Articolo metodologico

Un saggio di permeabilità della membrana liposomica per studiare gli effetti dei gruppi fosfatidilinositolo fosfato sull'azione membranotropica del veleno PLA2

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DOI:

10.3791/68594

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26 settembre 2025

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1Advanced STEM Research Center, Beijing Chaoyang KaiWen Academy, 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Department of Pharmacology, University of Nevada Reno, 4Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, M. V. Lomonosov Moscow State University

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un metodo economico per valutare la permeabilità della membrana liposomiale con sensibilità e risoluzione superiori rispetto alle tecniche convenzionali. Utilizzando una nuova reazione di sostituzione del ligando incapsulato, questa tecnica rileva i cambiamenti indotti dalla fosfolipasi A2 nelle membrane del modello. Facilmente integrabile con le analisi standard, questo approccio accessibile migliora la risoluzione per lo studio della biofisica delle membrane e delle interazioni tra tossine.

Abstract

Abbiamo sviluppato un nuovo test, economico e altamente sensibile per valutare la permeabilità della membrana liposomiale basato su reazioni di sostituzione del ligando che coinvolgono ligandi incapsulati nel volume interno dei liposomi, che abbiamo combinato con un saggio di attività idrolitica (utilizzando l'acilazione del coenzima A) e una simulazione di modellazione molecolare per indagare se i fosfati dell'anello inositolo nel fosfatidilinositolo proteggono le membrane dagli effetti dannosi degli enzimi espressi in modo aberrante. L'espressione aberrante delle fosfolipasi A2 (PLA2) porta alla demielinizzazione degli assoni che innesca lo sviluppo della sclerosi multipla e del morbo di Alzheimer. Per imitare gli effetti del PLA₂ espresso in modo aberrante, abbiamo utilizzato la subunità basica del veleno di vipera PLA₂, HDP-2P. L'HDP-2P è stato testato su liposomi di fosfatidilcolina (PC) arricchiti con fosfatidilinositolo, fosfatidilinositolo-4-fosfato (PI-4-P) o fosfatidilinositolo-4,5-difosfato (PI-4,5-P2). Mentre l'HDP-2P ha mostrato un'attività idrolitica minima e una permeabilità solo leggermente aumentata nei liposomi di PC, l'arricchimento dei liposomi di PC con PI ha migliorato sia l'idrolisi che la permeabilità. Sorprendentemente, PI-4-P e PI-4,5-P₂ hanno inibito drasticamente l'attività idrolitica di HDP-2P e ridotto completamente la permeabilità. Le simulazioni di modellazione molecolare hanno rivelato che i fosfati dell'anello dell'inositolo nel fosfatidilinositolo bloccano stericamente l'accesso dei fosfolipidi al sito attivo dell'HDP-2P, prevenendo l'idrolisi. Sia i dati in vitro che quelli in silico suggeriscono che i fosfatidilinositoli fosforilati sono associati a una ridotta attività del PLA₂, indicando un potenziale meccanismo per mitigare l'eccessiva attività del PLA2 , presumibilmente come mezzo per proteggere le membrane cellulari dalla degenerazione.

Introduzione

Il fosfatidilinositolo (PI) è un fosfolipide anionico costituito da una spina dorsale dell'acido fosfatidico legata all'inositolo, un anello esaidrossi a sei atomi di carbonio, tramite un gruppo fosfato. L'inositolo può essere convertito in modo reversibile in fosfoinositidi mediante fosforilazionenelle posizioni del carbonio 2, 3, 4, 5 e 6 1. PI e fosfoinositidi si trovano nelle membrane plasmatiche e negli organelli di varie cellule di animali, piante e microrganismi. Settant'anni dopo la loro scoperta da parte di Mable e Lowell Hokin 2,3,4, il PI e i fosfoinositidi rimangono oggetto di ricerche approfondite volte a comprendere i loro meccanismi molecolari e la loro rilevanza per la salute umana 5,6,7.

Oltre al tessuto cerebrale, i fosfoinositidi sono tipicamente presenti a basse concentrazioni, rappresentando circa lo 0,5-1% dei lipidi totali nel foglietto interno della membrana plasmatica. I dati pubblicati indicano che è improbabile che il PI svolga un ruolo strutturale importante in condizioni fisiologiche1. Tuttavia, durante gli stati patologici, i livelli di PI e fosfoinositidi aumentano e si spostano sul lembo esterno della membrana plasmatica, indicando che questi fosfolipidi possono essere collegati alla resistenza alla malattia1. Sebbene si sia a lungo pensato che il PI svolga un ruolo fisiologico meno significativo rispetto ai fosfoinositidi, evidenze emergenti evidenziano l'importanza del PI-4-P e del PI-4,5-P2 in vari processi fisiologici1. Questi processi includono la segnalazione intracellulare, la trasduzione del segnale intercellulare 8,9,10, il traffico di membrana 11,12,13, la modulazione dell'espressione genica1, nonché la proliferazione cellulare 14 e la sopravvivenza1. Nonostante ciò, i meccanismi molecolari con cui PI e fosfoinositidi guidano questi processi rimangono poco compresi.

PI e fosfoinositidi sono abbondanti nelle cellule del tessuto cerebrale, dove costituiscono circa il 10% dei fosfolipidi totali, sebbene i loro livelli possano aumentare transitoriamente nelle prime fasi delle malattie cerebrali, suggerendo che i fosfoinositidi possano contrastare lo sviluppo di patologie neurologiche1 come la sclerosi multipla e il morbo di Alzheimer innescati dalla demielinizzazione assonale causata dall'attività aberrante del PLA215, 16,17. Questi enzimi appartengono a varie classi e gruppi, tra cui la fosfolipasi secretoria A2 del gruppo IIA (sPLA2)15. Livelli elevati di questo gruppo di enzimi si trovano nel liquido cerebrospinale dei pazienti con sclerosi multipla e Alzheimer, dove contribuiscono alla rottura delle membrane mieliniche, portando alla demielinizzazione15. È stato anche riportato che gli sPLA2dei veleni di serpente inibiscono la trasmissione alle sinapsi neuromuscolari18,19, causando disturbi del sistema nervoso centrale e influenzando negativamente il sistema neuromuscolare periferico20.

In questo studio, abbiamo studiato se PI e fosfoinositidi possono proteggere le membrane fosfolipidiche modello dagli effetti degli enzimi sPLA2 espressi in modo aberrante. Le membrane modello erano costituite da fosfatidilcolina (PC), il fosfolipide più abbondante in tutte le membrane cellulari dei mammiferi21, arricchite con un rapporto molare del 20% di PI, PI-4-P o PI-4,5-P2. Per imitare gli effetti degli enzimi sPLA2 espressi in modo aberrante sulle membrane modello, abbiamo utilizzato la subunità basica HDP-2P dell'enzima neurotossico PLA2 PLA 2 del veleno di vipera secretorio del gruppoIIA, la cui attività idrolitica è stata precedentemente studiata sulle membrane mieliniche modello23.

Per questo lavoro, abbiamo sviluppato un nuovo approccio per studiare i cambiamenti nella permeabilità delle membrane liposomiali colpite da HDP-2P. Il nuovo metodo si basa su una reazione di sostituzione del ligando nella soluzione di CuSO4 all'esterno dei liposomi, che coinvolge un ligando NH3 intrappolato all'interno dei liposomi. Se la permeabilità di membrana indotta da HDP-2P consente la fuoriuscita di NH3 dai liposomi, l'ammoniaca rilasciata sostituirà quantitativamente quattro molecole d'acqua in ioni rame idrato attraverso la reazione: [Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-introduction-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l). Questo scambio di ligandi produce un caratteristico aumento della densità ottica della soluzione misurabile mediante spettrofotometria (λ = 600 nm), fungendo da lettura quantitativa per le variazioni di permeabilità della membrana. Il nostro approccio basato sulla sostituzione del ligando dimostra una sensibilità superiore per la valutazione della permeabilità della membrana rispetto alle tecniche convenzionali come 1H-NMR 23,24,25,26,27,28 e i saggi di trasporto ionico29, offrendo al contempo l'ulteriore vantaggio di non richiedere strumentazione costosa. Questo metodo semplice ed economico, applicato in combinazione con le misure di attività idrolitica dell'HDP-2P e la simulazione in silico del legame di PI, PI-4-P e PI-4,5-P2 alla superficie molecolare dell'HDP-2P, ci ha permesso di concludere che i fosfati dell'anello inositolico nel PI aboliscono gli effetti dirompenti dell'HDP-2P sulle membrane del PC arricchite con PI-4-P o PI-4. 5-P2. Se questa scoperta dovesse essere confermata in ulteriori studi, la capacità dell'anello fosfato dell'inositolo nel PI di proteggere dagli effetti dannosi delle proteine cellulari che agiscono in modo anomalo, contribuendo potenzialmente alla stabilità della membrana in condizioni di malattia che coinvolgono un'attività proteica aberrante, potrebbe aprire la strada allo sviluppo di nuovi farmaci per il trattamento di disturbi neurologici come il morbo di Alzheimer e la sclerosi multipla.

Protocollo

1. Simulazione in silico dell'interazione di HDP-2P con PI e fosfoinositidi mediante software di modellazione molecolare

  1. Installazione e preparazione del software
    1. Installare l'editor di disegni chimici di riferimento per la costruzione di molecole di ligando come mostrato nel File supplementare 1-Figura supplementare S1A.
    2. Installare il software di modellazione molecolare per l'aggancio molecolare del ligando al recettore.
    3. Installare gli strumenti di docking automatizzato per la preparazione di ligandi e recettori.
    4. Poiché il software di simulazione della modellazione molecolare dipende dall'ambiente Python, installa Python.
  2. Preparazione del legante
    1. Innanzitutto, utilizza l'editor di disegni chimici per costruire le coordinate atomiche per le strutture molecolari di PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, cardiolipina e fosfatidilserina.
      NOTA: Il protocollo di esempio nelle fasi successive della preparazione del ligando descrive le fasi solo per PI.
    2. Costruire la struttura molecolare del PI utilizzando l'editor di disegni chimici come illustrato in File supplementare 1-Figura supplementare S1B e salvare il file in formato PDB come mostrato in File supplementare 1-Figura supplementare S2.
    3. Aprire il file PDB nel software dello strumento di aggancio automatico come mostrato in File supplementare 1-Figura supplementare S3A.
    4. Aggiungere gli atomi di idrogeno come mostrato nel File Supplementare 1-Figura Supplementare S3B e selezionare gli atomi polari o tutti gli atomi di idrogeno come mostrato nel File Supplementare 1-Figura Supplementare S4A.
      NOTA: Dopo aver completato l'aggancio PI con HDP-2P, selezionare solo atomi di idrogeno polari per semplificare la visualizzazione dei legami polari o idrogeno.
    5. Impostare la molecola PI come ligando per il software dello strumento di docking automatizzato come mostrato nel file supplementare 1-Figura supplementare S4B.
    6. Salvare il ligando come file PDBQT come mostrato in File supplementare 1-Figura supplementare S5A. Assicurati di rendere tutti i legami ruotabili.
  3. Preparazione del recettore
    1. Scarica il file PDB della fosfolipasi A2 HDP-2 (codice PDB 2I0U), costituito da due monomeri, uno acido, enzimaticamente inattivo, A, e l'altro basico, enzimaticamente attivo, E. Per eliminare il monomero A enzimaticamente inattivo, importare il file 2I0U nel software di modellazione molecolare (File supplementare 1-Figura supplementare S5B), selezionare tutti gli atomi del monomero A (File supplementare 1-Figura supplementare S6A), quindi andare su Modifica ed eliminare tutti gli atomi del monomero A (File supplementare 1-Figura supplementare S6B). Mantenere enzimaticamente attivo il monomero E, che ora è designato come recettore.
    2. Aprire il file PDB del recettore HDP-2P nel software dello strumento di aggancio automatico come mostrato in File supplementare 1-Figura supplementare S7.
    3. Rimuovere tutte le molecole d'acqua come mostrato nel file supplementare 1-Figura supplementare S8A.
    4. Aggiungere atomi di idrogeno come mostrato nel File Supplementare 1-Figura Supplementare S8B. Si prega di notare che dopo il completamento dell'aggancio dell'HDP-2P con PI, è necessario selezionare solo gli idrogeni polari per semplificare la visualizzazione dei legami polari e idrogeno.
    5. Impostare l'HDP-2P come recettore, come mostrato nel file supplementare 1-Figura supplementare S9A, e salvarlo come file PDBQT. Assicurarsi che il recettore sia impostato senza legami girevoli.
  4. Impostazione dei parametri di docking
    1. Apri sia il file PDBQT del ligando che quello del recettore.
    2. Accedere all'interfaccia di configurazione della scatola della griglia, come mostrato nel file supplementare 1-Figura supplementare S9B, e definire le coordinate della dimensione della casella della griglia (dimensione x = 44,644; dimensione y = 74,939; dimensione z = 43,050) e centro (centro x = 25,626; centro y = 9,582; centro z = 41,825), che racchiudono completamente l'intera superficie della molecola del recettore come mostrato nel file supplementare 1-Figura supplementare S10A.
    3. Chiudere l'interfaccia di configurazione della griglia con le impostazioni correnti come mostrato in File supplementare 1-Figura supplementare S10B e salvare i parametri di ancoraggio in un file config.txt come mostrato in File supplementare 1-Figura supplementare S11A.
  5. Esecuzione del software di docking molecolare
    1. Avviare il software di docking molecolare utilizzando il file config.txt come mostrato in File supplementare 1-Figura supplementare S11B.
    2. Eseguire il calcolo dell'attracco (~30-90 min; File supplementare 1-Figura supplementare S12).
    3. Controllare il file docking_log.txt per esaminare i punteggi di ancoraggio (affinità di associazione).
    4. Selezionare il risultato dell'attracco con la conformazione di energia più bassa.
  6. Analisi dei dati di attracco
    1. Utilizzare il software dello strumento di aggancio automatico per aprire il file PDBQT dei risultati dell'aggancio.
    2. Analizza i siti di legame ligando-recettore, concentrandoti sul centro attivo del recettore e sulle interazioni intermolecolari, comprese le interazioni ioniche, ione-polari, polari e di legame idrogeno. Fare una tabella per PI e fosfoinositide, che interagisce con il sito attivo del recettore, per descrivere le affinità del sito di legame in kcal/mol, le frazioni cariche e polari nella testa polare PI/fosfoinositide e i residui di HDP-2P coinvolti nel legame intermolecolare e i tipi di legami come mostrato nella Tabella 1 e nella Tabella 2. Ripetere l'aggancio per ogni coppia recettore-ligando 3 volte per assicurarsi che non vi siano deviazioni nei siti di legame, nelle affinità di legame, nelle frazioni cariche e polari dei residui di PI/fosfoinositide e HDP-2P e nel tipo di legami.

2. Attività idrolitica di HDP-2P in liposomi di PC arricchiti con PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS o CL monitorata utilizzando il coenzima A acilato con acidi grassi liberi

NOTA: Cloroformio, metanolo, NH3 e CuSO4 sono pericolosi. Utilizzare sempre guanti, occhiali protettivi e camice in nitrile. Maneggiare tutti i protocolli con questi reagenti sotto la cappa aspirante. Conservare il cloroformio in una bottiglia di vetro ambrato. Conservare il metanolo in armadi infiammabili, lontano da ossidanti. Tenere il metanolo lontano da fiamme e scintille. Etichettare tutti i contenitori dei rifiuti per questi reagenti e smaltirli secondo le normative locali sullo smaltimento dei rifiuti pericolosi.

  1. Preparare 100 mL di soluzione tampone per l'idrolisi fosfolipidica catalizzata da HDP-2P sciogliendo 5,55 mg di CaCl2 in tampone Tris-HCl 0,10 M (pH 7,4).
  2. Preparare 50 mL di soluzione madre di EDTA 1,0 M sciogliendo 7,31 g di EDTA in acqua distillata deionizzata (ddH20).
  3. Preparare una soluzione madre di HDP-2P 0,54 mM in tampone Tris-HCl 0,10 M (pH 7,4). La massa molare di HDP-2P è di 13,827 kDa.
  4. Preparare le seguenti soluzioni madre di fosfolipidi alla concentrazione 10,0 M in miscela cloroformio/metanolo (2 a 1 in volume): tuorlo d'uovo L-α-fosfatidilcolina (PC), cardiolipina (CL) di cuore bovino , L-α-fosfatidil-L-serina (PS) di cervello bovino, PI, PI-4-P e PI-4,5-P2. Le masse molari di PC, CL, PS, PI, PI-4-P e PI-4,5-P2 sono rispettivamente 768 Da, 1.466 Da, 792 Da, 867 Da, 962 Da e 1.057 Da, come descritto di seguito.
  5. Preparare cinque campioni di liposomi PC. Per preparare un campione di liposomi di PC, aggiungere 75 μl di soluzione madre di cloroformio/metanolo di PC in una provetta di vetro e asciugare i lipidi a 25 °C sotto vuoto di 10 Pa per 1 ora fino a formare un film lipidico. Idratare il film lipidico per 1 ora con 15 mL di soluzione tampone per idrolisi fosfolipidica a 25 °C in un termostato. Quindi, inserire la pistola in titanio di un dosatore ad ultrasuoni da 100-150 W nella sospensione lipidica nella provetta di vetro posta in un bagno di ghiaccio e sonicare la sospensione alla frequenza di 22 kHz per 10 minuti, non superando il 50% della potenza massima. Per rimuovere le particelle di "polvere" di titanio, centrifugare i liposomi a 200 × g (1.270 giri/min con un rotore da 10 cm) per 10 minuti a temperatura ambiente.
  6. Preparare campioni di liposomi di PC arricchiti con CL, PS, PI, PI-4-P o PI-4,5-P2 al PC e altri molari lipidici con rapporto 4 a 1 mescolando soluzioni madre di cloroformio/metanolofosfolipide - 60 μL di PC con 15 μL di CL, PS, PI, PI-4-P o PI-4,5-P2- in una provetta di vetro. Quindi, asciugare i lipidi in un vuoto di 10 Pa o per 3 ore a temperatura ambiente, idratare il film lipidico in una soluzione tampone per l'idrolisi dei fosfolipidi e sonicare con onde ultrasoniche come descritto sopra.
    NOTA: Per ogni tipo di liposomi, preparare cinque campioni.
  7. Posizionare 1,0 mL da cinque campioni di ciascun tipo di liposomi sopra descritti per separare le provette e aggiungere 10 μL di soluzione incolore di coenzima-A dal kit NEFA a ciascuna provetta, quindi aggiungere 0,00, 0,93, 1,86, 2,79 o 3,72 μL di soluzione madre HDP-2P 0,54 mM per separare le provette per ottenere nei campioni di liposomi i rapporti molari HDP-2P/fosfolipidi di 0,000, 0,001, 0,002, 0,003 e 0,004, rispettivamente.
  8. Immediatamente dopo l'aggiunta di HDP-2P ai liposomi, incubare i campioni di liposomi per 15 minuti a 37 °C in un termostato, quindi interrompere l'idrolisi dei fosfolipidi indotta da HDP-2P aggiungendo 100 μL di soluzione madre di EDTA. Dopodiché, agitare i campioni per 1 minuto.
  9. Quantificare l'attività idrolitica di HDP-2P misurando la densità ottica di campioni liposomiali a 550 nm utilizzando uno spettrofotometro, che misurerebbe la misura in cui la soluzione incolore di coenzima-A diventa viola quando viene acilata con acidi grassi liberi.
  10. Ripetere la procedura di cui sopra altre due volte in modo che i valori medi di densità ottica siano derivati da tre prove indipendenti.
    NOTA: Ogni punto dati ottenuto in questa prova sperimentale è il valore medio della densità ottica. Idealmente, la deviazione standard dei punti dati sperimentali dovrebbe essere compresa tra il ±5% della media.

3. Effetti dell'HDP-2P sulla permeabilità delle membrane liposomiali del PC arricchite con PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS o CL misurati mediante una reazione di sostituzione del ligando in soluzione di CuSO4 che coinvolge un ligando NH3 intrappolato all'interno dei liposomi

NOTA: Cloroformio, metanolo, NH3 e CuSO4 sono pericolosi. Utilizzare sempre guanti, occhiali protettivi e camice in nitrile. Maneggiare tutti i protocolli con questi reagenti sotto la cappa aspirante. Conservare il cloroformio in una bottiglia di vetro ambrato. Conservare il metanolo in armadi infiammabili, lontano da ossidanti. Tenere il metanolo lontano da fiamme o scintille. Etichettare tutti i contenitori dei rifiuti per questi reagenti e smaltirli secondo le normative locali sullo smaltimento dei rifiuti pericolosi.

  1. Preparare 20 mL di soluzioni madre 0,03 M per ciascuno dei sei fosfolipidi - PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2- in cloroformio/metanolo (volume da 2 a 1). Le masse molecolari di PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 sono rispettivamente 768, 1466, 792, 867, 962 e 1057 Da.
  2. Preparare 100 mL di tampone Tris-HCl 0,10 M (pH 7,4) con una concentrazione finale di 0,05 M CuSO4.
  3. Preparare 4 mL di 1,5 × 10-3 M HDP-2P in tampone 0,05 M CuSO4, 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4). La massa molare di HDP-2P è di 13,827 kDa.
  4. Per preparare 100 mL di soluzione 0,5 M NH3 , utilizzare una soluzione NH3 al 25% (densità 905 g/L30, pari a 13,30 M [905 g/L × 0,25 M ÷ 17,00 g/L = 13,30 M]). Pertanto, per preparare 100 ml di 0,5 M NH3, utilizzare 3,76 ml di soluzione NH3 al 25%: (0,5 M × 1.000 ml ÷ 13,30 M) ÷ 10 = 3,76 ml di soluzione NH3 al 25%. Porre 3,76 mL di soluzione di NH3 al 25% in un matraccio tarato da 100 mL e portare il volume a 100 mL con tampone Tris-HCl 0,10 M (pH 7,4).
  5. Per preparare i liposomi con NH3 nel volume interno dei liposomi, porre 12,5 mL di soluzione di fosfolipidi madre 0,03 M in cloroformio/metanolo in una provetta e asciugare i fosfolipidi sotto vuoto a 10 Pa o per 3 ore a temperatura ambiente. Idratare il film fosfolipidico per 1 ora con 12,5 mL di 0,5 M NH3, 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) a 25 °C in un termostato; quindi sonicare la sospensione lipidica alla frequenza di 22 kHz come descritto al punto 2.5 per produrre liposomi sonicati.
    NOTA: Nella soluzione con liposomi sonicati, NH3 si trova all'interno e all'esterno dei liposomi.
  6. Per eliminare l'NH3 all'esterno dei liposomi, dializzare i liposomi utilizzando una membrana di dialisi (cut-off molecolare 1,0 kDa) a 5 cappello di temperatura ambiente contro 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) utilizzando un agitatore magnetico.
    NOTA: La dialisi per 5 ore è stata sufficiente per rimuovere completamente NH3, poiché l'aggiunta di 0,5 mL di liposomi dializzati a 0,5 mL di tampone 0,10 M Tris-HCl, 0,05 M CuSO4 ha prodotto la stessa densità ottica a 600 nm di quella dei liposomi preparati senza NH3 e miscelati con lo stesso tampone.
  7. Dopo la dialisi, centrifugare i liposomi a 200 × g per 90 minuti come descritto al punto 2.5 per pellettare i liposomi. Scartare il surnatante e risospendere i liposomi con 5,0 mL di Tris-HCl 0,10 M, CuSO4 0,05 M (pH 7,4) e dividere i liposomi risospesi in cinque campioni da 1,0 mL ciascuno. Aggiungere a questi cinque campioni da 1,0 mL separatamente 60, 40, 20 e 0 μL di Tris-HCl 0,10 M, 0,05 M CuSO4 (pH 7,4) e poi 0, 20, 40, 60, 80 μL di tampone stock HDP-2P per regolare nei campioni di liposomi i rapporti molari HDP-2P/fosfolipidi rispettivamente 0,000, 0,001, 0,002, 0,003 e 0,004.
  8. Incubare i campioni di liposomi per 30 minuti in un termostato a 37 °C; Quindi, misurare la densità ottica dei campioni di liposomi a 600 nm utilizzando uno spettrofotometro. Seguire i passaggi descritti nella sezione 3 per tutti e sei i campioni di liposomi e ripetere 3 volte per garantire letture triplicate della densità ottica per ciascun punto dati.
    NOTA: La deviazione standard dei punti dati sperimentali deve essere sempre compresa tra il ±5% della media.

Risultati

Simulazione di modellazione molecolare dell'interazione di HDP-2P con PI e fosfoinositidi
Il programma di modellazione molecolare calcola i migliori nove siti di legame sulla superficie molecolare di un recettore (molecola più grande), che è bersaglio di un ligando (molecola più piccola). Questi siti sono determinati dal rilascio delle nove entalpie più alte, che designano i siti con le migliori affinità di legame. Le affinità di legame sono espresse come valori negativi, indicando che il legame intermolecolare è un processo esotermico. Nel caso dell'interazione di HDP-2P con PI, la simulazione ha previsto quattro siti di legame (#3, #6, #7 e #8) per PI sulla superficie molecolare di HDP-2P all'interno del centro attivo (Tabella 1). Inoltre, i cinque siti di legame per PI sono stati trovati al di fuori del centro attivo di HDP-2P. Le notazioni delle frazioni cariche e polari nella testa polare di PI sono illustrate nella Figura 1.

Il centro attivo di HDP-2P è costituito da cinque residui di amminoacidi chiave: Gly30, Gly32, His48, Asp49 e Lys69, che facilitano il corretto allineamento del substrato fosfolipidico nel centro attivo per garantire l'idrolisi catalitica. Alcune strutture agganciate rappresentative mostrano il legame di PI ad alcuni residui amminoacidici del centro attivo, mentre nel sito di legame #6, PI si impegna con tutti e cinque i residui amminoacidici chiave del centro attivo attraverso legami ionici, ione-polari e idrogeno (Tabella 1). La Figura 2 illustra come PI interagisce con tutti e cinque i residui di amminoacidi chiave nel centro attivo di HDP-2P all'interno del sito di legame #6.

La simulazione di docking dell'interazione tra HDP-2P e PI-4-P, che contiene un gruppo fosfato in posizione 4 dell'anello dell'inositolo, ha previsto solo il sito di legame #1 come la posizione in cui PI-4-P si lega al centro attivo di HDP-2P. In particolare, in questo sito, PI-4-P interagisce con tre residui amminoacidici chiave del centro attivo - Gly30, Gly32 e Lys69 - tramite legami ionici, ione-polari e idrogeno (Tabella 2). La Figura 3 illustra l'interazione di PI-4-P con il centro attivo di HDP-2P. Nei restanti otto siti di legame sulla superficie molecolare di HDP-2P, PI-4-P si lega a posizioni esterne al centro attivo.

Le simulazioni di docking molecolare delle interazioni HDP-2P con PI-4,5-P₂ (contenente gruppi fosfato nelle posizioni 4 e 5 dell'anello inositolo) non hanno rivelato alcun legame con il centro attivo dell'enzima in tutti e nove i siti di legame previsti. Invece, PI-4,5-P₂ si lega costantemente a una cavità simile a un solco adiacente al centro attivo (Figura 4), formando legami ione-polari e idrogeno con i tre residui HDP-2P, Trp31, Gly33 e Gln34).

Sebbene il legame di PI-4,5-P₂ a una cavità simile a un solco vicino al centro attivo del PLA2s cellulare o velenifero non sia stato precedentemente documentato, caratteristiche strutturalmente analoghe sono ben consolidate nei domini di omologia pleckstrin31 (PH) e di omologia N-terminale32 dell'epsina (ENTH). Questi domini di segnalazione utilizzano architetture di solco idrofobico-polare-cationico per il riconoscimento specifico di PI-4,5-P2 31,32, nonostante la loro natura non enzimatica. La presenza di un motivo strutturale comparabile in HDP-2P solleva interessanti possibilità di mimetismo evolutivo o di evoluzione convergente per facilitare il riconoscimento del dominio di membrana da parte di HDP-2P. Se ulteriormente verificato con altri metodi, questo studio potrebbe rappresentare il primo caso riportato di un veleno PLA2 che utilizza un tale meccanismo per il riconoscimento dei fosfoinositidi.

È interessante notare che le simulazioni di docking molecolare di CL e PS che interagiscono con HDP-2P hanno predetto il legame di entrambi i fosfolipidi al centro attivo di HDP-2P in otto dei nove siti di legame, mentre l'unico sito di legame di CL e PS esterno al centro attivo non era localizzato nella cavità simile a un solco (dati non mostrati). Vale anche la pena notare che, come il PI, il PC si lega al centro attivo di HDP-2P in quattro dei nove siti di legame, e sia il PI che il PC, come CL e PS, non si legano alla cavità simile a un solco (dati non mostrati). Questi risultati suggeriscono che i gruppi fosfato sull'anello inositolo di PI hanno un'elevata affinità di legame con la cavità simile a un solco situata adiacente al centro attivo. Le analisi strutturali hanno identificato analoghe cavità simili a scanalature con chiazze superficiali idrofobiche-polari-cationiche vicino al centro catalitico sianegli enzimi PLA2 cellulari 33 che in quellivelenosi 34. Il legame dei fosfoinositidi a queste cavità può indurre cambiamenti conformazionali fisiologicamente significativi, inibendo potenzialmente l'attività enzimatica. In particolare, tra i fosfoinositidi, PI-4,5-P2 dimostra caratteristiche di substrato particolarmente scarse: le isoforme umane di PLA2 (tipi citosolici, calcio-indipendenti e secrete) mostrano un'attività idrolitica minima o non rilevabile nei confronti di PI-4,5-P235. Ciò suggerisce che il legame dei fosfoinositidi a queste caratteristiche strutturali conservate può svolgere una funzione fisiologica distinta (ad esempio, l'inibizione allosterica) piuttosto che funzioni catalitiche in tutta la superfamiglia PLA2, che richiede future verifiche sperimentali.

Attività idrolitica di HDP-2P in liposomi PC arricchiti con PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS o CL monitorati utilizzando il coenzima A acilato con acidi grassi liberi
L'attività idrolitica di HDP-2P su campioni liposomiali è stata valutata utilizzando una soluzione di coenzima A. La soluzione di coenzima A è incolore ma diventa viola dopo l'acilazione da parte degli acidi grassi liberi rilasciati durante l'idrolisi dei fosfolipidi catalizzata da HDP-2P. L'aumento risultante della densità ottica, corrispondente all'entità dell'acilazione del coenzima A, è stato misurato spettrofotometricamente a 550 nm. Pertanto, l'aumento della densità ottica nei campioni liposomiali trattati con coenzima A e HDP-2P è direttamente proporzionale all'attività idrolitica di HDP-2P.

La Figura 5 presenta le curve di attività idrolitica in funzione del rapporto molare HDP-2P/fosfolipide in vari campioni liposomiali. L'attività idrolitica di HDP-2P è espressa in unità arbitrarie (u.a.) di densità ottica (OD) misurate a 550 nm. Non abbiamo costruito una curva di calibrazione per correlare i valori dell'u.a. alle concentrazioni molari degli acidi grassi liberi, poiché le nostre prove sperimentali hanno dimostrato che gli acidi grassi in solventi organici, quando aggiunti a soluzioni acquose contenenti coenzima A e acil-coenzima A sintetasi, non producono alcuna variazione rilevabile di OD a 550 nm. Ciò indica che tali acidi grassi formano micelle piuttosto che legarsi al coenzima A. Al contrario, solo gli acidi grassi generati dalla membrana (prodotti dall'attività del PLA2 ) si legano al coenzima A associato alla membrana, determinando un cambiamento misurabile di OD. La natura anfipatica del coenzima A - che ha sia regioni idrofobiche che idrofile sulla sua superficie molecolare - lo localizza preferenzialmente all'interfaccia membrana-acqua, che facilita il legame degli acidi grassi prodotti dall'attività del PLA2 al coenzima A. Tuttavia, in queste condizioni di analisi, non è possibile determinare la concentrazione molare degli acidi grassi. Per questo motivo, i ricercatori che utilizzano il test del coenzima A esprimono l'attività idrolitica del PLA2 in unità arbitrarie di OD misurate a 550 nm20.

Il più alto aumento della densità ottica, corrispondente alla massima attività idrolitica di HDP-2P, è stato osservato nei liposomi di PC arricchiti con CL o PS. Questo risultato si allinea bene con il più alto numero di siti di legame per CL e PS nel centro attivo di HDP-2P. L'attività idrolitica di HDP-2P nei liposomi di PC arricchiti con PI era 3,0 e 2,5 volte inferiore rispetto ai liposomi arricchiti con CL o PS, rispettivamente, ma superiore a quella dei liposomi di PC puri. Ciò suggerisce che l'affinità di legame con il centro attivo di HDP-2P di PI è superiore a quella di PC, nonostante entrambi i lipidi abbiano lo stesso numero di siti di legame al centro attivo.

Questa apparente discrepanza può essere spiegata da differenze strutturali nei gruppi della testa polare di PI e PC. Mentre il PC è una molecola neutra, il suo gruppo cationico trimetilammonio si estende verso l'esterno nella soluzione, mentre il suo gruppo fosfato anionico è posizionato più vicino all'area idrofobica della membrana. Questa distribuzione di carica nel gruppo di testa del PC può creare una repulsione elettrostatica contro l'HDP-2P di base, riducendo la sua affinità di legame. Al contrario, la natura acida del PI lo rende una specie lipidica più attraente per l'interazione con l'HDP-2P basico, il che potrebbe spiegare la sua maggiore attività idrolitica rispetto ai liposomi di PC puri.

L'attività idrolitica di HDP-2P nei liposomi di PC arricchiti con PI-4-P, come mostrato nella Figura 5, suggerisce una minima idrolisi catalitica dei fosfolipidi. Sorprendentemente, la curva di densità ottica ottenuta da liposomi di PC arricchiti con PI-4,5-P indica una completa abolizione dell'attività idrolitica da parte di HDP-2P in questo campione di liposomi. Questi risultati si allineano bene con le simulazioni di docking, che prevedono un sito di legame per PI-4-P nel centro attivo di HDP-2P, mentre PI-4,5-P2 non mostra alcuna affinità di legame con il centro attivo. Ciò suggerisce che i gruppi fosfato legati all'anello dell'inositolo ostacolano il legame del fosfolipide al centro attivo di HDP-2P. Proponiamo che i gruppi fosfato sull'anello dell'inositolo si estendano verso l'esterno nella soluzione e, legandosi a HDP-2P tramite interazioni intermolecolari ioniche e ione-polari, mantengano l'HDP-2P a distanza dalla superficie della membrana, proteggendo così la membrana dall'attività idrolitica dell'HDP-2P. Ciò è coerente con recenti scoperte che rivelano che gli enzimi PLA2 umani citosolici, indipendenti dal calcio e secreti hanno mostrato un'attività idrolitica scarsamente rilevabile o nulla verso i substrati PI-4-P e PI-4,5-P2 35.

Cambiamenti di permeabilità indotti da HDP-2P nelle membrane liposomiali PC arricchite con PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS o CL: valutazione tramite reazione di sostituzione del ligando in soluzione di CuSO4 con NH₃ incapsulato

L'impatto dell'attività idrolitica di HDP-2P sulla permeabilità di membrana dei liposomi di PC arricchiti con PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS o CL è stato studiato utilizzando una reazione di sostituzione del ligando in un sistema ionico complesso, in cui il ligando sostituente era incapsulato all'interno del volume interno dei liposomi. Questo metodo semplice e affidabile si basa sullo spostamento di quattro molecole d'acqua che agiscono come leganti nello ione complesso [Cu(H2O)6]2+ da NH3

[Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-results-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l)

Durante il processo di sostituzione delle molecole d'acqua con NH3 nello ione complesso [Cu(H2O)6]2+, il colore blu pallido di [Cu(H2O)6]2+ passa al colore blu scuro di [Cu(H2O)2(NH3)4]2+. In un sistema in cui NH3 è incapsulato all'interno del volume interno dei liposomi e [Cu(H2O)6]2+ è presente nella soluzione esterna, questo cambiamento di colore - monitorato spettrofotometricamente - indica un aumento della permeabilità della membrana liposomiale a NH3.

Per stabilire un tale sistema, abbiamo sonicato una dispersione di fosfolipidi in tampone Tris-HCl contenente NH3, formando liposomi sonicati con NH₃ all'interno e all'esterno dei liposomi. L'NH3 esterno è stato rimosso mediante dialisi, dopodiché la soluzione di CuSO4 è stata aggiunta al campione di liposomi contenente NH3 nel suo volume interno. Abbiamo quindi trattato i liposomi con HDP-2P e monitorato spettrofotometricamente i cambiamenti nella densità ottica.

Per determinare la lunghezza d'onda ottimale per misurare le variazioni di densità ottica, abbiamo registrato gli spettri di assorbanza di [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ in una soluzione di 0,025 M CuSO4, 0,100 M NH3 e [Cu(H2O)6]2+ in una soluzione di 0,025 M CuSO4 , utilizzando la luce visibile nell'intervallo da 500 nm a 900 nm. Come mostrato nella Figura 6, l'irradiazione a 600 nm ha prodotto un'assorbanza massima per [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ e un'assorbanza minima per [Cu(H2O)6]2+, portandoci a selezionare 600 nm come lunghezza d'onda ottimale per i nostri esperimenti di permeabilità della membrana.

La Figura 7 mostra che la permeabilità di membrana all'NH₃ è più alta nei liposomi di PC arricchiti con CL e PS anionici. Questa osservazione è coerente con i nostri dati precedentemente riportati che mostrano che HDP-2P, unPLA 2 del gruppo IIA, interagisce efficacemente con il fosfolipide anionico palmitoiletoiloil-glicerofosfoglicerolo, portando all'idrolisi del substrato, un effetto non osservato con il fosfolipide neutro palmitoiletoiloleoilglicerofosfocolina36. In generale, la maggior parte degli enzimi PLA2 del gruppo IIA mostra un'attività idrolitica significativamente più elevata nei confronti dei fosfolipidi anionici 33,37,38. La permeabilità dei liposomi PC+PI è inferiore a quella dei liposomi PC+CL e PC+PS, ma rimane superiore a quella dei liposomi PC puri. Questi risultati si allineano bene con i risultati delle simulazioni di docking e dei saggi di attività idrolitica HDP-2P. In altre parole, ci si aspetta che i campioni liposomiali che mostrano una bassa permeabilità siano strutturalmente stabili a causa dell'incapacità di HDP-2P di idrolizzare i fosfolipidi e a causa di una minore affinità di HDP-2 a legarsi a PI e fosfoinositidi, come previsto dai dati di docking molecolare (Figura 2, Figura 3 e Figura 4). Pertanto, l'attività idrolitica enzimatica da parte dell'HDP-2P (Figura 5) e la permeabilità della membrana, come mostrato nella Figura 7, dovrebbero essere correlate positivamente.

Tuttavia, nei liposomi PC+PI-4-P e PC+PI-4,5-P2 , la permeabilità non è aumentata dopo il trattamento con HDP-2P. Mentre i risultati di permeabilità nei liposomi PC+PI-4,5-P2 si correlano bene con le simulazioni di docking e i dati di attività idrolitica HDP-2P per gli stessi liposomi, l'assenza di un aumento della permeabilità nei liposomi PC+PI-4-P non si allinea completamente con i risultati dell'attività idrolitica, poiché in questi liposomi è stato registrato un piccolo grado di attività idrolitica. Questi risultati suggeriscono che un leggero aumento localizzato dell'attività idrolitica nei liposomi PC+PI-4-P non disturba l'impacchettamento a doppio strato di fosfolipidi in misura tale da modificare la permeabilità della membrana a NH3.

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Figura 1: Notazioni delle frazioni cariche e polari della testa polare del fosfatidilinositolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Interazione di PI con il centro attivo di HDP-2P prevista per il sito di legame #6 mediante software di docking molecolare. PI è dato in rappresentazione a bastoncino e HDP-2P è dato in linea (diagramma a sinistra) e in superficie molecolare (diagramma a destra). Per le rappresentazioni a bastoncino, lo smeraldo rappresenta il carbonio, l'arancione è il fosforo, il rosso è l'ossigeno e il bianco è l'idrogeno. Per la superficie e le linee molecolari, il verde rappresenta il carbonio, il blu è l'azoto, il rosso è l'ossigeno, il bianco è l'idrogeno e il giallo è lo zolfo. Le linee tratteggiate gialle identificano i legami intermolecolari. Le frecce indicano i residui di aminoacidi nel centro attivo. Abbreviazioni: PI = Fosfatidilinositolo; HDP-2P = subunità basica della fosfolipasi del veleno di vipera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Interazione di PI-4-P con il centro attivo di HDP-2P prevista per il sito di legame #1 mediante software di docking molecolare. PI-4-P è dato in rappresentazione a bastoncino e HDP-2P è dato in linee (diagramma a sinistra) e in superficie molecolare (diagramma a destra). Per i bastoncini, lo smeraldo rappresenta il carbonio, l'arancione è il fosforo, il rosso è l'ossigeno e il bianco è l'idrogeno. Per la superficie e le linee molecolari, il verde rappresenta il carbonio, il blu è l'azoto, il rosso è l'ossigeno, il bianco è l'idrogeno e il giallo è lo zolfo. Le linee tratteggiate gialle identificano i legami intermolecolari. Le frecce indicano i residui di aminoacidi nel centro attivo. Abbreviazioni: PI-4-P = Fosfatidilinositolo-4-fosfato; HDP-2P = subunità basica della fosfolipasi del veleno di vipera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Interazione di PI-4,5-P2 con la superficie molecolare di HDP-2P prevista per il sito di legame #6 dal software di docking molecolare. PI-4,5-P2 si lega a una grotta simile a una scanalatura situata sotto il centro attivo di HDP-2P. I cinque residui chiave di amminoacidi nel centro attivo sono riportati nella notazione a tre lettere. PI-4,5-P2 è dato in rappresentazione a bastoncino e HDP-2P è dato in rappresentazione in linea (diagramma a sinistra) e su superficie molecolare (diagramma a destra). Per i bastoncini, lo smeraldo rappresenta il carbonio, l'arancione è il fosforo, il rosso è l'ossigeno e il bianco è l'idrogeno. Per la superficie e le linee molecolari, il verde rappresenta il carbonio, il blu è l'azoto, il rosso è l'ossigeno, il bianco è l'idrogeno e il giallo è lo zolfo. Abbreviazioni: PI-4,5-P2 = fosfatidilinositolo-4,5-difosfato; HDP-2P = subunità basica della fosfolipasi del veleno di vipera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Curve di attività idrolitica da campioni di liposomi a vari rapporti molari HDP-2P/fosfolipidi. Liposomi in PC+CL (verde scuro), PC+PS (arancione), PC+PI (blu scuro), PC+PI-4-P (blu), PC+PI-4,5-P2 (verde) e PC (viola). I valori di densità ottica in unità arbitrarie rappresentano la media delle letture triplicate a 550 nm. Le barre di errore indicano la SD delle letture triplicate. La significatività statistica delle differenze nei valori di densità ottica tra i campioni di liposomi è stata valutata utilizzando ANOVA, con tutti i valori p risultati ben al di sotto di 0,05. Abbreviazioni: PC = fosfatidilcolina; CL = cardiolipina a cuore bovino ; PS = fosfatidilserina; PI = Fosfatidilinositolo; PI-4-P = fosfatidilinositolo-4-fosfato; PI-4,5-P2 = fosfatidilinositolo-4,5-difosfato; u.a. = unità arbitrarie; HDP-2P = subunità basica della fosfolipasi del veleno di vipera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Spettri di assorbanza di soluzioni acquose di complessi di rame. Complessi di rame [Cu(H2O)6]2+ (linea arancione) e [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (linea blu), irradiati da luce visibile nell'intervallo da 500 nm a 900 nm. Il complesso di rame [Cu(H2O)6]2+ è stato prodotto in una soluzione di 0,025 M di CuSO4 e il complesso di rame [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ è stato prodotto in una soluzione di 0,025 M di CuSO4 contenente 0,100 M di NH3. I valori di assorbanza in questa figura per ciascun punto dati sono le medie delle letture dell'assorbanza eseguite in triplice copia. Le barre di errore rappresentano la SD dalle letture triplicate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Curve di permeabilità della membrana da campioni di liposomi. Liposomi costituiti da PC+CL (viola), PC+PS (blu), PC+PI (blu scuro), PC+PI-4-P (verde scuro), PC+PI-4,5-P2 (arancione) e PC (verde) a vari rapporti molari HDP-2P/fosfolipidi. I valori di permeabilità della membrana sono espressi come valori di densità ottica in unità arbitrarie (u.a.) misurate a 600 nm. Ogni punto dati rappresenta la media delle letture in triplice copia. Le barre di errore indicano la SD delle letture triplicate. La significatività statistica delle differenze nei valori di densità ottica tra i campioni di liposomi è stata valutata utilizzando ANOVA, con tutti i valori p risultati ben al di sotto di 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Energie di legame di affinità previste per complessi molecolari candidati di HDP-2P con PI. Le simulazioni di modellazione molecolare sono state utilizzate per prevedere i tipi di legami e le affinità del sito di legame, nonché le frazioni cariche e polari sia del gruppo principale del fosfatidilinositolo che dei residui di amminoacidi HDP2P che partecipano alle loro interazioni intermolecolari. I gruppi caricati e polari del fosfatidilinositolo sono evidenziati nella Figura 1. Si noti che Pb in NH,pbδ+ denota un legame peptidico. Abbreviazioni: PI = Fosfatidilinositolo; HDP-2P = subunità basica della fosfolipasi del veleno di vipera. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Energie di legame di affinità previste per complessi molecolari candidati di HDP-2P con PI-4-P. Le simulazioni di modellazione molecolare sono state utilizzate per prevedere i tipi di legami e le affinità del sito di legame, nonché le frazioni cariche e polari sia del gruppo principale fosfatidil-inositolo-4-fosfato (PI-4-P) che dei residui amminoacidici HDP2P che partecipano alle loro interazioni intermolecolari. Si noti che Pb in NHpbδ+ denota un legame peptidico. Clicca qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 1: Flusso di lavoro di docking molecolare. Panoramica della procedura di docking molecolare utilizzando AutoDock, inclusa la costruzione del ligando, la preparazione del recettore, la configurazione della grid box e l'esecuzione di simulazioni di docking per prevedere le interazioni PI-HDP-2P. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

In questo studio, abbiamo studiato se i gruppi fosfato legati covalentemente all'anello dell'inositolo nel fosfatidilinositolo (PI) possono prevenire la degradazione delle membrane fosfolipidiche da parte dell'enzima fosfolipasi A2 (PLA2). Per valutare la progressione della degradazione della membrana fosfolipidica causata dall'attività idrolitica del PLA2, abbiamo progettato un metodo semplice ma altamente sensibile e accurato per misurare i cambiamenti nella permeabilità della membrana, che dovrebbe aumentare con il progredire della degradazione strutturale.

Il metodo si basa su una reazione di sostituzione del ligando che coinvolge il complesso esaacquarame(II), [Cu(H2O)6]2+, sospeso nell'ambiente acquoso al di fuori dei liposomi fosfolipidici, mentre l'ammoniaca (NH3) è incapsulata all'interno dei liposomi. L'ammoniaca ha una maggiore affinità per il Cu2+ rispetto alle molecole d'acqua, ma l'NH3 deve permeare attraverso la membrana liposomiale per accedere alla fase acquosa esterna, dove sostituisce le molecole di H2O in [Cu(H2O)6]2+. Se l'integrità strutturale della membrana liposomiale è compromessa a causa dell'idrolisi fosfolipidica catalizzata da PLA2, l'aumento della permeabilità della membrana a NH3 faciliterà la sostituzione del ligando, portando a un cambiamento di colore dal blu pallido di [Cu(H2O)6]2+ al blu scuro di [Cu(H2O)2(NH3)4]2+. Abbiamo monitorato quantitativamente questa trasformazione impiegando la spettrofotometria per registrare la variazione della densità ottica a 600 nm.

Abbiamo precedentemente utilizzato 1H-NMR con lo ione paramagnetico ferrocianuro, [Fe(CN)6]3-, per studiare i cambiamenti nella permeabilità di membrana influenzati da HDP-2P24 e dalle cardiotossine del veleno di cobra 24,25,26,27,28,39. Abbiamo anche utilizzato una gamma di sonde fluorescenti e fosforescenti per studiare gli effetti delle cardiotossine al veleno di cobra sulla permeabilità delle membrane liposomiali 20,23,40. Tuttavia, le sonde ferrocianuro e fluorescenti/fosforescenti sono grandi entità molecolari non fisiologiche che penetrano nelle membrane lipidiche quando l'integrità della membrana è significativamente danneggiata. Al contrario, il nostro nuovo test di sostituzione del ligando utilizza NH₃, un piccolo metabolita cellulare naturale in grado di permeare le membrane lipidiche in presenza di sottili perturbazioni di impacchettamento lipidico. Questa maggiore sensibilità del nostro nuovo metodo di permeabilità della membrana è evidenziata dalla sua capacità di rilevare cambiamenti nella permeabilità della membrana con un rapporto HDP-2P/molare lipidico di 0,001, rispetto a 0,004 richiesto per la rilevazione di ¹H-NMR/ferrocianuro23.

Nello stesso studio, abbiamo utilizzato l'estinzione della fosforescenza eritrosina mediante ferrocene per esaminare gli effetti dell'HDP-2P sullo scambio lipidico intermembrana, valutati dalla variazione del rapporto tra il tempo di vita dell'eritrosina nei campioni di prova (τn) e quello nel campione di controllo (τ0)23. Con un rapporto molare HDP-2P/lipidico di 0,004, il valore τn/τ0 è diminuito a 0,423, indicando uno stato di fluidità della membrana permeabile ai cationi bivalenti24. Pertanto, il nostro saggio di sostituzione del ligando basato su NH₃ rileva la permeabilità della membrana con un rapporto molare HDP-2P/lipide di 0,001, mentre i saggi convenzionali (1H-NMR/ferrocianuro e quenching della sonda di fosforescenza) rilevano la permeabilità della membrana solo con un rapporto molare di 0,004. Ciò dimostra che il nostro test basato su NH3 è quattro volte più sensibile dei test convenzionali.

L'eccezionale sensibilità del nostro test basato su NH3 ha prodotto dati di permeabilità strettamente correlati alle misurazioni dell'attività idrolitica, con una sola discrepanza apparente: i liposomi PC+PI-4-P hanno mostrato un'idrolisi insignificante senza cambiamenti di permeabilità, suggerendo che la minima produzione locale di lisofosfolipidi/acidi grassi non influisce sull'impacchettamento lipidico globale, che non influenza l'integrità strutturale e la permeabilità della membrana. Pertanto, questo studio ha dimostrato che la reazione di sostituzione del ligando in un sistema ionico complesso, che coinvolge un ligando incapsulato all'interno del volume interno dei liposomi, ha prodotto risultati che si sono allineati in modo eccellente con i dati di attività idrolitica di HDP-2P. Questi risultati, a loro volta, erano in forte accordo con gli studi in silico sul legame di PI e fosfoinositidi alla superficie molecolare di HDP-2P.

Nel complesso, la simulazione AutoDock nel presente studio ha rivelato che PI si lega al centro attivo in quattro dei nove siti di legame identificati, mentre PI-4-P si lega al centro attivo solo in uno dei nove siti previsti. L'attività idrolitica di HDP-2P nei liposomi PC+PI-4-P era circa 5 volte inferiore rispetto ai liposomi PC+PI. Inoltre, studi in silico non hanno previsto alcun legame di PI-4,5-P2 al centro attivo di HDP-2P. Coerentemente, i saggi di attività del PLA2 e gli esperimenti di reazione di sostituzione del ligando hanno mostrato che il PI-4,5-P2 ha inibito completamente sia l'idrolisi dei fosfolipidi che l'aumento della permeabilità della membrana, mentre il PI-4-P ha mostrato un'attività idrolitica minore e non significativa e ha impedito completamente i cambiamenti di permeabilità della membrana. Queste osservazioni sono in buon accordo con gli studi in vitro sull'attività degli enzimi PLA2 umani citosolici, calcio-indipendenti e secreti nei confronti di PI, PI-4-P e PI-4,5-P235. Questi studi hanno dimostrato che solo il PLA citosolico2 del gruppo IVA mostrava un'attività catalitica relativamente elevata verso PI e PI-4-P, mentre la sua attività verso PI-4,5-P2 era appena rilevabile. Tutti gli altri enzimi PLA2 testati non hanno mostrato alcuna attività nei confronti di PI-4,5-P235. Questa mancanza di attività è stata attribuita ai gruppi fosfato altamente idrofili sull'anello dell'inositolo, che interferiscono con le interazioni produttive tra la superficie della membrana e gli enzimi PLA2 35. Suggeriamo che l'estensione verso l'esterno dei gruppi fosfato sull'anello dell'inositolo nella soluzione e la loro capacità di formare legami ione-polari e idrogeno con residui della cavità simile a un solco di HDP-2P probabilmente impedisce a HDP-2P di avvicinarsi alla superficie della membrana abbastanza da esercitare la sua attività idrolitica, stabilizzando così la membrana e riducendo la degradazione delle membrane fosfolipidi da parte di HDP-2P che può essere dannosa per le cellule attivando le vie di morte cellulare. Questo meccanismo sembra allinearsi con il potenziale ruolo protettivo dei fosfoinositidi in condizioni di malattia che coinvolgono un'attività enzimatica aberrante.

La forte correlazione tra i risultati ottenuti dai saggi di permeabilità di membrana, dalle misure di attività idrolitica e dagli studi di docking molecolare in silico evidenzia l'affidabilità del metodo della reazione di sostituzione del ligando. Questo approccio, che utilizza un ligando incapsulato all'interno di liposomi, si dimostra uno strumento accurato ed efficace per valutare i cambiamenti di permeabilità di membrana causati da perturbazioni strutturali nell'organizzazione stabile a doppio strato dei fosfolipidi. Sebbene riconosciamo che gli studi di docking molecolare con AutoDock presentati in questo articolo non forniscono una comprensione approfondita di come i fosfolipidi possano interagire con HDP-2P in modo dinamico e longitudinale, in futuro dovranno essere eseguiti studi di dinamica molecolare per identificare ulteriori meccanismi molecolari di come HDP-2 può permeabilizzare i doppi strati fosfolipidici composti da vari fosfolipidi. È importante notare che l'esecuzione di studi di dinamica molecolare richiede elevate risorse computazionali, come computer e cluster ad alte prestazioni, che non sono disponibili in molte istituzioni accademiche che hanno risorse limitate e finanziamenti per la ricerca. Infine, riconosciamo l'uso di un recettore rigido (HDP-2P) nel presente articolo sulle tecniche e la mancanza di un ambiente solvente/membrana. Tuttavia, vogliamo sottolineare che l'esecuzione di attracchettamenti molecolari di HDP-2P con vari fosfolipidi utilizzando un recettore rigido è l'approccio convenzionale per eseguire studi di docking iniziali per identificare un primo passaggio di strutture candidate agganciate che possono essere seguite in futuro con un recettore flessibile una volta identificati i residui critici di amminoacidi all'interno del lato catalitico che si legano ai substrati per concentrarsi sulle regioni molecolari che possono essere rese flessibili in Seguire studi di docking molecolare e in ambiente solvatato. Pertanto, sfruttare le collaborazioni con altre istituzioni che dispongono di maggiori risorse può essere un modo per contribuire a corroborare alcuni dei risultati iniziali forniti da AutoDock e identificare ulteriori meccanismi molecolari delle interazioni substrato-enzima.

In conclusione, i risultati di questo studio dimostrano che il metodo della reazione di sostituzione del ligando, che utilizza un ligando incapsulato all'interno di liposomi, può essere efficacemente applicato agli studi sulla permeabilità della membrana in vari processi mediati dalla membrana. Questi includono le interazioni ligando-recettore, le interazioni lipidi-proteine, lo scambio intermembrana, la fusione e la fissione della membrana e le contrazioni neuromuscolari, tra le altre. Inoltre, questo approccio ha un potenziale significativo per lo studio dei farmaci membranotropici. Allo stesso tempo, riconosciamo che, sebbene i nuovi metodi nelle membrane modello siano inestimabili per sezionare meccanismi specifici delle interazioni di membrana, le loro semplificazioni intrinseche limitano la loro capacità di replicare completamente la complessità strutturale, composizionale e funzionale delle membrane biologiche in vivo. È quindi essenziale interpretare con cautela i dati provenienti dai sistemi modello e convalidare i risultati utilizzando modelli cellulari o organismici, ove possibile.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Gli studi in questo articolo sono stati supportati dalla sovvenzione per start-up della Beijing Chaoyang KaiWen Academy (E.S.G.) e dal SEPA Award, NIH 5R25MD019151-03 (R.K.D.). Il lavoro relativo alla preparazione dell'HDP-2 è stato sostenuto da una sovvenzione della Russian Science Foundation n. 24-15-00280 (Y.N.U.). Gli autori desiderano ringraziare la Dott.ssa Maryam Barancheshmeh per aver scritto la sceneggiatura e sviluppato il video sull'applicazione della simulazione di docking molecolare, che è stato preparato dopo la pubblicazione di questo articolo di ricerca.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Subunità base HDP-2P del veleno di vipera di V. nikolskii PLA2, HDP-2, 98,5% di purezza  Istituto di Chimica Bioorganica, MoscaHDP-2 isolato secondo il potocol in PMID:18083205. HDP-2P purificato da HDP-2 da DEAE Sephadex A-50 & nbsp;  
Cardiolipina (cuore, bovino) (sale di sodio), >99%MacklinC916138
Coenzima A, FUJIFILM Wako' s kit NEFA  Lexington, MA, USA
Tubo di dialisi Cellulare membrana cellulare cutoff 1,0 kDaSigma Aldrich Trading Co. Ltd., Shanghai, Cina & nbsp;
Termostato del serbatoio d'acqua controllato digitalmente  YoungGuangMing Medical Instruments Ltd. Co., Pechino, Cina & nbsp;
Bilancia analitica elettronica ad alta precisione FA2004 Shanghai Maiyi Ltd. Co., Cina
JingHua 752 spettrofotometro UV-Visibile  Shanghai Jinghua Instruments Co., Ltd., Shanghai, Cina
L-&alfa;-fosfatidilcolina (Uovo, Pollo), ≥ 95%MacklinL799415
L-&alfa;-fosfatidilinositolo (fegato, bovino) (sale di sodio), ≥ 99%MacklinL780292
L-&alfa;-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato (cervello, sucina) (sale di ammonio), ≥ 99%MacklinL996223
L-&alfa;-fosfatidilinositolo-4-fosfato (cervello, suino) (sale di ammonio), 99%MacklinL970250
L-&alfa;-fosfatidilserina (cervello, sucina) (sale di sodio), >99%MacklinL864755
Agitatore magnetico JB-3 Shanghai Leici JB-3
Misuratore di pH PHS-3C Shanghai INESA Scientific Instruments Co., Ltd., Cina
Microcentrifuga TGL-16B  Shanghai 3 Anting Co., Shanghai, Cina
Dispenser a ultrasuoni Yt-JY96-IIN Shanghai Yetuo Technology Co., Ltd., Cina
Pompa a vuoto TW-1MTingwei Co. Ltd., Wenling, Cina

Riferimenti

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