Funzione dell'arteria renale e istopatologia legata ai metaboliti plasmatici e fecali nei pazienti con insufficienza cardiaca

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per lo sviluppo di una piattaforma multimodale per chiarire la disfunzione vascolare renale guidata da metaboliti cardiaci nella sindrome cardiorenale.

Abstract

Il microbiota intestinale e i suoi co-metaboliti ospite-microbo associati sono sempre più riconosciuti come regolatori chiave dell'equilibrio metabolico sistemico e dell'asse cardiorenale, in particolare nel contesto della sindrome cardiorenale. Sebbene l'evidenza clinica indichi che la disfunzione cardiaca può avviare o esacerbare alterazioni patologiche renali, le molecole chiave di segnalazione metabolica che mediano l'asse cardiorenale e i loro meccanismi sottostanti rimangono sfuggenti. Questo studio stabilisce una nuova piattaforma di ricerca sistematica che integra le firme cardiometaboliche con l'analisi della funzione vascolare renale, comprendente: (1) Isolamento ed estrazione di metaboliti plasmatici/fecali da pazienti con insufficienza cardiaca; (2) Tecniche di isolamento vascolare renale ex vivo e di coltura primaria; (3) Un quadro di valutazione multimodale per le interazioni metaboliche cardiorenali, che includa saggi funzionali vascolari, test biochimici molecolari per i marcatori di danno vascolare renale e analisi istopatologiche. Rispetto ai controlli sani, i metaboliti dei pazienti con insufficienza cardiaca hanno compromesso la funzione vascolare renale e indotto risposte infiammatorie, evidenziando il loro potenziale come biomarcatori funzionali nella sindrome cardiorenale. Questo studio non si concentra su un metabolita specifico; pertanto, in studi futuri sarà necessaria un'ulteriore identificazione e convalida dei tipi specifici di metaboliti che esercitano effetti patogeni utilizzando tecniche analitiche come LC-MS/MS e NMR. L'applicazione di questa piattaforma ha rivelato che i metaboliti associati alle malattie cardiache compromettono la funzione vascolare renale e l'omeostasi. Questi risultati forniscono una visione meccanicistica dei driver metabolici delle interazioni cardiorenali e offrono uno strumento traslazionale per identificare nuovi biomarcatori e bersagli terapeutici.

Introduzione

La sindrome cardiorenale (CRS) è una condizione patologica complessa caratterizzata da un danno bidirezionale tra cuore e reni. L'intricata interdipendenza tra questi due organi fu descritta per la prima volta da Robert Bright nel 1836, che documentò sistematicamente significativi cambiamenti strutturali nel cuore associati^{a una malattia} renale avanzata. La prevalenza della CRS è fortemente legata alla coesistenza di malattie cardiovascolari (CVD) e malattie renali croniche (CKD). Gli studi indicano che circa il 30% dei pazienti con insufficienza cardiaca ha anche la CKD, mentre il 44%-51% dei decessi nei pazienti con CKD sono direttamente attribuiti a eventi cardiovascolari².

La gestione della CRS presenta diverse sfide significative. In primo luogo, l'assistenza clinica rimane frammentata, con una mancanza di coordinamento interdisciplinare e di meccanismi di allerta precoce, che spesso porta a interventi ritardati durante la fase³ di scompenso. In secondo luogo, le attuali strategie di trattamento si trovano di fronte a un dilemma paradossale. Le terapie convenzionali, come i diuretici e gli inibitori del sistema renina-angiotensina-aldosterone (RAAS), possono alleviare i sintomi dell'insufficienza cardiaca⁴; tuttavia, il loro uso prolungato o ad alte dosi può attivare il RAAS e il sistema nervoso simpatico (SNS), esacerbando l'ipossia renale e la fibrosi, contribuendo in ultima analisi alla resistenza ai diuretici e al peggioramento della funzionalità renale⁵. Allo stesso modo, mentre gli inibitori dell'enzima di conversione dell'angiotensina (ACEI) e i bloccanti del recettore dell'angiotensina (ARB) possono mitigare il danno cardiorenale, il loro uso clinico è spesso limitato a causa delle preoccupazioni per l'elevata creatinina sierica o l'iperkaliemia, con solo il 30%-40% dei pazienti in grado di tollerare la terapia a lungo termine⁶.

Alla luce di queste sfide, vi è un urgente bisogno di identificare biomarcatori precoci efficaci e di ottenere una comprensione più approfondita della patogenesi della CRS per facilitare la scoperta di nuovi bersagli terapeutici. Tuttavia, le attuali limitazioni nell'identificazione di mediatori utilizzabili del crosstalk cardiorenale - in particolare i metaboliti specifici della malattia che collegano direttamente la disfunzione cardiaca al danno vascolare renale - ostacolano i progressi nella risoluzione di queste esigenze cliniche insoddisfatte. Evidenze emergenti suggeriscono che i metaboliti associati alle malattie cardiache possono fungere sia da biomarcatori diagnostici che da driver meccanicistici della CRS riprogrammando l'omeostasi vascolare renale, ma il loro ruolo spazio-temporale nell'avvio o nell'amplificazione del danno renale rimane scarsamente caratterizzato ^7,8,9. Studi recenti hanno dimostrato che i metaboliti endogeni come le ceramidi possono aggravare attivamente l'infiammazione vascolare e il rimodellamento, in particolare in condizioni cardiorenali, evidenziando la più ampia rilevanza del rilevamento dei metaboliti nella patologia vascolare¹⁰.

Tra i compartimenti renali colpiti nella CRS, il sistema vascolare è sempre più riconosciuto come bersaglio primario e precoce di lesione. La disfunzione endoteliale nel microcircolo renale, caratterizzata da ridotta biodisponibilità dell'ossido nitrico, stress ossidativo ed elevata espressione di mediatori pro-infiammatori e pro-trombotici, contribuisce alla rarefazione microvascolare, all'aumento della permeabilità vascolare e all'ipossia regionale¹¹. Parallelamente, anche le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), essenziali per la regolazione del tono e della compliance arteriosa, sono vulnerabili alla disregolazione metabolica nella CRS. Prove sempre più numerose indicano che i metaboliti associati alla malattia possono alterare la contrattilità della VSMC, promuovere il rimodellamento disadattivo e contribuire ad aumentare la rigidità vascolare e la perfusione renale compromessa. Nonostante il loro ruolo fondamentale, i meccanismi di disfunzione vascolare guidati dalla muscolatura liscia rimangono poco esplorati negli attuali modelli di CRS ^8,12. Questi cambiamenti fisiopatologici non solo esacerbano il danno renale, ma promuovono anche l'attivazione neuroormonale disadattiva e i disturbi emodinamici sistemici, compromettendo ulteriormente la funzione cardiaca e perpetuando la progressione della CRS¹³. Pertanto, il targeting del danno vascolare renale offre una finestra meccanicisticamente informativa sulla patogenesi precoce della CRS e fornisce un focus razionale per lo studio delle interazioni metaboliche cuore-rene.

Per affrontare queste lacune, il nostro studio dà priorità all'identificazione sistematica e alla convalida funzionale dei metaboliti associati all'insufficienza cardiaca come regolatori centrali della progressione della CRS. Questo lavoro colma la disconnessione critica tra la scoperta di biomarcatori osservazionali e la ricerca sulla patogenesi meccanicistica, delineando come questi metaboliti inducono disfunzione vascolare renale, attivano cascate infiammatorie e compromettono i meccanismi di riparazione dei tessuti. I modelli tradizionali utilizzati per studiare la CRS, inclusi modelli animali, colture cellulari in vitro e organoidi derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), hanno^{ciascuno dei limiti}. I modelli animali soffrono di differenze interspecie che limitano la rilevanza clinica. Le colture in vitro mancano di integrazione a livello di organo, mentre gli organoidi derivati da iPSC, sebbene in grado di modellare le interazioni tra cellule epiteliali tubulari cardiomiocitarie e tubulari, rimangono funzionalmente immaturi e sono limitati alle prime fasi di sviluppo¹⁵. Inoltre, gli attuali sistemi di organoidi vascolari sono costituiti principalmente da monostrati endoteliali o microvasi primitivi, privi dello strato di muscolatura liscia contrattile e delle letture funzionali necessarie per valutare le risposte a livello di vaso al danno metabolico¹⁶.

Al contrario, la nostra piattaforma impiega metaboliti cardiaci di origine umana e vascolarizzazione renale umana ex vivo , consentendo arterie renali umane ex vivo fisiologicamente rilevanti e strutturalmente intatte, consentendo un'analisi fisiologicamente rilevante e meccanicamente informativa delle interazioni metaboliche cardiorenali all'interfaccia vascolare. Ciò fornisce un vantaggio unico nella modellazione della comunicazione metabolica interorgano che è alla base della progressione della sindrome cardiorenale. La nostra pionieristica piattaforma di ricerca cardiorenale integrata sinergizza tre innovazioni fondamentali: profilazione metabolomica di metaboliti plasmatici/fecali derivati da insufficienza cardiaca, sistemi di isolamento/coltura renovascolare ex vivo e valutazione funzionale-molecolare-istopatologica multimodale. Ogni componente di questa piattaforma è stato ottimizzato per la riproducibilità e la rilevanza traslazionale, compreso l'uso di 200 μL di plasma o 0,1 g di materiale fecale per campione, l'incubazione di segmenti di arteria renale umana di 2 mm a 37 °C con il 5% di CO₂ per un massimo di 24 ore e il rilevamento quantitativo basato sulla reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR) dei marcatori di lesioni vascolari. Questo sistema non solo decifra il potenziale diagnostico delle firme dei metaboliti, ma collega anche direttamente i loro contributi causali alla patologia CRS, consentendo l'identificazione del bersaglio terapeutico attraverso la mappatura a livello molecolare della disregolazione metabolica interorgano. Collegando la scoperta meccanicistica con la traduzione clinica, questo paradigma duale sposta la gestione della CRS dal controllo reattivo dei sintomi a interventi proattivi basati su biomarcatori.

Protocollo

I protocolli sperimentali e le metodologie di caso impiegati in questo studio sono stati approvati eticamente dal Dipartimento di Urologia del Primo Ospedale dell'Università di Pechino (Codice di revisione etica: 2023yan500-002) e dal Peking Union Medical College Hospital (approvazione n. I-23PJ585), con la stretta aderenza ai principi delineati nella Dichiarazione di Helsinki. Per questo studio, abbiamo reclutato pazienti di sesso maschile o femminile ricoverati presso il Peking Union Medical College Hospital (PUMCH) da luglio 2019, con diagnosi di insufficienza cardiaca (HF) da almeno due cardiologi esperti. Un totale di quattro pazienti con scompenso cardiaco (HF1-HF4) sono stati inclusi per l'estrazione del plasma e dei metaboliti fecali. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i soggetti prima della loro inclusione nella ricerca. L'apparato sperimentale e i reagenti sono riportati nella Tabella dei Materiali.

1. Elaborazione di campioni plasmatici e fecali-estrazione di metaboliti polari

1. Raccolta campioni
   1. Raccogli tutti i campioni di plasma e feci in provette di raccolta sterili e preraffreddate e congelali immediatamente in post-raccolta con azoto liquido. Conservare i campioni a -80 °C fino alla lavorazione.
   2. Per garantire la stabilità dei metaboliti, elaborare tutti i campioni entro un ciclo di congelamento-scongelamento e non lasciare che l'intervallo di tempo tra la raccolta e l'estrazione del campione superi le 2 settimane.
      NOTA: Queste misure sono state adottate per ridurre al minimo la degradazione dei metaboliti e garantire la riproducibilità nelle analisi metabolomiche a valle.
   3. Estrarre i metaboliti dai campioni fecali e plasmatici seguendo rispettivamente i passaggi del protocollo 1.3 o 1.4.
2. Popolazione oggetto dello studio
   1. Effettua le misurazioni della pressione sanguigna di base e registra le storie dei farmaci di tutti i partecipanti.
   2. Raccogliere campioni di pazienti prima di qualsiasi deterioramento clinico acuto, escludendo gli individui con comorbidità metaboliche maggiori (ad es. diabete, ipertensione primaria) per ridurre al minimo i fattori confondenti nell'analisi metabolomica (Tabella supplementare S1).
   3. Ottenere informazioni cliniche per ogni soggetto utilizzando procedure standard.
3. Estrazione al plasma
   1. Centrifugare il siero grezzo a 14.000 × g per 10 minuti (4-8 °C). Raccogliere il surnatante in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
   2. Aggiungere metanolo refrigerato (-80 °C) di grado HPLC per ottenere una concentrazione di metanolo dell'80% (v/v). Mescolare delicatamente per inversione e incubare a -80 °C per 6-8 ore.
   3. Centrifugare a 14.000 × g per 10 min (4-8 °C). Trasferire il surnatante metanolico in provette fresche per la profilazione metabolomica.
      NOTA: Collocare i campioni di plasma dopo la raccolta in un congelatore a -80 °C entro 2 ore e ridurre al minimo i cicli di congelamento-scongelamento per garantire la stabilità dei metaboliti.
4. Estrazione fecale
   1. Aggiungere 500 μl di metanolo per HPLC (preraffreddato a -80 °C) a campioni fecali freschi o congelati in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Omogeneizzare con un micro-pestello/omogeneizzatore tissutale su ghiaccio secco per 1-2 minuti, seguito da vortice (1 minuto a 4-8 °C) e incubazione a -80 °C per 4 ore.
   2. Centrifugare a 14.000 × g per 10 minuti (4-8 °C) utilizzando una centrifuga refrigerata. Trasferire il surnatante in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 mL; conservare a -80 °C fino al punto 1.4.4.
   3. Risospendere il pellet con 400 μl di metanolo preraffreddato (-80 °C) di grado HPLC. Agitare accuratamente (1 min a 4-8 °C) e incubare a -80 °C per 30 min.
   4. Ripetere la centrifugazione (14.000 × g, 10 min, 4-8 °C). Combinare i surnatanti di entrambe le fasi di estrazione.
   5. Eseguire una centrifugazione di chiarificazione finale (14.000 × g, 10 min, 4-8 °C). Trasferire il surnatante purificato in provette sterili da 1,5 mL per l'analisi a valle.
      NOTA: Collocare i campioni fecali dopo la raccolta in un congelatore a -80 °C entro 2 ore e ridurre al minimo i cicli di congelamento-scongelamento per garantire la stabilità dei metaboliti.

2. Isolamento dell'arteria renale

1. Selezione dei partecipanti e raccolta dei tessuti
   1. Screening dei pazienti sottoposti a nefrectomia radicale per carcinoma a cellule renali. Includi solo quelli di età compresa ≥ 18 anni senza comorbilità metaboliche (ad esempio, ipertensione primaria, diabete mellito). Durante l'intervento chirurgico, raccogliere il parenchima renale istologicamente normale situato ad almeno 3 cm dai margini del tumore.
   2. Immergere immediatamente i campioni raccolti in tampone Krebs-Henseleit ossigenato (4 °C, pH 7,4; composizione in mM: 119,0 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl₂, 1,0 MgCl₂, 25,0 NaHCO₃, 1,2 KH₂PO₄, 11,0 glucosio). Completare le procedure di isolamento entro 6 ore dall'intervento.
2. Preparazione del tessuto renale
   1. Eseguire il sezionamento coronale in tampone di Krebs a 4 °C per ottenere campioni eminefrici contenenti strutture ilari intatte. Eseguire la microdissezione utilizzando un sistema stereomicroscopico (ingrandimento 40x) per esporre i rami dell'arteria arcuata renale e identificare le arterie arcuate.
3. Dissezione microvascolare
   1. Ottenere un isolamento preciso dei segmenti arteriosi attraverso la rimozione sequenziale del tessuto avventiziale perivascolare utilizzando le forbici microcorneali.
   2. Conservare i segmenti arteriosi con un diametro di circa 500 μm.
   3. Ridurre al minimo lo stress da taglio endoteliale attraverso la manipolazione senza tensione con micro-pinze. Effettuare la dissezione in condizioni di ipotermia (4 °C) con tampone Krebs rinnovato ogni 15 min per preservare il pH fisiologico e l'omeostasi ionica.
      NOTA: La quantificazione esplicita delle dimensioni arteriose e della composizione del tampone, un flusso di lavoro termicamente regolato dall'approvvigionamento (4 °C) al trattamento (4 °C) e la dissezione microvascolare completa entro 6 ore dalla raccolta del campione garantiscono una vitalità tissutale e un'integrità funzionale ottimali.

3. Incubazione dell'arteria renale con metaboliti del danno cardiaco

1. Preparazione del tessuto vascolare: sezionare le arterie renali microchirurgicamente in condizioni sterili e rimuovere meticolosamente il tessuto connettivo perivascolare aderente utilizzando una pinza oftalmica fine. Sezionare le arterie renali isolate in segmenti di 2 mm utilizzando microforbici sterili per la successiva coltura organotipica.
2. Decontaminazione antibiotica: lavare i segmenti vascolari per 3 x 5 minuti con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) integrata con triplo cocktail antibiotico/antimicotico per ridurre al minimo la contaminazione microbica e garantire la sterilità prima dell'esposizione ai metaboliti.
3. Raggruppamento sperimentale: assegnare in modo casuale segmenti vascolari a quattro coorti sperimentali e trasferirli su piastre di coltura a 24 pozzetti contenenti 500 μl di Dulbecco's Modified Eagle Medium per pozzetto.
4. Intervento sui metaboliti
   1. Aggiungere metaboliti dai seguenti gruppi: 1) Metaboliti plasmatici sani di controllo (HC-P); 2) Metaboliti plasmaderivati (HF-P) di pazienti con scompenso cardiaco; 3) Metaboliti sani di controllo derivati dalle feci (HC-F); 4) Metaboliti derivati dalle feci dei pazienti con sampinsufficienza cardiaca (HF-F).
   2. Ricostituire gli estratti di metaboliti in metanolo (grado HPLC) e somministrare 10 μl di ciascun estratto nel pozzetto corrispondente della piastra di coltura a 24 pozzetti, che contiene 500 μl di terreno Eagle modificato di Dulbecco e segmenti dell'arteria renale (concentrazione finale del solvente del 2% (v/v)). Aggiungere volumi equivalenti di veicolo (miscela metanolo/PBS) ai pozzetti di controllo.
5. Condizioni di coltura: Incubare i gruppi di piastre in condizioni di coltura cellulare standard (37 °C, 5% CO₂, 95% di umidità) per 24 ore utilizzando un incubatore umidificato.

4. Saggio dell'anello dell'arteria renale

1. Sospensione e fissazione dell'anello arterioso renale
   1. Preparazione del filo: Infilare due fili paralleli di acciaio inossidabile da 2 cm (prebilanciati in Krebs, 95% O₂/5% CO₂) attraverso il lume arterioso al microscopio ottico, garantendo una sporgenza uniforme del filo ad entrambe le estremità.
   2. Montaggio del miografo: Accendere l'impianto di riscaldamento e il gas per mantenere la temperatura e l'ossigenazione fisiologiche. Fissare i fili orizzontalmente in un bagno miografo a filo a temperatura controllata (Krebs, 95% O₂/5% CO₂). Regolare le manopole a vite per mantenere il naturale rilassamento dei vasi.
2. Determinazione della tensione iniziale ottimale con normalizzazione specifica del vaso
   NOTA: La tensione a riposo è stata regolata utilizzando una procedura di normalizzazione per standardizzare le condizioni di base, ottimizzare la reattività del recipiente e garantire la riproducibilità. Equilibrare per 30 min prima di procedere con la normalizzazione.
   1. Selezionare Impostazioni di normalizzazione dal menu DMT , utilizzando i seguenti parametri: calibrazione oculare: 1 mm/div; pressione target: 13,3 kPa; Rapporto IC1/IC100: 0,9 C; media online: 3 s; Tempo di ritardo: 60 s.
      NOTA: Ulteriori dettagli di base e di configurazione del sistema sono forniti nel documento di riferimento¹⁷.
   2. Per normalizzare un'imbarcazione, selezionare il canale di interesse e popolare la schermata di normalizzazione con i dati. Impostare i punti finali del tessuto in base alla lettura del micrometro e al diametro del filo di 40 μm.
   3. Applicare l'allungamento passivo e attendere 3 min. Somministrare 60K⁺ per indurre una contrazione mediata dal potassio e attendere che la contrazione raggiunga un plateau. Sciacquare il preparato 3 x 5 minuti con la soluzione di Krebs per lavare via il 60K⁺. Calcolare la forza attiva sottraendo la forza passiva ad ogni livello di allungamento dalla forza indotta dal potassio registrata sulla traccia.
   4. Ripetere il passaggio 4.2.3 fino a raggiungere la forza attiva massima. Definire la tensione a riposo ottimale come il livello che produce la massima tensione attiva in ciascuna arteria, con risposte di picco a K⁺ elevato utilizzate come contrazioni di riferimento.
   5. Equilibrare l'anello arterioso per 10 minuti prima di ulteriori esperimenti.
      NOTA: A causa della significativa variabilità interindividuale nei gradi, negli spessori e nelle origini dei vasi, normalizzare ogni vaso sanguigno individualmente per garantirne la riproducibilità. Utilizzare il modulo di normalizzazione del sistema miografo a filo per determinare la tensione di base appropriata in base al diametro passivo e alle proprietà meccaniche di ciascun recipiente. Applicare la procedura in modo coerente su tutti i campioni prima del test funzionale.
3. Rilevamento della reattività degli anelli dell'arteria renale
   1. Per studiare gli effetti di diversi metaboliti sulla contrattilità vascolare, eseguire test di funzionalità di contrazione vascolare utilizzando arterie renali incubate con plasma estratto e metaboliti fecali da volontari sani e pazienti con scompenso cardiaco per 12 ore. Per dettagli specifici, fare riferimento alla sezione 3.
   2. Usa 60K⁺ per suscitare una contrazione mediata dal potassio. Assicurarsi che ogni camera contenga 5 mL di soluzione di Krebs.
   3. Per determinare le contrazioni dipendenti dalla concentrazione indotte dalla fenilefrina (Phe) negli anelli arteriosi, aggiungere Phe con incrementi di mezzo log da ^10-9 a ^10-4 M. Iniziare con la concentrazione di Phe più bassa, introdurla nella camera e attendere una contrazione costante.
   4. Segnare il punto in cui viene raggiunta una contrazione costante (cioè, registrare il valore di tensione al plateau), quindi passare alla concentrazione successiva. Ripetere fino a quando la concentrazione finale non è stata aggiunta con successo.
   5. Dopo aver terminato l'esperimento, salvare il file di dati e rimuovere gli anelli arteriosi. Pulire bene la camera con una soluzione di acido acetico all'8%, quindi incubare per 3 minuti.
   6. Spegnere l'impianto di riscaldamento e il gas, assicurandosi che tutto il liquido sia stato rimosso prima di spegnere il gas.

5. Esame istopatologico dell'arteria renale: colorazione ematossilina-eosina

NOTA: Smaltire i reagenti pericolosi e i rifiuti biologici in conformità con i protocolli istituzionali di biosicurezza e igiene chimica. In particolare, lo xilene e la paraformaldeide devono essere raccolti in contenitori per rifiuti chimici etichettati e sigillabili e conservati in un'area apposita per cappe chimiche prima dello smaltimento da parte di gestori di rifiuti pericolosi certificati. L'acido acetico utilizzato per la pulizia della camera del miografo deve essere neutralizzato e smaltito seguendo le procedure standard di smaltimento dei rifiuti acidi. Non scaricare nessuno di questi reagenti nei lavelli del laboratorio.

1. Lavare le arterie in PBS freddo e fissare con paraformaldeide al 4% (pH 7,4) per una notte. Taglio di sezioni seriali a 4 μm e processo per l'istologia.
2. Incubare le sezioni di tessuto montate su vetrini in un essiccatore per vetrini a 60 °C per 1 ora, quindi trasferirle immediatamente in xilene. Immergere le sezioni nello xilene (3 x 5 min).
3. Sottoporre le sezioni a un'idratazione graduata con etanolo: 100% etanolo (2 x 5 min), 95% etanolo (1 x 5 min), 90% etanolo (1 x 5 min), 80% etanolo (1 x 5 min), 70% etanolo (1 x 5 min), risciacquare con acqua ultrapura (1 x 5 min).
4. Colorare con ematossilina (0,5% p/v) per 5 min; Quindi sciacquare sotto l'acqua corrente.
5. Differenziare con alcol acido all'1% (HCl-etanolo) per 5-10 s e sciacquare sotto l'acqua corrente.
6. Bluificare le sezioni in acqua di ammoniaca allo 0,6% e sciacquare sotto l'acqua corrente.
7. Immergere le sezioni in soluzione di eosina (1% p/v) per 2 min.
8. Disidratare e deselezionare le sezioni in etanolo al 95% (2 x 5 min), etanolo al 100% (2 x 5 min) e xilene (2 x 5 min).
9. Asciugare brevemente all'aria fino a ottenere la trasparenza ottica, montare nel mezzo di montaggio, coprire con vetrini coprioggetti e sigillare i vetrini coprioggetti con un mezzo di montaggio neutro.
10. Esegui l'imaging in campo chiaro e la valutazione istomorfometrica.

6. Identificazione di biomarcatori molecolari associati a danno renale

1. Estrazione dell'mRNA dell'arteria renale
   1. Aggiungere il tessuto vascolare crioconservato in azoto liquido a 1 mL di reagente per l'estrazione dell'RNA e trasferirlo in un omogeneizzatore tissutale preraffreddato per un'omogeneizzazione completa.
   2. Aggiungere 250 μl di cloroformio per 100 μl di reagente di estrazione, agitare energicamente per 30 s e incubare per 10 minuti a 25 °C.
   3. Centrifugare a 12.000 × g (10 min, 4 °C) e trasferire la fase acquosa in una provetta nuova.
   4. Aggiungere 500 μl di isopropanolo alla fase acquosa, mescolare per inversione e incubare per 20 minuti a 25 °C.
   5. Centrifugare a 12.000 × g (10 min, 4 °C) ed eliminare il surnatante.
   6. Lavare il pellet con 1 mL di etanolo al 75% (2 x 5 min), asciugare all'aria il pellet di RNA e risospendere in DEPC-H₂O (0,1% v/v).
      NOTA: Verificare la purezza dell'RNA (OD₂₆₀/OD₂₈₀ = 1,9-2,0) e confermare l'integrità delle bande di rRNA 28S/18S.
2. Sintesi del cDNA
   1. Miscelare 2 μg di mRNA + 1 μL di primer oligo(dT), regolare a 8 μL con DEPC-H₂O (0,1% v/v), riscaldare a 70 °C per 5 minuti e raffreddare a freddo con ghiaccio per 5 minuti.
   2. Preparare la master mix di trascrizione inversa in 10 μl di 2x TS Reaction Mix, 1 μl di RT/RI Enzyme Mix e 1 μl di gDNA Remover. Aggiungere i 12 μl di miscela master agli 8 μl di miscela RNA/primer del passaggio 6.2.1 per ottenere un volume di reazione totale di 20 μl.
   3. Scaldare il composto dal passaggio 6.2.2. a 42 °C per 60 minuti e terminare il processo riscaldando a 85 °C per 5 minuti.
   4. Diluire i 20 μL della reazione di trascrizione inversa aggiungendo 80 μL di H₂O privo di nucleasi, ottenendo un volume finale di 100 μL (diluizione 4x). Utilizzare il cDNA diluito come modello per la PCR quantitativa.
3. Analisi PCR quantitativa
   1. Impostare la reazione mescolando 2,0 μL di stampo di cDNA, 0,5 μL di primer diretto (10 μM), 0,5 μL di primer inverso (10 μM), 10 μL di master mix SYBR Green (2x) e 7 μL di ddH₂O.
   2. Eseguire la PCR utilizzando le seguenti impostazioni: denaturazione iniziale: 95 °C/3 min; 40 cicli: 95 °C/30 s; Tm-5 °C/30 s; 72 °C/30 s; curva di fusione: 65-95 °C (+0,5 °C/5 s).
   3. Analizzare l'espressione genica con il metodo 2-ΔΔct. Le sequenze di primer sono mostrate nella Tabella Supplementare S2.

Risultati

La coorte era composta da due femmine e due maschi, con un'età compresa tra 46 e 73 anni (età media: 64,0 anni). Le misurazioni della pressione arteriosa al basale hanno mostrato una pressione arteriosa sistolica compresa tra 109 e 168 mmHg e una diastolica compresa tra 68 e 115 mmHg. Tutti i pazienti con scompenso cardiaco avevano anamnesi farmacologica registrata, inclusi agenti cardioprotettivi comuni come beta-bloccanti, statine e farmaci antipiastrinici, con variazioni individuali negli inibitori del sistema renina-...

Discussione

Recenti ricerche sulla CRS hanno identificato la riprogrammazione metabolica come un meccanismo patologico chiave, con metaboliti che regolano l'omeostasi vascolare renale ^7,8,9. Sebbene le VSMC svolgano un ruolo fondamentale nella regolazione del tono vascolare e della compliance nella CRS, il nostro studio fornisce prove dirette che i metaboliti associati a lesioni cardiache compromettono la c...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM Alto glucosio	Gibco	Gatto # 06-1055-57-1-ACS
PBS	Distretto di Solarbio	Gatto # P1010
Penicillina-Streptomicina-Amfotericina B	Thermo Fisher Scientifico	Gatto# 15240062
Fenilefrina	MCE	Gatto#HY-B0769
Sistema di trascrizione inversa	Promega	Gatto # A5001
Sistema stereomicroscopico	Leica	M80
Master mix SYBR Green	Thermo Fisher Scientifico	Gatto# 4309155
Sistema di misurazione della tensione vascolare	DMT	620 milioni