sull'innovazione medica (23Y11901300), dalla National Natural Science Foundation of China (82171076) e dalla Shanghai Municipal Education Commission (2023ZKZD18). Ringraziamo il professor L.Z per il gentile dono di Alu RNA.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cabina di sicurezza biologica di classe II, tipo A2 serie 1300Termo Scientifico
37 gradi Incubatore C/5% CO2Termo Scientifico
4% Paraformaldeide (PFA)ServicebioG1101-500ML
Alu RNA umanoRegalato da L.Z.
Anticorpo secondario anti-coniglio, Alexa Fluor 568 (capra)Invitrogen Thermo ScientificCodice: A11011
Copertura ottica adesiva Applied Biosystems MicroAmpThermo Fisher Scientifico
Applied Biosystems Piastre di reazione ottiche a 96 pozzetti MicroAmpThermo Fisher Scientifico
Sistema di PCR in tempo reale Applied Biosystems ViiA 7Thermo Fisher ScientificoSistema di PCR in tempo reale per l'analisi quantitativa dell'espressione genica
Albumina sierica bovina (BSA, frazione V)BeyotinaST023-50g
Microscopio per colture cellulari invertito Carl Zeiss PrimovertZeissPer il monitoraggio della morfologia cellulare
Centrifuga 5424 REppendorf
CloroformioSigmaSeparazione di fase nell'estrazione dell'RNA.
Microscopio a scansione laser confocale (LSM900 + Cell discover 7)ZeissImaging ad alta risoluzione di marcatori di immunofluorescenza (ad es. ZO-1 e F-actina).
Piastra a pozzetti Costar 24/48/96Corning
CoverslipThermo Fisher ScientificoUtilizzato su piastra a 24 pozzetti per l'imaging in immunofluorescenza.
DAPITermo62248
Bagno a secco digitaleMulab
DMEM/F12GibcoTerreni per far crescere le cellule RPE 
Fosfato tamponato di Dulbecco (D-PBS)ShareBioSB-CR017
Earle' s Soluzione salina bilanciata (EBSS)GibcoSoluzione salina bilanciata utilizzata per la diluizione di papaina e DNasi I durante l'isolamento dell'RPE.
Etanolo (assoluto)SigmaPrecipitazione dell'RNA e lavaggio della colonna.
Siero fetale bovino (FBS)SigmaPer terreni di coltura cellulare RPE completi
forcipePer dissezione
Lipofectamine 3000 (reagente di trasfezione a base di lipidi cationici)Thermo FisherL300015Trasfettare l'RNA dell'alluminio nelle cellule RPE
matrigelCorning356234Matrice (diluizione dell'1,14%) per lastre di rivestimento per supportare l'adesione e la polarizzazione dell'RPE.
Formaldeide senza metanoloTermo ScientificoFissativo alternativo (4%) per la conservazione degli epitopi in immunofluorescenza
MicropipettaEppendorf
Spettrofotometro Nanodrop 2000Termo ScientificoMisura la concentrazione e la purezza dell'RNA
Nikon ECLIPSE Ti-S fluorescente Microscopio invertitoNikonImaging a fluorescenza di campioni colorati
Stereomicroscopio Olympus SZX16OlimpoPer la dissezione dei bulbi oculari del topo e l'isolamento dei RPE
Opti-MEMGibcoterreno a basso contenuto di siero per la preparazione di complessi di trasfezione
Sistema di dissociazione della papainaWorthingtonLK003150Per l'enzima funzionante
Penicillina-Streptomicina GibcoPer terreni di coltura cellulare RPE completi
Pentobarbital sale sodicoSigmaAgente per l'eutanasia
Falloidina 488 Abcam176753Per la valutazione della polarità
Kit di reagenti PrimeScript RTTakaraRR037AKit di trascrizione inversa per la sintesi di cDNA (preparazione del modello qPCR)
Kit RNAsimple per RNA totaleTIANGENDP419Per l'estrazione dell'RNA
TB Verde  Premix Ex Taq  (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420APer qPCR
Anticorpo policlonale di coniglio ZO-1Proteintech21773Per la valutazione morfologica

Riferimenti

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