Ruolo potenziale dell'asse di segnalazione PGE 2-EP4-CA2+ nell'osteoartrite post-traumatica

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per delineare sistematicamente i metodi di definizione e valutazione dei modelli di ratto per l'osteoartrite, attraverso il confronto, fornendo prove scientifiche della diversa patogenesi tra osteoartrite acuta indotta da lesioni meccaniche e osteoartrite cronica indotta da fattori metabolici/ambientali. Il modello ACLT è l'obiettivo principale, sottolineando i cambiamenti nella via di segnalazione della disfunzione mitocondriale EP4-Ca²⁺.

Abstract

L'osteoartrite post-traumatica (PTOA) è una malattia degenerativa delle articolazioni scatenata da traumi o da un intenso stress meccanico, che porta alla degenerazione della cartilagine articolare e alla compromissione funzionale. La prostaglandina E2 (PGE₂) contribuisce in modo significativo alla degradazione della cartilagine a seguito di lesioni meccaniche attivando il suo recettore, il recettore 4 della prostaglandina E (EP4), sulle membrane dei condrociti. L'omeostasi della cartilagine articolare si basa principalmente sull'equilibrio dinamico tra la degradazione e la riparazione della cartilagine, un processo finemente regolato dai condrociti. È stato dimostrato che la via di segnalazione Ca²⁺/CAMKII (Calmodulin-dependent Protein Kinase II) svolge un ruolo critico nel mediare il ripristino della funzione dei condrociti. In questo studio, abbiamo osservato un aumento dell'espressione di EP4, del recettore dell'inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3R) e del CaMKII fosforilato nei condrociti stimolati con interleuchina-1 beta (IL-1β), suggerendo un possibile legame tra la segnalazione di EP4 e la disregolazione del calcio. Tuttavia, mancano ancora prove dirette che confermino il coinvolgimento dell'asse EP4-Ca²⁺/CaMKII nel PTOA. Sono necessarie ulteriori indagini che utilizzino interventi genetici o farmacologici per chiarire questo potenziale meccanismo. Questi risultati forniscono una base preliminare per esplorare l'omeostasi del calcio e la segnalazione EP4 come bersagli per il trattamento con PTOA.

Introduzione

Sebbene l'attività fisica sia ampiamente promossa per i suoi benefici per la salute, rimane una delle principali cause di lesioni muscoloscheletriche degli arti inferiori, che possono portare a vari esiti avversi¹. Tra questi, il PTOA è diventato un onere crescente per adolescenti e giovani adulti che subiscono lesioni articolari in giovane età². In modo allarmante, circa il 48-52% degli individui che subiscono lesioni articolari legate allo sport sviluppa PTOA entro 11-17 anni ^3,4. L'articolazione del ginocchio, una delle articolazioni più frequentemente lesionate negli sport giovanili e nelle attività ricreative, è particolarmente vulnerabile nella progressione dalla lesione articolare al PTOA. Uno studio prospettico ha riportato che gli individui con lesioni al ginocchio hanno un rischio 10 volte maggiore di sviluppare l'artrosi del ginocchio confermata radiograficamente 12-20 anni dopo l'infortunio rispetto agli individui illesi⁵. Inoltre, nei giovani adulti, le valutazioni radiografiche hanno dimostrato che le calciatrici con lesioni alla transezione del legamento crociato anteriore (ACLT) hanno un rischio del 51% di sviluppare PTOA entro 12 anni, mentre i giocatori di sesso maschile hanno un rischio del 41% entro 14 anni⁵. Questi risultati evidenziano l'impatto negativo a lungo termine delle lesioni articolari legate allo sport sulla salute muscoloscheletrica. Pertanto, la comprensione dei meccanismi patologici irreversibili alla base dello sviluppo del PTOA è fondamentale per identificare strategie di intervento appropriate volte a mitigare la progressione della malattia.

La disregolazione precoce dell'omeostasi del Ca²⁺ è uno degli indicatori chiave per l'inizio del PTOA⁶. Il Ca²⁺ si lega alla calmodulina (CaM) per formare un complesso Ca²⁺/CaM che può interagire con il CaMKII, alleviando la sua conformazione autoinibitoria e regolando l'attività chinasica⁷. Sia nell'OA umana che in quella murina, l'espressione di CaMKII fosforilata (la forma attivata di CaMKII) è aumentata, mentre l'uso di inibitori di CaMKII blocca questo aumento dei livelli di fosforilazione, portando alla distruzione della cartilagine articolare⁸, dimostrando l'importante ruolo regolatorio di Ca²⁺/CaMKII nel mediare l'omeostasi della cartilagine da OA. Normalmente, questi cambiamenti sono influenzati in modo cruciale dall'attivazione dei meccanismi infiammatori nello sviluppo del PTOA. Alti livelli di PGE₂, come mediatore chiave del dolore pro-infiammatorio, influenzano la progressione dell'OA attivando il recettore EP4. In particolare, il knockout condizionale di EP4 nella cartilagine articolare migliora la formazione della cartilagine e il metabolismo anabolico, inibendo l'ipertrofia e il catabolismo dei condrociti, promuovendo così la rigenerazione della cartilagine articolare stabile e matura invece della fibrocartilagine e alleviando il dolore articolare⁹. Dato il ruolo cruciale della via di segnalazione Ca²⁺/CaMKII nella fisiologia dei condrociti e il coinvolgimento riconosciuto del recettore EP4 nella progressione dell'osteoartrite, questo studio ha avuto lo scopo di esplorare se l'attivazione di EP4 è associata a cambiamenti nella segnalazione del calcio e nella disfunzione mitocondriale durante lo sviluppo del PTOA. Sebbene la relazione causale tra EP4 e disregolazione del Ca²⁺ rimanga da determinare, i dati qui riportati suggeriscono un possibile legame meccanicistico che merita ulteriori indagini.

Questo studio si concentra sui potenziali meccanismi che collegano l'attivazione del recettore EP4 con la segnalazione del Ca²⁺ e la disfunzione mitocondriale durante lo sviluppo del PTOA. Rispetto ai metodi diagnostici tradizionali, come le tecniche di imaging che rilevano la progressione del PTOA, e agli attuali approcci terapeutici, come i farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) per il sollievo dei sintomi, il nostro approccio mira a rivelare disturbi precoci della segnalazione intracellulare nella patogenesi del PTOA. Questa visione meccanicistica fornisce una comprensione più precisa dell'insorgenza e della progressione della malattia, offrendo nuove strade per la diagnosi precoce e interventi mirati. Pertanto, questo studio ha stabilito un modello di ratto PTOA indotto dalla transezione del legamento crociato anteriore (ACLT) per imitare le lesioni meccaniche comunemente osservate negli atleti con controllo motorio alterato durante l'attività fisica acuta o cronica. Questo modello funge da rappresentazione ottimale del danno articolare meccanico post-traumatico, offrendo una piattaforma riproducibile per studiare sia i cambiamenti istopatologici che i meccanismi molecolari sottostanti. Una dieta ricca di grassi più l'esposizione in ambiente umido (FD) funge da controllo positivo, con l'obiettivo di simulare i fattori di rischio metabolici e ambientali associati all'osteoartrite cronica. Il primo modella il danno acuto causato da trauma meccanico, mentre il secondo rappresenta un modello di malattia naturale indotta da disordini metabolici e fattori ambientali, anche se la patogenesi finale in questo gruppo potrebbe non seguire l'asse EP4-Ca²-mitocondriale.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono gli animali sono state esaminate e approvate dal Comitato Etico Animale dell'Ospedale Provinciale di Medicina Cinese del Guangdong (numero di approvazione etica: 2024014-2). Lo studio è stato condotto in conformità con le norme sull'uso etico degli animali da laboratorio stabilite dal Consiglio di Stato della Repubblica Popolare Cinese.

1. Animali

1. Utilizzare ratti SPF di razza Sprague-Dawley (SD) per ridurre i potenziali effetti confondenti associati al ciclo estrale. Seleziona un totale di nove ratti SD maschi, di età compresa tra 4 settimane e di peso compreso tra 90 g e 100 g, per questo esperimento.
   NOTA: Questi ratti sono stati acquistati da un fornitore di animali da laboratorio autorizzato in Cina (numero di certificato: 20240410Aazz0619000774).
2. Mantenere tutti gli animali in un ambiente specifico privo di agenti patogeni (SPF). Mantenere un ambiente controllato a una temperatura di 24 ± 2 °C con un'umidità media del 60 ± 1% e un ciclo luce/buio di 12 ore.
3. Assicurati che i ratti abbiano libero accesso all'acqua acidificata e a una dieta standard per roditori.

2. Costruzione e intervento di modelli animali

1. Acclimatare i ratti per un periodo di 2 settimane presso il centro di alimentazione. Assegna casualmente i ratti in tre gruppi a 6 settimane di età: gruppo di controllo, gruppo PTOA e gruppo FD, con tre ratti in ciascun gruppo.
2. Mantenere il gruppo di controllo in condizioni standard.
3. Anestetizzare il gruppo PTOA con isoflurano (4% per induzione e 1%-2% per mantenimento).
4. Esporre chirurgicamente le articolazioni bilaterali del ginocchio tramite un'incisione cutanea longitudinale utilizzando un approccio pararotuleo mediale.
5. Eseguire l'ACLT utilizzando un bisturi e confermare la transezione completa eseguendo un test positivo del cassetto anteriore.
   NOTA: La trassezione bilaterale del LCA è stata eseguita per garantire la coerenza del modello e ridurre la variabilità individuale. I dati di entrambe le ginocchia sono stati mediati per ottenere un valore per animale per l'analisi.
6. Trasferire periodicamente i ratti dei gruppi FD in una camera climatizzata, situata nella stessa struttura. Sottoponi questi ratti a una dieta ricca di grassi.
   NOTA: La dieta ricca di grassi conteneva il 20% di saccarosio, il 15% di strutto, l'1,2% di colesterolo, lo 0,2% di colato di sodio, il 10% di caseina, lo 0,6% di fosfato acido di calcio, lo 0,4% di calcare in polvere, lo 0,4% di premiscela e il 52,2% di mangime basale. Il profilo nutrizionale del mangime di controllo era il seguente: 19% di proteine, 31% di grassi e 50% di carboidrati, con un rapporto calorico di 17% di proteine, 37% di grassi e 46% di carboidrati.
7. Mantenere le condizioni ambientali all'interno della camera climatica a una temperatura di 24 ± 2 °C, un livello di umidità del 90 ± 4% e un ciclo di luce giornaliero di 12 ore.
   NOTA: A causa dell'aumento del rischio di crescita batterica in un ambiente ad alta temperatura e umidità, sterilizzare l'acqua potabile e il cibo e reintegrarli quotidianamente per ridurre al minimo la contaminazione. La durata totale dell'intervento sperimentale è stata di 12 settimane.

3. Analisi dell'andatura (impronte)

1. Condurre l'analisi dell'impronta 12 settimane dopo l'inizio del trattamento nei ratti modello, utilizzando un metodo precedentemente descritto¹⁰.
2. Ricopri le superfici ventrali delle zampe posteriori dei ratti con inchiostro rosso e gli è stato permesso di camminare lungo un sentiero lungo 100 cm e largo 8 cm, ricoperto di carta bianca.
3. Per incoraggiare i ratti a muoversi, posiziona una camera buia alla fine del percorso per incoraggiare il movimento in avanti.
4. Effettuare tre misurazioni sequenziali per ottenere valori medi per ciascun parametro, tra cui la lunghezza del passo e la lunghezza del passo, che sono stati utilizzati per valutare l'irregolarità.
5. Determinare la lunghezza del passo (cm) misurando la distanza percorsa dalla stessa zampa posteriore tra due passi successivi.
6. Definisci la lunghezza del passo (cm) come la distanza orizzontale tra le zampe posteriori sinistra e destra.
7. Misura l'angolo della zampa (°) come l'angolo tra il secondo dito del piede e il calcagno, rispetto a una linea orizzontale¹¹.
8. Misura la lunghezza del passo, la lunghezza del passo e l'angolo della zampa direttamente sulle immagini dell'impronta scansionate utilizzando il software Image-Pro Plus (versione 6.0), utilizzando gli strumenti integrati di misurazione della distanza e dell'angolo.
   NOTA: Questi parametri dell'andatura sono fondamentali per identificare sottili menomazioni funzionali nelle prime fasi dell'osteoartrite. I pazienti possono mostrare una riduzione della lunghezza del passo e del passo per proteggere le articolazioni dolorose, mentre l'aumento dell'angolo di convergenza e l'asimmetria dell'andatura si verificano spesso come risposte compensatorie all'instabilità articolare indotta dal dolore.

4. Misurazione del diametro del giunto

1. Misurare il diametro del giunto utilizzando un micrometro a spirale calibrato (mm) dopo aver modellato in ciascun gruppo.
   NOTA: Con il progredire dell'osteoartrite, i pazienti in genere mostrano gonfiore e dolore articolare. Un grado più elevato di gonfiore può indicare uno stadio più grave della malattia.

5. Misurazione della forza di presa

1. Misura la forza di presa degli arti posteriori utilizzando un misuratore digitale di forza di presa dotato di una griglia di trazione, un misuratore di forza dotato di una griglia di trazione (90 mm × 90 mm).
   1. Tieni delicatamente il topo per la coda e la pelle sulla parte posteriore del collo.
   2. Abbassare l'animale fino a quando gli arti posteriori afferrano saldamente la griglia, quindi tirare costantemente l'animale orizzontalmente lungo l'asse del sensore di forza finché non rilascia la presa.
   3. Ripeti il test tre volte per animale. Registra il valore più alto come forza di presa massima.
      NOTA: Durante il test della forza di presa degli arti posteriori, immobilizzare gli arti anteriori fissandoli con nastro adesivo su una superficie di cartone per evitare l'innesto accidentale degli arti anteriori con la griglia di trazione. La diminuzione della forza di presa è indicativa di una diminuzione della funzione muscolare e di potenziali deficit motori correlati al dolore associati alla progressione osteoartritica.

6. Isolamento e coltura primaria dei condrociti

1. Isolare i condrociti primari da ratti maschi di Sprague-Dawley di 6 settimane.
2. Sezionare le teste del femore e i piatti tibiali per raccogliere circa 100-150 mg di tessuto cartilagineo.
3. Lavare il fazzoletto due volte con PBS contenente l'1% di penicillina-streptomicina.
4. Digerire la cartilagine in 5 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% a 3 °C per 30 minuti.
5. Tagliare la cartilagine in³ pezzi di 1-2 mm e digerire ulteriormente in 10 mL di collagenasi II allo 0,2% a 37 °C per 4 ore su un agitatore a temperatura costante.
6. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm, centrifugare a 300 × g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
7. Risospendere il pellet cellulare in terreno DMEM/F12 integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina.
8. Incubare le cellule a 3 °C in atmosfera umidificata con CO₂ al 5%.

7. Trattamento cellulare

1. Contare i condrociti isolati utilizzando un emocitometro.
2. Seminare i condrociti in piastre a 6 pozzetti a una densità di 2 × 10⁵ cellule per pozzetto in 0,1 mL di terreno di coltura completo (DMEM/F12 integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina).
3. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 24 ore per consentire l'adesione.
4. Per stabilire un modello di PTOA infiammatorio in vitro , trattare i condrociti aderenti con IL-1β (10 ng/mL) per 48 ore una volta che la confluenza cellulare raggiunge circa l'80%.
5. Per il controllo positivo FD, sciogliere l'acido palmitico (PA, n. CAS 57-11-4) in cloroformio a diluizione 1:1000 per preparare una soluzione madre da 500 μM.
   1. Quando la confluenza cellulare ha raggiunto circa l'80%, aggiungere 1 μL della soluzione madre di PA per 1 mL di terreno di coltura per raggiungere una concentrazione finale di PA di 500 nM. Trattare i condrociti con questa soluzione per 48 ore.
6. Aggiungere 1 μL di cloroformio (controllo del veicolo) per 1 mL di terreno di coltura per controllare le cellule senza PA.

8. Raccolta dei campioni, decalcificazione e preparazione dell'inclusione

1. Sopprimere gli animali a 12 settimane dall'intervento mediante inalazione di un sovradosaggio di isoflurano (≥5%) in una camera sigillata per almeno 5 minuti e confermare la completa cessazione della respirazione e del battito cardiaco.
   NOTA: Questo metodo è stato approvato dal Comitato Etico Animale ed è conforme alle linee guida nazionali per l'eutanasia umana degli animali da laboratorio.
2. Raccogliere entrambe le articolazioni del ginocchio da tre ratti per gruppo (n = 3, totale = 6 ginocchia) per la valutazione istologica.
3. Fissare i campioni in paraformaldeide (PFA) al 4% con un rapporto tessuto/volume fissativo superiore a 1:20 per oltre 48 ore su un agitatore a °C.
4. Sciacquare i fazzoletti sotto l'acqua corrente del rubinetto per 1-2 ore per rimuovere i residui di fissativo.
5. Decalcificare i tessuti in una soluzione di EDTA 0,5 M (pH 7,4, ~15%) con un rapporto tessuto/soluzione di 1:20 per 21 giorni a 3 °C e sostituirli con una soluzione fresca ogni 3 giorni.
6. Valutare il completamento della decalcificazione sondando l'osso con un ago per ammorbidirlo.
7. Lavare i fazzoletti decalcificati sotto l'acqua corrente del rubinetto per 2 ore e metterli in cassette di inclusione.
8. Disidratare i campioni attraverso una serie di etanolo graduato: etanolo al 75% per 2 ore (o durante la notte), etanolo all'80% per 2 ore, etanolo al 95% per 0,5 ore ed etanolo assoluto due volte per 60 minuti. Quindi immergere in xilene:etanolo 1:1 per 20 min.
9. Pulire i tessuti in xilene due volte (10 min e 60 min).
10. Infiltrate i tessuti con paraffina nel seguente ordine: xilene:paraffina (1:1) per 15 minuti, paraffina morbida a 52-5 °C per 1 ora (due volte), quindi paraffina dura a 56-5 °C per 30 minuti.
11. Incorporare i tessuti utilizzando un sistema di inclusione in paraffina (ad es. Leica, impostato a 6 °C) e trasferire i blocchi su una piastra fredda a -2 °C per 2 ore.
12. La sezione di paraffina si blocca sagittalmente a μm di spessore utilizzando un microtomo.
13. Far galleggiare i nastri in un bagno d'acqua a 4 °C e montarli su vetrini puliti.
14. Asciugare all'aria le sezioni montate e cuocerle in forno a 60 °C per 2 ore per eliminare i residui di paraffina.
15. Deparaffinare le sezioni immergendole in sequenza in xilene (10 min), xilene fresco (10 min), etanolo assoluto (5 min), etanolo assoluto fresco (5 min), etanolo al 90% (5 min) ed etanolo al 75% (5 min), quindi risciacquare con acqua di rubinetto prima della colorazione.

9. Colorazione con ematossilina ed eosina (HE)

1. Le sezioni di tessuto deparaffinizzate e reidratate sono state immerse in una soluzione colorante di ematossilina allo 0,5% per 3-5 minuti a temperatura ambiente (RT; ~2 °C), seguite da un accurato risciacquo sotto l'acqua corrente del rubinetto.
2. Trattare brevemente le sezioni con una soluzione di differenziazione dell'ematossilina per 2-5 s e sciacquare sotto l'acqua corrente del rubinetto.
3. Eseguire la brunitura immergendo le sezioni nella soluzione azzurrante di ematossilina per 2-5 s, seguita dal risciacquo.
4. Disidratare le sezioni in etanolo all'85% e al 95% per 5 minuti ciascuna, quindi colorare in eosina Y allo 0,05% (alcolica) per 5 minuti.
5. Disidratare due volte in etanolo assoluto (5 minuti ciascuno), quindi illimpidire in xilene (5 minuti), seguito da xilene fresco (5 minuti).
6. Montare le sezioni con balsamo neutro e coprire con un vetrino coprioggetti.
   NOTA: Nella cartilagine ben conservata, l'ematossilina colora i nuclei di blu e l'eosina colora la matrice di rosa. La cartilagine danneggiata mostra perdita di condrociti, fibrillazione e matrice disorganizzata.

10. Safranina O - colorazione verde veloce (SOFG)

1. Colorare le sezioni con una soluzione Fast Green al 2% per 1-5 minuti a RT. Lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto fino a quando la cartilagine diventa incolore.
2. Differenziare brevemente le sezioni in acido cloridrico all'1% per 10-15 s, quindi risciacquare abbondantemente con acqua corrente.
3. Colorare le sezioni con una soluzione di Safranina O allo 0,2% per 5-10 s, quindi disidratare rapidamente attraverso quattro cambi di etanolo assoluto (3-5 s ciascuno).
4. Sezioni chiare in xilene (5 min), seguite da xilene fresco (5 min).
5. Monta i vetrini con balsamo neutro e copri con un vetrino coprioggetti.
   NOTA: La safranina O colora di rosso i proteoglicani della cartilagine, mentre Fast Green colora di verde i tessuti ossei/fibrosi. La perdita di rosso indica la deplezione e la degenerazione dei proteoglicani.
6. Valutare i cambiamenti istologici utilizzando il sistema di punteggio dell'Osteoarthritis Research Society International (OARSI). Misura la larghezza dello spazio articolare e lo spessore della cartilagine per valutare la degenerazione strutturale. Acquisisci immagini al microscopio ottico (ad es. ECLIPSE Ti2-E) a 4× (barra della scala = 50 μm) e 20x (barra della scala = 10 μm).
   NOTA: Utilizzare il software di imaging del sistema per l'acquisizione delle immagini e ImageJ (v1.48v) per l'analisi. Calibra le immagini tramite Analizza > imposta la scala con un micrometro. Per ogni articolazione, quantifica cinque campi casuali da tre sezioni sagittali utilizzando l'analisi in cieco da parte di tre osservatori indipendenti.

11. TC a micro μ

1. Sezionare le articolazioni del ginocchio di ratto 12 settimane dopo l'intervento e fissarle immediatamente in paraformaldeide al 4% a RT per 24 ore per preservare la morfologia dei tessuti.
2. Sciacquare i campioni fissati con PBS e conservarli in etanolo al 70% fino alla scansione.
3. Montare ciascun campione dell'articolazione del ginocchio su un portacampioni dedicato prima della scansione. Allineare il giunto lungo il suo asse lungo per ridurre al minimo gli artefatti di movimento.
4. Esegui la scansione micro-μCT utilizzando un sistema micro-μCT con i seguenti parametri di scansione: tensione di raggi X 70 kV, corrente 100 μA e potenza 7 W.
5. Acquisisci quattro fotogrammi per proiezione e impilali per migliorare la qualità dell'immagine, con un passo di rotazione di 0,72°, completando una rotazione completa di 360°.
6. Impostare la dimensione del voxel risultante (spessore della fetta) a 15 μm, fornendo immagini ad alta risoluzione adatte all'analisi dell'osso trabecolare.
7. Definire la regione di interesse (ROI) tra la cartilagine di crescita tibiale prossimale e il piatto tibiale, concentrandosi sull'osso subcondrale sia del femore che della tibia.
8. Ricostruisci i dati di scansione grezzi in immagini in sezione trasversale utilizzando il software di ricostruzione.
9. Importa le pile di immagini ricostruite in un software appropriato per l'analisi morfometrica quantitativa.
10. Valutare i parametri chiave tra cui la frazione di volume osseo (BV/TV, %), la densità minerale ossea (BMD, g/cm³) e la separazione trabecolare (Tb.Sp, mm).
11. Per la visualizzazione qualitativa e tridimensionale, utilizzare un software di visualizzazione 3D per generare rendering volumetrici della microarchitettura ossea.
12. Eseguire una valutazione visiva per confermare l'integrità strutturale e i cambiamenti morfologici osservati nei dati quantitativi.
    NOTA: Tutta l'elaborazione e l'analisi delle immagini sono state condotte da operatori in cieco per garantire risultati imparziali.

12. Elisa

1. Anestetizzare i ratti 12 settimane dopo l'intervento. Esporre e sezionare con cura l'aorta addominale per raccogliere campioni di sangue.
2. Lasciare coagulare il sangue raccolto a RT per 30 minuti e poi centrifugarlo a 755 × g (equivalenti a 3000 giri/min, utilizzando una centrifuga con un raggio del rotore di 7,5 cm) a °C per 15 minuti.
3. Separare e conservare il siero per la successiva misurazione dei livelli di PGE₂ utilizzando un kit ELISA disponibile in commercio.
4. Parallelamente, seminare i condrociti primari e coltivarli per 24 ore, seguiti da un trattamento con IL-1β e PA per 48 ore, secondo il protocollo di trattamento cellulare stabilito. Dopo l'intervento, raccogliere e analizzare i surnatanti di coltura per la concentrazione di PGE₂ utilizzando lo stesso kit ELISA.

13. RT-PCR quantitativa

1. Estrarre l'RNA totale dai campioni cellulari utilizzando il reagente commerciale per l'estrazione dell'RNA (TRIzol).
2. Sintetizzare il cDNA utilizzando un kit di trascrizione inversa (con gDNA Remover) e conservare il cDNA risultante a -8 °C per la successiva analisi.
3. Eseguire la PCR quantitativa utilizzando SYBR Green e calcolare i livelli di espressione relativi utilizzando il metodo 2−ΔΔCt.
   NOTA: Le sequenze di primer utilizzate sono state le seguenti: β-actina in avanti: ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC; β-actina inversa: CTGACCCATACCCACCATCAC; EP4 in avanti: GGCACATTGTTGGTAAGCCC; EP4 in avanti: GGCTGTAGAAGTAGGCGTGG; Attaccante COX-2: GATGACGAGCGACTGTTCCA; COX-2 retromarcia: TGGTAACCGCTCAGGTGTTG.

14. Analisi del Western blotting

1. Liare le cellule con il tampone RIPA su ghiaccio per 30 minuti.
2. Separare i campioni di proteine mediante SDS-PAGE per 90 minuti, quindi trasferirli su membrane di nitrocellulosa per 2 ore.
3. Bloccare le membrane con BSA al 5% e lavarle con una soluzione tamponata con fosfato.
4. Eseguire l'immunoblotting utilizzando anticorpi specifici.
   NOTA: Gli anticorpi e le rispettive diluizioni erano i seguenti: anti-MMP9 (1:1000), anti-collagene II (1:1000), anti-COX2 (1:1000), anti-CaMKII (1:1000), anti-p-CaMKII (1:1000), anti-IP3R (1:1000), anti-Cyt-C (1:1000) e anti-β-actina (1:2000).
5. Dopo un'incubazione notturna con anticorpi primari, lavare le membrane con TBST e incubare per 1 ora con anticorpi secondari: HRP di topo (1:2000) o HRP di coniglio (1:2000) al buio.
6. Dopo un altro lavaggio con TBST, eseguire il rilevamento delle proteine utilizzando un kit di chemiluminescenza potenziato.
7. Analizza i dati con il software ImageJ (versione 1.48v).

15. Colorazione in immunofluorescenza

1. Coltura di condrociti su vetrini coprioggetti in piastre a 12 pozzetti fino a raggiungere l'80% di confluenza.
2. Dopo il trattamento con IL-1β e PA per 48 ore, o nessun trattamento come controllo, fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in PBS per 15 minuti a RT.
3. Permeabilizzare le cellule con PBS contenente lo 0,2% di Triton X-100 per 15 minuti.
4. Lavare le cellule tre volte con PBS (5 minuti ciascuna), quindi incubarle con anticorpo primario (anti-IP3R, diluizione 1:200) in tampone di diluizione anticorpale a °C per una notte.
5. Esporre le cellule a una diluizione 1:500 di anticorpo secondario IgG di capra marcato con isotiocianato di fluoresceina per 1 ora.
6. Controcolorare le cellule con 5 μg/mL di soluzione DAPI per 10 minuti.
   NOTA: Le immagini a fluorescenza sono state acquisite utilizzando una lente obiettivo 40x (barra della scala = 2 μm). Tutte le immagini sono state elaborate con il software ZEN e quantificate con ImageJ (versione 1.48v), seguendo procedure di calibrazione coerenti.

16. Analisi statistica

1. Conduci analisi statistiche utilizzando GraphPad Prism (versione 8.0.2).
2. Prima di applicare i test parametrici, valutare i dati per la distribuzione normale utilizzando il test di Shapiro-Wilk e per l'omogeneità della varianza utilizzando i test di Brown-Forsythe e Bartlett.
3. Usa l'ANOVA a una via seguita dal test post hoc di Tukey per i confronti tra più gruppi e applica un t-test di Student non accoppiato a due code per i confronti a due gruppi.
4. Considera il valore P inferiore a 0,05 come statisticamente significativo.
5. Presentare tutti i dati come media ± deviazione standard (SD) da almeno tre esperimenti indipendenti.

Risultati

Il PTOA indotto da ACLT mostra una distruzione prematura della cartilagine e deficit comportamentali rispetto alla KOA cronica indotta da FD (Figura 2 e Figura 3)
Il restringimento dello spazio articolare e la degenerazione della cartilagine sono gli esiti primari dell'OA. Studi precedenti hanno identificato il sovrappeso e i fattori ambientali (ad esempio, il clima umido) come potenziali fattori che contribu...

Discussione

Rispetto all'artrite reumatoide cronica indotta da fattori ambientali e dietetici, il trauma articolare indotto da ACLT porta a una progressione più rapida della malattia. I nostri risultati, basati su valutazioni comportamentali tra cui gonfiore articolare, forza di presa degli arti posteriori e analisi dell'andatura, hanno rivelato differenze significative tra il gruppo di controllo, il gruppo PTOA e il gruppo di controllo positivo indotte da fattori ambientali e dietetici. Dopo 12 set...

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Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,2% collagenasi II	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	N. CAS: 9001-12-1	Isolamento e coltura dei condrociti primari
0,2% Triton X-100	Beyotime, Cina	ST795	Immunofluorescenza
0,25% tripsina-EDTA	Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.	AR1071	Decalcificazione
0,25% tripsina-EDTA	Gibco, Stati Uniti	25200072	Isolamento e coltura dei condrociti primari
Soluzione fissativa di paraformaldeide al 4%	Biyuntian, Cina	P0099-3L	Fissazione tissutale
Anticorpo anti-CaMKII	Huabio, Cina	ET1608-47	Western blot (1:1000)
Anticorpo anti-collagene II	Abcam, Regno Unito	ab34712	Western blot (1:1000)
Anticorpo anti-COX2	Abcam, Regno Unito	ab179800	Western blot (1:1000)
Anticorpo anti-CYT-C	Selleck, Cina	F2534	Western blot (1:1000)
Anticorpo anti-IP3R (B-2)	Santa Cruz, Stati Uniti	SC-377518	Western blot (1:1000)
Anticorpo anti-MMP9	Abcam, Regno Unito	AB76003	Western blot (1:1000)
Anticorpo anti-p-CaMKII	Selleck, Cina	F0342	Western blot (1:1000)
Anticorpo anti-β-actina	Tecnologia di segnalazione cellulare (CST), Stati Uniti	8H10D10	Western blot (1:2000)
Soluzione di blocco BSA	Sigma Aldrich, Stati Uniti	N/A	5% BSA per il blocco del Western blot
Centrifuga (5424 R)	Eppendorf, Germania	N/A	755 &volte; g Velocità di centrifugazione
Cloroformio	Sigma Aldrich, Stati Uniti	N/A	Solvente per PA
Camera climatizzata (RXZ-158A)	Produttore nazionale, Cina	N/A	Modello per ambienti umidi
Kit di trascrizione inversa a colori	Invitrogen, Suzhou, Cina	N/A	Sintesi del cDNA
CTAn software	Bruker	versioni 1.9 e 4.1	Per analisi morfometriche quantitative
Software CTVol	Bruker	versione 2.0	Per la visualizzazione qualitativa e tridimensionale
Soluzione colorante DAPI	Beyotime, Cina	N/A	Colorazione nucleare (5 µ g/mL)
Misuratore digitale della forza di presa	Strumento Puxin	N/A	Misurazione della forza di presa degli arti posteriori
DMEM/F12 Medio	Corning, Stati Uniti	N/A	Terreno di coltura cellulare
EDTA (acido etilendiamminotetraacetico)	Aladdin	N/A	Decalcificazione dei tessuti ossei
Kit ELISA per PGE2	Elabscience, Wuhan, Cina	PGE2E-EL-0034	Rilevamento ELISA
Kit di chemiluminescenza potenziata	Millipore, Stati Uniti	WBKLS0500	Rilevamento di Western blot
Etanolo	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	CAS: 64-17-5	Disidratazione dei tessuti
Siero fetale bovino (FBS)	Corning, Stati Uniti	N/A	10% di concentrazione per la coltura
IgG anti-coniglio di capra marcato FITC	Beyotime, Cina	P0179 Kit	Immunofluorescenza (1:500)
Prisma GraphPad	Software GraphPad, Stati Uniti	Versione 8.0.2	Analisi dei dati
Ematossilina ed eosina (H& E) Kit di colorazione	Servicebio, Wuhan	G1005	Istologia
IL-1β	PeproTech, Stati Uniti	400-01B	10 ng/mL per il modello di cella PTOA
ImmagineJ	NIH, Stati Uniti	Versione 1.48v	Analisi delle immagini
Software Image-Pro Plus	Cibernetica dei media	Versione 6.0	Analisi quantitativa dell'andatura da impronte scansionate
Isoflurano	Shanghai Yaji Biologico	YS1412C	Anestesia per chirurgia animale
Centro di inclusione Leica	Leica Microsystems	EG1160	Inclusione di paraffina
Microtomo Leica	Leica Microsystems	Codice: RM2235	Sezionamento di tessuti inclusi in paraffina
Bagno d'acqua Leica	Leica Microsystems	HI1210	Sezioni di paraffina galleggianti
Microscopio ottico (ECLIPSE Ti2-E)	Nikon, Giappone	N/A	Osservazione istologica
Scanner Micro-CT (ZKKS-MCT-Sharp)	Produttore nazionale, Cina	N/A	Imaging osseo
Anticorpo secondario Topo-HRP	Tecnologia di segnalazione cellulare (CST), Stati Uniti	7076	Diluizione 1:2000
NIS-Elements Imaging Software	Nikon	N/A	Acquisizione e analisi di immagini al microscopio
Software NRecon	Bruker, Germania	Versione 1.6	Ricostruzione TC
Acido palmitico (PA)	Sigma Aldrich, Stati Uniti	P0500	500 & micro; Stock M per modello di cella FD
Cera di paraffina per sezionamento, grado patologico, punto di fusione 52-54 ° C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258797-500 g	Utilizzato per l'inclusione di paraffina durante la lavorazione dei tessuti
Cera di paraffina per sezionamento, grado patologico, punto di fusione 56-58 ° C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258799-500 g	Utilizzato per l'inclusione finale di cera dura nel sezionamento dei tessuti
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)	Gibco / Thermo Fisher	C10010500BT	Lavaggio cellulare e risciacquo dei tessuti
Penicillina-Streptomicina	Corning, Stati Uniti	N/A	1% per le colture cellulari
Membrana PVDF (0,45 & micro; m)	Millipore, Stati Uniti	IPVH00010	Membrana Western blot
Anticorpo secondario Rabbit-HRP	Tecnologia di segnalazione cellulare (CST), Stati Uniti	7074	Diluizione 1:2000
Inchiostro rosso	EROE	EROE 204	Tracciamento dell'impronta nell'analisi dell'andatura
Tampone di lisi RIPA	Keygen, Cina	N/A	Estrazione delle proteine
Safranin O– Kit di colorazione verde veloce	Servicebio, Wuhan	G1053	Colorazione istologica
Micrometro a spirale (calibro a corsoio)	Huangshan, Cina	N/A	Misurazione della larghezza del giunto
Software per analisi ossea subcondrale (CTAn)	Bruker, Germania	Versioni 1.9 e 4.1	Analisi morfometrica
SYBR Green PCR Master Mix	AG Scientific, Cina	N/A	Analisi qPCR
Reagenti Western blot (tampone RIPA, componenti in gel SDS-PAGE, tampone di caricamento, TBST, ecc.)	Beyotime Biotechnology (Cina)	N/D (utilizzato come voce di gruppo)	Tutti i reagenti di routine utilizzati per le procedure di Western blotting
Xilene	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	CAS: 1330-20-7	Pulizia dei tessuti