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Articolo metodologico

Microdissezione multilivello e profilazione funzionale-strutturale di rami arteriosi renali umani

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DOI:

10.3791/68579

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5 settembre 2025

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1Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 3Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, Peking University, 4Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 5Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Peking University

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo passo-passo per l'isolamento e la valutazione funzionale dei rami arteriosi renali umani, facilitando gli studi preclinici per lo sviluppo farmaceutico.

Abstract

La disfunzione vascolare renale svolge un ruolo critico nella patogenesi di molteplici condizioni cliniche, tra cui danno renale acuto, ischemia renale e ipertensione, presentando sfide significative nella gestione clinica e influenzando negativamente gli esiti dei pazienti. L'isolamento e la caratterizzazione funzionale delle arterie intrarenali sono fondamentali per chiarire i meccanismi alla base della disfunzione vascolare renale, in particolare correlata al danno renale, e per guidare lo sviluppo terapeutico mirato. Nonostante la sua importanza clinica, gli approcci standardizzati per isolare e valutare funzionalmente le arterie intrarenali umane a diversi livelli di ramificazione rimangono poco sviluppati. Questo protocollo fornisce un quadro completo per l'isolamento sistematico e la valutazione multimodale dei rami arteriosi intrarenali, incorporando valutazioni funzionali e strutturali sia in condizioni fisiologiche che patologiche. La metodologia comprende tre componenti chiave: (1) identificazione anatomica precisa e microdissezione delle arterie intrarenali dai reni del donatore, accompagnata da colorazione con ematossilina-eosina (H&E) per la conferma strutturale; (2) rigorose procedure di normalizzazione nella miografia a filo per migliorare la riproducibilità e l'affidabilità delle misure; e (3) analisi quantitativa delle risposte vasomotorie utilizzando tecniche di miografia a filo di precisione. La normalizzazione si basa sulla relazione lunghezza-tensione muscolare, in cui lo stretching incrementale dei segmenti arteriosi stabilisce una tensione a riposo ottimale per massimizzare la sovrapposizione actina-miosina, suscitando così risposte contrattili di picco. Nella miografia a filo, i segmenti dei vasi isolati sono sospesi tra due fili paralleli, consentendo una misurazione precisa della tensione vascolare. Applicando rigorosi protocolli di normalizzazione, questa tecnica consente una quantificazione riproducibile e affidabile della reattività vascolare in diverse condizioni fisiopatologiche e interventi farmacologici.

Introduzione

Il rene è un organo vitale responsabile del mantenimento dell'omeostasi umana attraverso l'eliminazione delle scorie metaboliche, l'equilibrio elettrolitico e la regolazione dei fluidi, funzioni che richiedono un flusso sanguigno eccezionalmente elevato. In condizioni fisiologiche, i reni ricevono circa il 25% del volume totale di sangue pompato dal cuore ogni minuto (gittata cardiaca), sottolineando il loro ruolo sostanziale nel flusso sanguigno sistemico e l'importanza critica della perfusione renale nel mantenimento dell'equilibrio fisiologico generale1. Il sistema arterioso renale regola con precisione questo massiccio afflusso di sangue per mantenere la GFR adattandosi ai cambiamenti emodinamici sistemici. Di conseguenza, la compromissione della perfusione renale rappresenta un meccanismo patologico critico che contribuisce alla riduzione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) in condizioni come l'insufficienza renale acuta e l'ischemia renale. Inoltre, si verifica frequentemente secondariamente a disturbi sistemici che compromettono il flusso sanguigno renale, tra cui shock, disfunzione cardiaca e sepsi 2,3,4,5. L'arteria renale subisce una ramificazione sequenziale all'interno del rene, dividendosi prima in arterie interlobari che scorrono attraverso le colonne renali tra le piramidi midollari. Al raggiungimento della giunzione corticommidollare, questi vasi danno origine ad arterie arcuate, che si inarcano lungo il confine tra corteccia e midollo. Da questi vasi curvilinei emergono arterie interlobulari che penetrano radialmente nel parenchima corticale, trasportando infine il sangue ai capillari glomerulari attraverso arteriole afferenti per perfondere i singoli nefroni 1,6,7. Le arterie interlobare, arcuata e interlobulare costituiscono la vascolarizzazione di resistenza chiave nel rene, fungendo da regolatori primari dell'emodinamica intrarenale e del controllo della pressione 1,8. L'isolamento e la caratterizzazione precisi di questi vasi sono fondamentali per chiarire i meccanismi fondamentali che regolano l'omeostasi della perfusione renale9. Inoltre, la loro eterogenea reattività vascolare in varie condizioni fisiopatologiche offre un quadro strategico per lo sviluppo di nuovi agenti vasodilatatori con potenziale di protezione renale10,11.

Attualmente, le tecniche di imaging clinico (ad es. ecografia) sono utilizzate di routine per monitorare le variazioni del flusso sanguigno renale; Tuttavia, le metodologie sperimentali nella ricerca di base per valutare direttamente la tensione vascolare renale, un determinante chiave della perfusione renale, rimangono limitate 12,13,14,15. Il sistema di miografia a filo è una piattaforma sperimentale ben consolidata che misura le variazioni di tensione in piccoli tessuti biologici in vitro, inclusi vasi sanguigni, trachea 16,17,18, con diametri che vanno da 50 μm a 10 mm 16,19,20. Sebbene la miografia a filo sia stata ampiamente applicata negli studi sugli animali, le differenze interspecie nella struttura e nella funzione vascolare limitano la misura in cui i vasi dei roditori possono rappresentare la fisiologia vascolare umana21. Pertanto, l'identificazione e l'isolamento precisi delle arterie intrarenali umane a vari livelli anatomici (interlobare, arcuato e interlobulare) sono fondamentali per consentire indagini in vitro complete sulle loro proprietà fisiologiche, nonché sulle alterazioni funzionali correlate alla malattia e sui meccanismi patologici di lesione. Se combinato con interventi farmacologici che utilizzano vari composti vasoattivi, questo sistema consente la valutazione dinamica e la registrazione quantitativa delle risposte di vasocostrizione/vasodilatazione in anelli arteriosi isolati, fornendo un potente strumento per studiare la reattività vascolare in condizioni sperimentali controllate 19,22,23.

Questo protocollo descrive in dettaglio una metodologia completa per la precisa localizzazione anatomica e la microdissezione dei rami dell'arteria inerenne umana (arterie interlobare, arcuata e interlobulare), seguita dalla caratterizzazione funzionale utilizzando un sistema di monitoraggio della tensione vascolare in vitro per valutare la loro reattività differenziale ai farmaci vasoattivi, stabilendo così distinzioni strutturali e funzionali tra questi segmenti vascolari. Combinando la localizzazione anatomica con la profilazione della reattività farmacologica e l'analisi istopatologica, stabiliamo una piattaforma ex vivo che consente una valutazione completa delle risposte vascolari region-specific agli agenti vasoattivi.

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Protocollo

Il protocollo e gli esempi qui descritti sono stati esaminati e approvati dal Dipartimento di Urologia del Primo Ospedale dell'Università di Pechino (approvazione n. 2023yan500-002) e condotti in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto prima della partecipazione.

1. Preparazione della soluzione

  1. Preparare la soluzione di Krebs-Ringer (Krebs) contenente 119,0 mM di NaCl, 4,7 mM di KCl, 2,5 mM di CaCl2, 1,0 mM di MgCl2, 25,0 mM di NaHCO3, 1,2 mM di KH2PO4 e 11,0 mM di D-glucosio a pH 7,4.
  2. Preparare una soluzione salina ad alto contenuto di potassio (60K+) contenente 64,0 mM di NaCl, 60 mM di KCl, 2,5 mM di CaCl2, 1,0 mM di MgCl2, 25,0 mM di NaHCO3, 1,2 mM di KH2PO4 e 11,0 mM di D-glucosio a pH 7,4.

2. Preparazione del reagente

NOTA: Conservare i farmaci secondo i dettagli forniti nella scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) subito dopo averli ricevuti.

  1. Preparare la fenilefrina (Phe, 10-1 M in magazzino) sciogliendo 167,21 mg di fenilefrina in 10 ml di dimetilsolfossido (DMSO). Conservare la soluzione madre a -80 °C, diluire a 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M come concentrazione di lavoro il giorno dell'uso.
  2. Preparare l'acetilcolina (ACh, 10-2 M in magazzino), sciogliendo 18,166 mg di acetilcolina in 10 mL di dimetil solfossido (DMSO). Conservare la soluzione madre a -80 °C, diluire a 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M come concentrazione di lavoro il giorno dell'uso.

3. Raccolta del tessuto renale e isolamento dell'arteria intrarenale

  1. Reclutare pazienti adulti con diagnosi di carcinoma a cellule renali, come confermato istologicamente dalla biopsia con ago centrale preoperatoria o dalla sezione congelata intraoperatoria.
    NOTA: I pazienti in attesa di nefrectomia radicale sono scelti specificamente perché i loro campioni chirurgici forniscono l'accesso a segmenti arteriosi intrarenali intatti situati distalmente ai margini del tumore. Questi segmenti possono essere sezionati e isolati con precisione, consentendo uno studio dettagliato della fisiologia vascolare renale umana senza interferenze da parte del tessuto maligno. La conferma istologica garantisce un'identificazione accurata del carcinoma e una chiara delineazione dei confini tumorali, facilitando la selezione di segmenti arteriosi normali e privi di tumore per le indagini sperimentali.
    1. Escludere i pazienti con comorbilità significative (ipertensione, diabete mellito o altre malattie sistemiche) per evitare influenze confondenti sulla funzione vascolare, migliorando così l'affidabilità e la rilevanza delle valutazioni fisiologiche.
      NOTA: I campioni per questo esperimento sono stati raccolti da pazienti in attesa di nefrectomia radicale presso il Primo Ospedale dell'Università di Pechino.
  2. Durante la nefrectomia radicale, raccogliere campioni di rene umano appena asportati e immergerli immediatamente in una soluzione di Krebs ghiacciata per preservare la vitalità dei tessuti. Solo le regioni macroscopicamente normali distali ai margini tumorali vengono mantenute per la dissezione arteriosa (Figura 1A).
    NOTA: Per un isolamento ottimale dell'arteria intrarenale, il tessuto sano adiacente deve essere raccolto come un cuneo corticommidollare a tutto spessore durante la nefrectomia radicale, preservando così l'intero albero arterioso dalla vascolarizzazione corticale a quella midollare.
    1. Conservare immediatamente il tessuto asportato in 200 mL di soluzione fredda di Krebs. Posizionare il contenitore sul ghiaccio e trasportarlo in una borsa termica isolata in laboratorio entro 2 ore dal prelievo. Assicurarsi che il tessuto rimanga completamente immerso durante il trasporto per preservare la vitalità e l'integrità strutturale per la successiva dissezione e analisi funzionale.
      NOTA: Per mantenere la vitalità e la funzione fisiologica dei tessuti, l'intero processo di isolamento e la successiva conservazione in soluzione di Krebs a 4 °C devono essere completati entro 6 ore 24,25,26,27. La soluzione deve essere sostituita regolarmente durante le procedure per mantenere l'ossigenazione e la vitalità dei tessuti, facilitando al contempo l'eliminazione dei componenti del sangue dal lume vascolare.
  3. Identificare visivamente il piano coronale individuando l'ilo renale e allineando il taglio in modo che passi attraverso sia la pelvi renale che il bordo convesso laterale. Usando un bisturi sterile, taglia in due il rene lungo il piano coronale per produrre due metà simmetriche. Questo approccio espone l'architettura interna, comprese le piramidi renali e le colonne, facilitando l'identificazione accurata e la successiva dissezione delle arterie intrarenali (Figura 1A).
    NOTA: Per facilitare la separazione delle arterie renali, una parte della pelvi renale, delle piramidi renali e del grasso sulla superficie della sezione trasversale deve essere rimossa per prima per esporre più vasi sanguigni (Figura 1B). Fare attenzione a non tagliare i vasi sanguigni.
  4. Sotto uno stereomicroscopio, separare meticolosamente le arterie interlobare, arcuata e interlobulare utilizzando forbici e pinze per microdissezione in un piatto di coltura a fondo nero di 10 cm (Figura 1C).
    NOTA: Nel rene umano, l'arteria interlobulare scorre attraverso le piramidi renali, caratterizzate dalla parete vascolare più spessa tra i tre rami arteriosi 1,8, con un diametro medio di circa 1-2 mm. Alla giunzione corticomidollare, l'arteria interlobare passa all'arteria arcuata, formando un arco semicircolare lungo il bordo corticomidollare, con un diametro medio di circa 500 μm. I vasi sanguigni si ramificano ulteriormente nella corteccia renale, che è l'arteria interlobulare, con la parete vascolare più sottile e il diametro più piccolo tra i tre, circa 200 μm (Figura 1C). Inoltre, quando si differenziano i tre rami vascolari, la localizzazione anatomica fornisce informazioni più critiche rispetto alle misure assolute del diametro vascolare 1,8.
    1. Rimuovere delicatamente il tessuto circostante e il grasso dalle arterie, assicurandosi di pulirle accuratamente in un piatto di coltura a fondo nero di 10 cm (Figura 1B).
  5. Utilizzare le arterie renali isolate (arterie interlobulari, arcuate e interlobari) per i seguenti esperimenti:
    1. Preparare i segmenti arteriosi per l'elaborazione istologica tagliando accuratamente i tessuti isolati a una lunghezza standardizzata di circa 3 mm, adatta per l'inclusione di paraffina e il sezionamento istologico. Fissare ogni campione in 2 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% a temperatura ambiente per 1 ora per preservare la morfologia dei tessuti. Dopo la fissazione, procedere con protocolli standard di disidratazione, pulizia e inclusione di paraffina per la successiva colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) secondo i protocolli istologici stabiliti (Figura 2).
      NOTA: Per eventuali valutazioni istologiche, i campioni possono essere sottoposti alla colorazione tricromica di Masson per valutare la deposizione di collagene o alla colorazione Verhoeff-Van Gieson (EVG) per la visualizzazione delle fibre elastiche, secondo i protocolli istologici stabiliti28,29.
    2. Per gli studi di funzionalità vascolare, conservare gli anelli intrarenali in una soluzione di Krebs ghiacciata fino al test. Gli anelli arteriosi devono essere completamente sommersi.
      NOTA: Per i successivi saggi molecolari come western blot/qPCR, congelare immediatamente i campioni freschi in azoto liquido dopo la dissezione, quindi conservarli a -80 °C seguendo le procedure precedentemente pubblicate per preservare l'integrità dell'RNA e prevenire la degradazione delle proteine30,31.

4. Montaggio dell'anello arterioso

  1. Identificare l'arteria interlobare, arcuata e interlobulare in base alle loro distinte posizioni anatomiche (Figura 1C) e agli intervalli di diametro (Figura 2), quindi sezionarle con cura in anelli lunghi circa 2 mm utilizzando le forbici da microdissezione per gli studi sulla funzione vascolare (Figura 3A).
    NOTA: Conservare immediatamente ciascun anello arterioso isolato separatamente in 5 ml di soluzione ghiacciata di Krebs fino al test funzionale. Per i test funzionali, selezionare anelli vascolari non ramificati di lunghezza compresa tra 1,5 e 2,0 mm con tagli perpendicolari netti. Escludere gli anelli superiori a 2,0 mm per evitare difficoltà di montaggio o gli anelli inferiori a 1,5 mm per evitare registrazioni di tensione instabili.
  2. Preparare tutti gli anelli arteriosi (dalle arterie interlobare, arcuate e interlobulari separatamente) come indicato al punto 4.1 e portare sia le soluzioni di Krebs che quelle 60K+ a temperatura ambiente. Quindi accendere il computer collegato, seguito dal sistema miografico a filo, assicurandosi che tutti i componenti siano inizializzati correttamente prima di procedere con gli esperimenti.
  3. Prima di montare gli anelli arteriosi nelle camere del miografo a filo, sciacquare ciascuna camera due volte con 5 ml di soluzione di Krebs per garantire la pulizia ed eliminare le sostanze residue, quindi aggiungere 5 ml di soluzione di Krebs a ciascuna camera.
    1. Riscaldare la soluzione a 37 °C utilizzando il sistema di controllo della temperatura integrato nel miografo. Contemporaneamente, aerare continuamente la soluzione con gas (una miscela di 95% O2 e 5% CO2) tramite una linea di gas collegata per mantenere un'ossigenazione e un equilibrio del pH appropriati durante l'esperimento.
  4. Preparare due fili guida lunghi 3 cm con un diametro di 40 μm per ciascun anello arterioso e trasferire con cura gli anelli arteriosi isolati in un'altra piastra di coltura a fondo nero di 10 cm contenente la soluzione di Krebs.
    NOTA: È necessario selezionare diametri diversi dei fili guida per vasi sanguigni di diametri diversi. Per l'anello arterioso con diametro pari o inferiore a circa 100 μm è necessario un filo guida da 15 μm; se il diametro è compreso tra 100 μm e 200 μm, viene utilizzato un filo guida da 25 μm; Se il diametro è maggiore di 200 μm, è possibile utilizzare un filo guida da 40 μm. Per garantire la coerenza dell'esperimento, si consiglia di utilizzare lo stesso diametro per tutti i recipienti dello stesso tipo all'interno di un singolo esperimento. 19.
  5. Inserire con cautela il primo filo guida nell'anello arterioso all'interno della capsula, piegare un lato del filo guida di 90°, quindi trasferirlo nella camera per il fissaggio sul clamp-tipo sample holder utilizzando le viti specializzate fornite dallo strumento per il serraggio delle viti in senso orario (Figura 3B).
    NOTA: Il filo guida viene inserito per fornire supporto strutturale durante il trasferimento dell'anello arterioso quando lo si monta sul portacampioni, riducendo al minimo i danni o le distorsioni indotte dalla manipolazione.
  6. Prima di fissare l'anello arterioso sul supporto, annotare la lunghezza e la larghezza del vaso. Posizionare l'anello arterioso tra i due supporti (Figura 3C) e leggere la scala micrometrica, dove 1 scala rappresenta 10 μm. Sottrarre il valore della scala misurato quando i supporti si toccano a malapena (Figura 3D) per determinare la lunghezza e la larghezza dell'anello arterioso.
  7. Infilare un altro filo guida attraverso il vaso sanguigno e infine fissarlo sull'altro lato. Avvolgere il filo guida in senso orario attorno alle viti di fissaggio su entrambi i lati e assicurarsi che sia fissato saldamente alla superficie del supporto del campione.
    NOTA: Durante l'intero processo di fissaggio, è necessario evitare di tirare il vaso sanguigno o di graffiare la parete interna del vaso sanguigno con il filo guida per evitare di danneggiare l'endotelio vascolare. Il filo guida deve essere avvolto attorno alla vite di fissaggio in un unico strato senza sovrapporsi. I due fili guida devono essere sullo stesso piano orizzontale, paralleli tra loro e non intersecarsi tra loro. Inoltre, dopo aver fissato il filo guida, regolare il portacampioni su entrambi i lati più vicino; tuttavia, dovrebbero essere vicini l'uno all'altro senza effettivamente toccarsi, in modo da evitare la forza, come mostrato nella Figura 3E e nella Figura 3F.
  8. Reinstallare la camera nel sistema miografo a filo. Quindi, coprire il coperchio e ventilare il gas. Collegare il sensore e aprire il software di acquisizione dati per il test di tensione vascolare.

5. Normalizzazione specifica del recipiente per una determinazione ottimale della tensione iniziale

NOTA: Stabilire condizioni di base stabili, definite come la tensione di riposo ottimale per la massima reattività contrattile, è fondamentale per misurazioni funzionali riproducibili. Tuttavia, a causa delle differenze fisiologiche intrinseche interindividuali, i vasi sanguigni umani mostrano una maggiore variabilità nelle proprietà meccaniche di base rispetto ai vasi sanguigni animali 32,33,34,35,36. Questi fattori, combinati con l'eterogeneità vascolare intrinseca (ad esempio, disparità strutturali e funzionali nel diametro, nello spessore della parete e nelle proprietà contrattili), portano collettivamente a variazioni significative nella tensione di base. Pertanto, per garantire la riproducibilità sperimentale, si raccomanda di normalizzare ogni vaso sanguigno individualmente. Il sistema miografico a filo include un modulo di normalizzazione dedicato, che consente di determinare con precisione la tensione di base per ciascun recipiente.

  1. Montare gli anelli arteriosi nella camera come descritto nei passaggi da 4.1 a 4.8. Avviare la registrazione della carta, azzerare il canale (Figura 4A), attendere la stabilizzazione per almeno 30 minuti, quindi azzerare nuovamente il canale prima di procedere con la normalizzazione.
  2. Selezionare Impostazioni di normalizzazione dal menu DMT (Figura 4B) e impostare i parametri come segue (Figura 4C):
    1. Calibrazione oculare (mm/div): 1; Pressione target (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; Tempo medio online (secondi): 3; Tempo di ritardo (secondi): 60.
      NOTA: IC1 indica la circonferenza interna del recipiente alla massima produzione di forza attiva, mentre IC100 rappresenta la circonferenza corrispondente a una pressione transmurale di 100 mmHg. Le arterie renali umane mostrano una sostanziale variabilità tra i campioni, che richiede una standardizzazione, a differenza dei modelli animali che hanno proprietà vascolari coerenti per la determinazione sperimentale e il riutilizzo dei rapporti IC1/IC100. A causa delle variazioni significative del diametro del vaso, dello spessore delle pareti e delle proprietà meccaniche tra i singoli esemplari umani, ogni vaso deve essere sottoposto a normalizzazione indipendente per stabilire le sue caratteristiche di base uniche. Il rapporto di 0,9 è stato quindi stabilito come segnaposto per l'inizializzazione del protocollo qui e non utilizzato in pratica in questo protocollo.
  3. Selezionare il canale corrispondente all'arteria bersaglio e aprire la schermata di normalizzazione dal menu DMT (Figura 4C), popolarla con i dati appropriati:
    1. Punti finali del tessuto: a1 dovrebbe essere 0, a2 dovrebbe essere la lunghezza del vaso (in mm); diametro del filo: 40 μm (inserire il diametro del filo utilizzato); lettura micrometrica: il valore della scala micrometrica, fare clic su Aggiungi punto per registrare il punto.
  4. Quando si è pronti, fare clic su Aggiungi punto per registrare il primo punto e avviare la procedura di normalizzazione.
  5. Applicare l'allungamento passivo, attendere 3 minuti, inserire la lettura del micrometro come punto successivo, quindi aggiungere 5 mL di 60K+ per provocare una contrazione del vaso mediata dal potassio (Figura 5).
  6. Attendere che la contrazione raggiunga un plateau. Quindi, lavare la soluzione 60K+ con 5 mL di soluzione di Krebs 3 volte e calcolare i dati sulla forza attiva dalla traccia sottraendo la forza passiva ad ogni allungamento dalla forza attivata dal potassio (Figura 5).
  7. Ripetere i passaggi da 5,5 a 5,6 (passaggi "Stretch-60K+ stimulation-Wash") fino a quando la forza attiva raggiunge il suo massimo, quindi determinare la tensione di base ottimale alla quale la produzione di forza attiva del vaso è massima (Figura 5).
  8. Equilibrare l'anello arterioso nella camera per 10 minuti prima di procedere con le fasi successive dell'esperimento.

6. Rilevamento della reattività dell'anello dell'arteria renale

  1. Assicurarsi che il volume di Krebs in ciascuna camera sia di 5 ml prima dell'inizio dell'esperimento.
  2. Per valutare la contrazione concentrazione-dipendente indotta dalla fenilefrina, applicare la fenilalanina cumulativa in incrementi di mezzo log (da 10-9 a 10-4 M)37.
  3. Iniziare con la concentrazione di fenilalanina più bassa (10-9 M). Aggiungere 5 μL di brodo di Phe (10-6 M) alla camera contenente 5 mL di tampone Krebs, monitorare continuamente e attendere che la contrazione si stabilizzi (2-3 min di tensione invariata), segnare il punto, quindi aggiungere la concentrazione successiva con un incremento di mezzo log. Ripetere fino a raggiungere la concentrazione finale (10-4 M), mantenendo un monitoraggio costante per tutto il tempo (Figura 6).
  4. Per ulteriori test antidroga, lavare la camera con 5 ml caldi di soluzione di Krebs almeno 5 volte fino a quando la tensione ritorna al basale e rimane stabile per almeno 10 minuti.
  5. Per valutare la vasodilatazione concentrazione-dipendente indotta dall'acetilcolina, applicare l'ACh cumulativo con incrementi di metà log (da 10-8 a 10-5,5 M).
    NOTA: Nel sistema vascolare normale, la risposta all'acetilcolina (ACh) funge da indicatore funzionale dell'integrità endoteliale37,38. La risposta vasodilatatoria all'ACh riflette la funzione endoteliale attraverso il rilassamento mediato da NO nei vasi sani. Tuttavia, in condizioni patologiche, questa risposta può essere attenuata o abolita a causa della ridotta biodisponibilità dell'ossido nitrico (NO) e/o dell'alterazione delle vie di segnalazione dei recettori.
  6. Contrattualizzare in anticipo i recipienti con 10-4 M Phe, aggiungere 5 μL di brodo di Phe (10-1 M) alla camera contenente 5 mL di tampone Krebs e incubare per 15 minuti. Partendo dalla concentrazione più bassa di ACh, aggiungere 5 μL di stock di Ach (10-5 M) alla camera contenente 5 mL di tampone Krebs, monitorare continuamente e attendere la risposta alla vasodilatazione (confermata dal rilevamento prolungato di tracce), segnare il punto, quindi procedere alla concentrazione successiva. Ripetere fino a quando tutti i test sono stati testati (Figura 7).
  7. Completa l'esperimento salvando il file e rimuovendo gli anelli arteriosi. Pulire accuratamente la camera incubandola con 10 mL di soluzione di acido acetico all'8% per 3 minuti, quindi risciacquare con 10 mL di acqua 3 volte. Successivamente, incubare in 10 mL di etanolo al 95% per 3 minuti e risciacquare nuovamente con 10 mL di acqua 3 volte. Infine, spegnere sia il riscaldatore che il gas, assicurandosi che tutto il liquido sia stato rimosso prima di spegnere il gas.

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Risultati

Nel rene umano, l'arteria interlobare corre tra le piramidi renali lungo la vena corrispondente. Caratterizzata da una parete vascolare relativamente spessa e da un significativo rivestimento del tessuto adiposo, questa arteria richiede una dissezione particolarmente attenta. Il tessuto adiposo circostante deve essere rimosso meticolosamente per evitare l'applicazione di una forza eccessiva durante la procedura di isolamento (Figura 1C).

L'arteria arcuata è posizi...

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Discussione

La stabilità della perfusione renale funge sia da bersaglio terapeutico critico che da finestra sulla fisiopatologia emodinamica39,40. Presentiamo un protocollo per l'isolamento gerarchico e la valutazione funzionale delle arterie renali umane da campioni di nefrectomia freschi, colmando le lacune significative nelle metodologie attuali. A differenza degli approcci esistenti limitati a campioni cadaverici o modelli animali, la no...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare i volontari per la loro partecipazione a questo studio e ringraziare anche il personale chirurgico del Dipartimento di Urologia del Primo Ospedale dell'Università di Pechino per aver fornito tessuto renale. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione municipale di scienze naturali di Pechino (F251013 a Y. Z., 7232096 a Y. L.); National Science Foundation of China (82325004, 92168114 a Y. Z., 82170422 a Y. L.); Programma nazionale di ricerca e sviluppo chiave della Cina (2021YFF0501401, 2018YFA0800501 a Y. Z., 2021YFF0501404 a Y. L., 2023YFC2415500 a L. Y.); Progetto di ricerca del Terzo Ospedale dell'Università di Pechino nel Laboratorio Chiave Statale di Omeostasi Vascolare e Rimodellamento (Università di Pechino; 2024-VHR-SY-07 a Y.Z.); 2023 Commissione sanitaria municipale di Pechino Capitale Scienza medica e tecnologia Innovazione Realizzazione Trasformazione Progetto di eccellente programma di promozione (da YC202301QX0162 a L. Y.); Finanziamento nazionale della ricerca clinica ospedaliera di alto livello (risultati scientifici e tecnologici, trasformazione, incubazione del fondo di orientamento, progetto del primo ospedale dell'Università di Pechino, 2024CX24 a L. Y.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cloruro di acetilcolinaSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermaniaCodice: A6625
Piatto di coltura a fondo neroDanese Myo Technology, Aarhus, Danimarca300412
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, CinaA501330
D-glucosioSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, CinaA610219
Pinza di DumontDanese Myo Technology, Aarhus, Danimarca300413
Forbice da dissezione GeuderDanese Myo Technology, Aarhus, Danimarca400431
Filo guidaDanese Myo Technology, Aarhus, Danimarca400447Diametro 40 µ m
KclSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, CinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, CinaA100781
LabChart Professional versione 8.3 ADInstruments, Australia-
MgCl2· 6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, CinaA100288
Sistema multi miografo Danese Myo Technology, Aarhus, Danimarca620 milioni
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, CinaA100241
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, CinaA100865
FenilefrinaSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermaniaP6126

Riferimenti

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