La progettazione e l'applicazione di peptidi inibitori per una rapida sottoregolazione in vitro dei livelli di modifiche post-traduzionali in un sito specifico

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo che delinea le specifiche di progettazione, gli standard di controllo della qualità e il sistema di verifica funzionale di TAT-PIP, un peptide che inibisce le modifiche post-traduzionali.

Abstract

Le proteine sono i principali esecutori delle attività vitali e sono regolate a livello trascrizionale, traduzionale e di modificazione post-traduzionale (PTM). Inoltre, il PTM rappresenta un meccanismo più complicato per la regolazione dell'attività proteica poiché una proteina ha generalmente vari tipi di PTM e più siti per un PTM specifico. La trasfezione plasmidica o lentivirus e adenovirus potrebbero essere utilizzati nello screening iniziale del sito PTM funzionalmente importante tra tutti i siti identificati; Tuttavia, questi metodi devono sempre affrontare sfide come la bassa efficienza nell'ingresso di cellule e tessuti, il dispendio di tempo e costi elevati, la potenziale reazione immunitaria, ecc. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente sviluppato e impiegato con successo un tipo di peptide ricombinato chiamato TAT-PIP, peptide inibitorio PTM coniugato TAT. TAT-PIP è costituito da un modulo TAT che facilita l'ingresso di cellule e tessuti e da un modulo PIP che riduce in modo specifico il PTM in siti mirati attraverso il legame competitivo. Qui, presentiamo un protocollo che delinea le specifiche di progettazione, gli standard di controllo della qualità e il sistema di verifica funzionale di TAT-PIP. Nella sezione di progettazione, descriviamo la consistenza, la lunghezza opzionale, la specificità e la conservazione di TAT-PIP. Successivamente, introduciamo i requisiti dei test di qualità di TAT-PIP, che ne garantiscono l'efficacia e la sicurezza. Nell'applicazione della parte TAT-PIP, abbiamo introdotto il test del gradiente di concentrazione di TAT-PIP, il processo di incubazione delle cellule testate e la successiva rilevazione fenotipica. In sintesi, descriviamo un metodo efficace per lo screening dei siti PTM abbattendo selettivamente un sito specifico e osservando il fenotipo risultante per dedurne la funzione. Grazie al suo basso costo sintetico e all'elevata efficienza, questo metodo supera i limiti delle tecnologie esistenti, come la trasfezione plasmidica.

Introduzione

Le proteine sono i principali esecutori delle attività vitali e i loro processi di regolazione biologica coinvolgono due aspetti fondamentali della regolazione dell'espressione genica: la trascrizione genica e la traduzione dell'mRNA. Tuttavia, negli ultimi decenni, la modificazione post-traduzionale (PTM) è diventata un altro meccanismo indispensabile per regolare le funzioni cellulari¹. La fosforilazione, il PTM più noto ai ricercatori, svolge un ruolo particolarmente importante nelle funzioni fisiologiche. Ad esempio, dopo che la chinasi regolata dal segnale extracellulare (ERK) è fosforilata dalla chinasi MEK nei siti Thr202 e Tyr204, la sua conformazione cambia, esponendo il sito attivo, che attiva le proteine bersaglio a valle, come i fattori di trascrizione². Al contrario, quando la Ser9 N-terminale di GSK-3β è fosforilata dalla chinasi Akt/PKB, la sua tasca di legame al substrato è bloccata, portando ad una perdita dell'attività chinasica³. L'ubiquitinazione è un altro importante PTM che regola vari processi cellulari attraverso l'attaccamento covalente delle molecole di ubiquitina alle proteine del substrato. L'ubiquitina contiene 7 residui di lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) e una metionina N-terminale (M1). Il legame delle catene di ubiquitina in siti diversi impartisce destini diversi alle proteine del substrato. La funzione primaria dell'ubiquitinazione legata a K48 è quella di marcare le proteine del substrato per la degradazione da parte del proteasoma⁴. Al contrario, la funzione primaria dell'ubiquitinazione legata a K63 è quella di impegnarsi nella trasduzione del segnale non degradativo, come la riparazione del danno al DNA, le risposte infiammatorie e l'endocitosi⁵. Negli ultimi anni, con il rapido progresso delle tecnologie proteomiche, è stato scoperto un numero crescente di nuovi PTM. Oltre all'acetilazione classica, sono state identificate nuove acilazioni come la propionilazione, la crotonilazione e la glutarilazione⁶. Nel campo delle modificazioni istotoniche, la lattosilazione degli istoni interferisce con la modificazione dell'RNA m⁶A e l'omeostasi del microambiente immunitario⁷. Nel campo delle modificazioni non istoniche, la riduzione della crotonilazione dell'ATP5O è un importante fattore dannoso nella sottoregolazione del metabolismo dei fosfolipidi⁸.

Condurre ricerche sul PTM richiede un avanzamento sistematico dell'analisi del proteoma⁹ del PTM. Questo campo comprende due principali direzioni di ricerca: l'analisi dei profili PTM a livello dell'intero proteoma e l'identificazione completa dei siti PTM di una specifica proteina. Sebbene la moderna spettrometria di massa sia in grado di identificare efficacemente vari tipi di PTM e i siti specifici, lo screening e la convalida dei siti funzionali chiave rimane una sfida scientifica fondamentale che limita il progresso della ricerca. Stabilire strategie efficienti di screening dei siti è il primo passo verso la risoluzione della funzione dei principali siti normativi. I metodi tradizionali prevedono la costruzione di plasmidi mutanti per siti specifici (mutazioni inattivanti, mutazioni attivanti), l'introduzione in cellule bersaglio attraverso tecniche di trasfezione in vitro e la valutazione sistematica dei cambiamenti negli indicatori fenotipici come la proliferazione cellulare, l'apoptosi e lo stress ossidativo. Tuttavia, questa strategia incontra ostacoli tecnici significativi nei modelli cellulari trascrizionalmente silenti come gli ovociti e i sistemi di coltura tissutale primaria. Sebbene il sistema di trasduzione lentivirale o adenovirale possa parzialmente superare il problema dell'efficienza della trasfezione, la sua applicazione deve affrontare una duplice sfida: elevati costi economici e bassa efficienza di penetrazione delle particelle virali in modelli di tessuto in vitro . Mentre la strategia di costruire topi knock-in mutanti è estremamente duratura e costosa. Nel complesso, è urgente sviluppare strategie economiche ed efficienti per lo screening iniziale dei siti PTM funzionalmente importanti.

Negli ultimi anni, il nostro team ha sviluppato e impiegato con successo una tecnica di downregulation rapida del PTM chiamata TAT-PIP, peptide inibitorio del PTM coniugato con TAT, basata sull'inibizione competitiva del polipeptide. Il suo vantaggio principale è la sua universalità e l'elevata efficienza per lo screening preliminare di siti PTM funzionalmente importanti, che fornisce una base cruciale per analisi approfondite dei meccanismi molecolari dei siti PTM chiave. Questo studio chiarisce sistematicamente il quadro principale e il processo di implementazione del TAT-PIP e dimostra la sua efficacia nella regolazione del livello di PTM in un sito specifico attraverso dati sperimentali rappresentativi.

Protocollo

1. Progettazione della sequenza TAT-PIP

NOTA: TAT-PIP è costituito da due parti di peptidi (Figura 1): La parte N-terminale è TAT, CYGRKKRRQRRR, che rimane invariato per ogni TAT-PIP e può aiutare a entrare in modo efficiente in cellule coltivate in vitro o tessuti in vivo ; la parte C-terminale è una sequenza polipeptidica attorno al sito specifico di PTM (Figura 1, solitamente lisina nel simbolo "K", evidenziato in rosso) di una proteina oggetto. La lunghezza del PIP è di circa 10-15 residui di AA (se più lungo, il costo aumenta; se più corto, la specificità diminuisce significativamente).

1. Ottimizza la sequenza di PIP attraverso l'analisi di esplosione (Figura 2).
   1. Accedi a https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, fai clic sulla ricerca blastp per le sequenze proteiche.
   2. Copiare la sequenza proteica target nella finestra di immissione della sequenza di query .
   3. In Scegli ricerca selezionare l'opzione Database standard . Selezionare l'opzione blastp (proteina-proteina BLAST) nella selezione del programma. Infine, fai clic sul pulsante BLAST (Figura 2B).
   4. Seleziona segmenti peptidici con la massima specificità come PIP candidati.
2. Condurre un confronto di omologia tra esseri umani e topi per il PIP finale.
   1. Accedi a https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, fai clic sulla ricerca blastp per le sequenze proteiche.
   2. Copia le sequenze della proteina sia dalla specie umana che da quella murina e incollale nella casella della sequenza di input.
   3. Fai clic sul pulsante di invio per ottenere i risultati.
   4. Selezionare un PIP con omologia del 100% tra uomo e topo (Figura 2C).
3. Determinare la composizione del TAT-PIP, che consiste nel TAT N-terminale e nel PIP C-terminale.

2. Sintesi e verifica della qualità del TAT-PIP

1. Seleziona un'azienda con una vasta esperienza di progetto per garantire una purezza dei peptidi non inferiore al 98% con la spettrometria di massa, evitando impurità che potrebbero influire sugli esperimenti successivi.
   NOTA: Il livello di endotossina del polipeptide deve essere di ≤10 e deve essere privo di agenti patogeni.

3. L'applicazione del TAT-PIP

1. Utilizzare acqua ultrapura priva di agenti patogeni per sciogliere TAT-PIP e raggiungere una concentrazione di 10 mg/mL. Erogare il brodo in piccoli tubi per evitare ripetuti cicli di gelo-scongelamento, che causeranno una parziale denaturazione.
   NOTA: L'aggiunta dell'1% di dimetilsolfossido (DMSO) aiuterà a proteggere la struttura del TAT-PIP.
2. Trattare le cellule con TAT-PIP.
   1. Coltura di cellule 293T di rene embrionale umano nel terreno di Eagle's Modified di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina in condizioni di coltura standard (37 °C, 5% di CO₂).
      NOTA: Dopo la semina, le cellule sono state coltivate per circa 12 ore ed è stato eseguito il trattamento TAT-PIP quando la confluenza ha raggiunto circa il 70%.
   2. Diluire il TAT disciolto a 1 mg/mL utilizzando PBS, quindi aggiunto direttamente al terreno di coltura cellulare al dosaggio appropriato (concentrazione finale raccomandata del terreno di coltura: 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,4 mg/mL) per 24 ore.
   3. Lavare le cellule con il terreno di coltura originale 3 volte.
   4. Eseguire l'analisi western blot per verificare l'entità della sottoregolazione del PTM.
      NOTA: Sulla base dell'esperienza e dei successivi risultati sperimentali, la concentrazione finale ottimale di TAT-PIP è di 0,1 mg/mL.

4. Macchia occidentale

1. Preparare campioni di proteine cellulari.
   1. Lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 3 volte, aggiungere 200 μL di tampone di lisi del saggio di radioimmunoprecipitazione forte (RIPA) (con l'aggiunta dell'inibitore della fenilmetilsulfonilfluoruro [PMSF]-proteasi) nel pellet cellulare e incubare per 5 minuti per la lisi preliminare, raschiarle via con un raschietto cellulare.
   2. Sonicare la miscela utilizzando un frantoio ad ultrasuoni al 12% di intensità energetica per 5 s.
   3. Raffreddare il lisato cellulare su ghiaccio per 30 minuti e centrifugare a 13400 g a 4 °C per 10 minuti.
   4. Trasferire il surnatante contenente proteine in una provetta da centrifuga da 1,5 mL pre-raffreddata. Aggiungere 1/4 del volume di 5x tampone campione al surnatante (concentrazione finale 1x).
   5. Agitare il composto, scaldarlo a 95 °C per 5 minuti in un termostato asciutto e raffreddare con ghiaccio per 2 minuti.
   6. Misurare la concentrazione proteica totale utilizzando un saggio Bradford su un Nanodrop.
2. Eseguire l'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE).
   1. Utilizzare un gel risolutivo al 12% e un gel di impilamento al 4% per la SDS-PAGE.
   2. Pipettare i campioni di proteine nei pozzetti in base al volume specificato.
   3. Accendere l'apparecchio per elettroforesi e farlo funzionare prima a 80 V, 300 mA per 30 minuti per allineare le bande all'interfaccia tra i gel di impilamento e di risoluzione. Quindi, eseguire a 120 V, 300 mA per 45 minuti per risolvere le proteine.
   4. Trasferire le proteine dal gel alla membrana in fluoruro di polivinilidene (PVDF) utilizzando un apparato di trasferimento rapido.
3. Eseguire il blocco, l'incubazione degli anticorpi e la visualizzazione.
   1. Bloccare la membrana in PVDF in latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata con Tris contenente lo 0,1% di Tween 20 (TBST) e incubare a temperatura ambiente (RT) per 1 ora.
   2. Incubare la membrana con l'anticorpo primario diluito 1:1000 in latte scremato al 5%/PBST per una notte a 4 °C su un rotatore.
   3. Lavare la membrana tre volte con TBST (10 minuti ciascuna).
   4. Incubare la membrana con l'anticorpo secondario diluito 1:1000 in latte scremato al 5%/TBST a RT per 1 ora.
   5. Lavare la membrana tre volte con TBST (10 minuti ciascuna).
   6. Esporre la membrana in una serie temporale (5 s, 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, 120 s) per ottenere l'immagine ottimale sotto un dispositivo a chemiluminescenza elettrogenerata (ECL).

5. Validazione funzionale di TAT-PIP in cellule in coltura in vitro

1. Rileva i livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) cellulari.
   1. Piastra di 293T con una densità ottimale di 1 x 10⁵ cellule/pozzetto in una piastra di coltura a 24 pozzetti.
   2. Trattare le cellule con il peptide inibitorio della crotonilazione (THCIP) dell'istone3 coniugato con TAT 116 (0,1 mg/mL) per 24 ore, quindi lavare le cellule con PBS.
   3. Incubare le cellule con 10 μM di dicloro-diidro-fluoresceina diacetato (DCFH-DA) in DMEM privo di siero a 37 °C al buio per 20 minuti.
   4. Acquisisci immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito e misura l'intensità della fluorescenza utilizzando la funzione Misura in ImageJ.
      NOTA: È stato utilizzato il set di filtri FITC, con un filtro di emissione da 465-495 nm, uno specchio dicroico 505A e un secondo filtro di emissione da 512-550 nm.
2. Saggio di proliferazione cellulare
   1. Seminare le cellule 293T a una densità ottimale di 1 x 10⁵ cellule per pozzetto in una piastra di coltura a 24 pozzetti.
   2. Aggiungere 10 μl di reagente CCK-8 a ciascun pozzetto.
   3. Incubare le cellule a 37 °C per 2 ore.
   4. Registrare l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre e sottrarre il segnale di fondo dai pozzetti bianchi (mezzo + CCK-8).
   5. Normalizzare i dati per calcolare la vitalità cellulare.
3. Rilevamento dei livelli cellulari di ATP
   1. Lisi le cellule con un tampone di lisi. Centrifugare il lisato a 12.000 × g per 5 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante per la successiva analisi.
   2. Diluire la soluzione standard di ATP con il tampone di lisi per creare un gradiente di concentrazione di 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM e 5 μM.
   3. Aggiungere 20 μl di soluzione di rilevazione dell'ATP a ciascun pozzetto contenente il surnatante cellulare o lo standard ATP.
   4. Misurare immediatamente il segnale luminescente utilizzando un lettore di micropiastre.
      1. Fare clic su Layout piastra, quindi selezionare il modello di piastra corrispondente in Modifica modello piastra per impostare i campioni (standard e campioni).
      2. Quindi fare clic su Protocollo a sinistra, scegliere il pulsante Chemiluminescenza , quindi fare clic su Avvia per avviare il rilevamento.
   5. Generare una curva standard dai segnali luminescenti degli standard ATP e utilizzarla per quantificare la concentrazione di ATP nel surnatante cellulare.

Risultati

Questo studio descrive una strategia che utilizza TAT-PIP per sottoregolare il livello di PTM di una proteina bersaglio in un sito specifico in base all'inibizione competitiva. In un esempio tipico, il TAT-PIP qui è rinominato specificamente come THCIP. Comprende due moduli funzionali: (1), il peptide N-terminale-penetrante nelle cellule TAT (CYGRKKRRQRRR), che consente al THCIP di penetrare nelle cellule; (2) la sequenza C-terminale attorno a K116 di H3, AIHAKRVTIMPKD, che compete specificamente con l'H3 endogeno per es...

Discussione

In questo protocollo, i passaggi seguenti sono fondamentali. In primo luogo, il disegno TAT-PIP affronta la specificità del peptide. In secondo luogo, ottimizzare l'applicazione e la concentrazione finale; La concentrazione ottimizzata deve essere accuratamente testata per ottenere un abbattimento efficiente e rapido. In terzo luogo, per verificare l'effetto del TAT-PIP, si raccomandano più esperimenti piuttosto che fare affidamento su un singolo esperimento per confermare i suoi effetti...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sistema di imaging multifunzionale automatico	Tanon	4600	L'esposimetro identifica e visualizza le bande proteiche bersaglio rilevando i segnali di fluorescenza o chemiluminescenza sulla membrana dopo il trattamento di sviluppo.
Kit per il conteggio delle cellule-8	GLPBIO	GK10001	Sulla base della correlazione tra la vitalità metabolica cellulare e il numero di cellule, questo metodo valuta la capacità proliferativa delle cellule misurando la capacità di riduzione delle cellule ai reagenti CCK-8
Dulbecco' s Aquila modificata' Il terreno	Gibco	11995065	Dulbco (DMEM) è un terreno basale ampiamente utilizzato per supportare la crescita di un'ampia gamma di cellule di mammifero.
Substrato chemiluminescente ECL	ECL Biosharp	BL520B	generano segnali luminosi attraverso reazioni di chemiluminescenza che consentono il rilevamento di proteine o acidi nucleici specifici.
Apparecchio per elettroforesi	Tanon	EPS600	Il ruolo principale dell'apparecchio per elettroforesi è quello di separare e analizzare macromolecole biologiche ‌
Kit per il dosaggio dell'ATP potenziato	Beyotime	S0027	Il kit è in grado di rilevare efficacemente il livello di ATP dei campioni
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	16000-044	Il siero fetale bovino (FBS) fornisce nutrienti essenziali e fattori di crescita per il mantenimento e la crescita cellulare.
GenScript eBlotL1	GenScript	L00686	Il dispositivo è altamente efficiente ed è in grado di ottenere rapidamente il trasferimento di proteine dal gel di poliacrilammide alla membrana PVDF entro 15 minuti
Microscopio a fluorescenza invertito	Olympus Corporation	IX73	La microscopia a fluorescenza utilizza la luce ultravioletta come fonte di luce per irradiare l'oggetto esaminato per farlo emettere fluorescenza, quindi osservare la forma e la posizione dell'oggetto sotto il microscopio.
Spettrofotometro UV-Vis per microvolumi NanoDrop2000	Thermo Scientific	2000	NanoDrop è stato utilizzato per determinare la concentrazione di membrana PVDF di DNA o RNA
	BioRAD	1620177	Questo tipo di membrana PVDF ha un'eccellente resistenza chimica e un'elevata capacità di legare le proteine
Kit di analisi ROS	Beyotime	S0033S	Il kit è in grado di rilevare con precisione il livello di specie reattive dell'ossigeno nelle cellule
Peptide inibitorio della crotonilazione del coniugatore TAT-H3K16	Nanjing Taopu Biotechnology Co., LTD	CN218107533U	Può competere specificamente con l'H3 endogeno per essere crotonilato a K16
TBST	Biosharp	BL602A	TBST può pulire le sostanze irrilevanti sulla membrana, ridurre gli errori sperimentali e garantire l'accuratezza dei risultati sperimentali ‌
Frantoio ad ultrasuoni	LICHEN	LC-AUD-150P	Le funzioni principali dell'apparecchio includono la frammentazione cellulare, la dispersione di particelle e l'emulsione
Varioskan LUX	Thermo Fisher	VL0000D0	possono ottenere analisi quantitative ad alta produttività di campioni biologici rilevando i segnali ottici (come assorbanza, fluorescenza o luminescenza) dei campioni nelle micropiastre

di Eagle's modificato di I substrati I lettori di micropiastre