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Articolo metodologico

Ibridazione in situ dell'RNA con immunofluorescenza sequenziale delle proteine nel saggio tandem

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DOI:

10.3791/68615

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10 ottobre 2025

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1Department of Hematopoietic Biology & Malignancy, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Melanoma Medical Oncology Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 5Department of Veterinary Medicine & Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive in dettaglio l'ibridazione dell'RNA in situ con immunofluorescenza proteica sequenziale nei tessuti su una piattaforma automatizzata per caratterizzare le omiche multiple spaziali mirate a livello cellulare.

Abstract

La funzionalità delle celle all'interno di un ospite non dipende da segnali isolati. Invece, tutti i componenti, dalle più piccole molecole di RNA alle più grandi proteine, devono operare in armonia e coordinazione all'interno del corpo umano. Pertanto, l'importanza di approcci che integrino indagini spaziali a livello cellulare su più omicie è fondamentale per comprendere le interazioni cellula-cellula e la progressione della malattia. Sezionare il proteoma e il trascrittoma nello stesso saggio spaziale ci aiuta a capire come non solo ciò che una cellula viene istruita a eseguire (RNA), ma anche come esegue tali istruzioni nel contesto della nicchia microambientale in cui si trova (proteina). Questo manoscritto è focalizzato sull'integrazione dell'immunofluorescenza sequenziale (SeqIF) con l'ibridazione in situ dell'RNA (ISH) con un sistema guidato dalla microfluidica sui tessuti per l'indagine di proteine e RNA ad alto rendimento in un contesto spaziale (seqRNA-ISH+seqIF) che consentirà fino a 12 RNA e 24 bersagli proteici in una singola corsa con ulteriori bersagli proteici possibili da aggiungere tramite corse sequenziali. Questo metodo fornisce una piattaforma multiomica sequenziale mirata che non richiede la considerazione della compatibilità con i fluorofori e un'ampia ottimizzazione per un plexing più elevato. Ciò consente di capire quali messaggi la cellula sta innescando o sta inviando nel suo microambiente. Questo approccio mirato aiuta a convalidare i metodi dell'intero trascrittoma, esaminando le interazioni tra l'RNA e le proteine in modo più preciso.

Introduzione

Il complesso funzionamento delle cellule all'interno del corpo umano si basa su un'intricata interazione di segnali, dalle piccole molecole di RNA alle grandi proteine, che lavorano tutti in coordinazione1. Questa interazione sottolinea l'importanza di approcci integrativi che esaminano le interazioni spaziali a livello cellulare attraverso vari strati omici 2,3. Tali metodologie sono essenziali per comprendere la complessità delle interazioni cellula-cellula e la progressione della malattia. Molti metodi tradizionali, come la citometria a flusso4 e il sequenziamento a singola cellula5, gli isolati cellulari vengono utilizzati per studiare campioni disaggregati per identificare i rapporti di massa dei fenotipi presenti all'interno di un campione specifico. Tuttavia, l'isolamento delle cellule per l'analisi può indurre l'attivazione o cambiamenti fenotipici che potrebbero non riflettere accuratamente la loro biologia e funzione nativa in situ6. I metodi avanzati in biologia spaziale offrono nuove strategie per studiare le cellule e il loro microambiente senza compromettere il contesto dell'architettura tissutale e le relazioni spaziali con le cellule vicine in più tipi molecolari 2,7.

L'integrazione delle analisi del trascrittoma e del proteoma all'interno dello stesso saggio spaziale, senza isolare le singole cellule, offre una visione completa della funzione cellulare8. Questo metodo si basa sui metodi di ibridazione insitu fluorescente a RNA a singola molecola (FISH), ma non include le digestioni delle proteinasi che complicano le interrogazioni sequenzialidelle proteine 8. La flessibilità dell'approccio da utilizzare su una singola sezione fornisce una risoluzione spaziale più elevata e una minore elaborazione delle immagini per integrare e allineare le sezioni. Questo approccio fornisce informazioni sia sulle istruzioni ricevute da una cellula (RNA) che sulla loro esecuzione (proteina) all'interno della sua specifica nicchia microambientale. Combinando questi strati di informazioni, i ricercatori possono ottenere informazioni più approfondite sul comportamento e sulla comunicazione cellulare.

Sebbene esistano metodi manuali, i recenti progressi nelle tecnologie omiche spaziali hanno consentito analisi più complesse con un numero maggiore di marcatori proteomici esaminati utilizzando il multiplexing manuale9. Questi approcci hanno incluso l'avanzamento sia nei saggi proteici che in quelli RNA-ISH 10,11,12,13,14 e metodologie automatizzate che richiedono anticorpi coniugati specifici del sistema 15,16,17, citometria di massa per imaging (IMC)18,19,20 e altre metodologie proteomiche sequenziali fluorescenti automatizzate che utilizzano antiboedie primarie e secondarie standard 2,21,22. Queste tecnologie hanno facilitato la proteomica o la trascrittomica e la proteomica combinate utilizzando approcci mirati e di solito visualizzano sia l'RNA tramite sonde che le proteine tramite anticorpi basati su coniugati simili, consentendo di co-rilevare RNA e proteine simultaneamente o sequenziali utilizzando la stessa metodologia o strumenti. Fornendo una visione completa dell'attività cellulare, questi tipi di approcci mirano a migliorare la nostra comprensione della comunicazione cellulare tra le cellule e il loro microambiente. Offre uno strumento prezioso per decifrare le complessità dell'interazione cellulare, rivelando potenzialmente nuove intuizioni sui normali processi fisiologici e sui meccanismi della malattia.

Questo protocollo fornisce una guida per l'integrazione dell'ibridazione in situ dell'RNA (ISH) con immunofluorescenza sequenziale (SeqIF) con un sistema guidato dalla microfluidica sui tessuti. Ciò fornisce uno strumento ad alto rendimento per lo studio dell'RNA e delle proteine nel loro contesto spaziale nativo. Questo metodo (seqRNA-ISH+seqIF) consentirà fino a 12 RNA e 24 bersagli proteici in una singola corsa, con la possibilità di aggiungere ulteriori bersagli proteici tramite esecuzioni sequenziali. Sebbene questo protocollo si concentri su uno specifico sistema microfluidico, le linee guida per la manipolazione dei tessuti, la garanzia della qualità dell'RNA e la selezione e la titolazione degli anticorpi possono essere adattate ad altre metodologie. Tuttavia, questo metodo utilizza il recupero dell'antigene a pH 9.0 per un recupero efficiente e privo di proteasi degli epitopi, migliorando la stabilità della proteomica e fornendo alcune trascrittomiche mirate, a differenza del tradizionale RNA-ISH a pH 6.0 con proteasi per aumentare l'accessibilità della sonda RNA ma non riesce a preservare il proteoma8. Il metodo seqRNA-ISH+seqIF è delineato visivamente nella Figura 1, dimostrando l'amplificazione dell'RNA FISH seguita dalla scissione prima di utilizzare un metodo di accoppiamento di anticorpi primario-secondario che utilizza una delicata rimozione chimica di primari e secondari. La natura sequenziale del seqIF e del rilevamento supera molte delle limitazioni relative alla compatibilità con i fluorofori utilizzando metodologie sequenziali23. Ciò riduce la necessità di un'ampia ottimizzazione necessaria nella colorazione simultanea in metodologie ad alto plex che richiedono la compensazione della sovrapposizione spettrale23.

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Protocollo

Questo protocollo utilizza sezioni di tessuto FFPE (formaline-fixed-paraffin-embedded) raccolte da pazienti con carcinoma ovarico sieroso di alto grado naïve al trattamento sottoposte a chirurgia citoriduttiva primaria. Tutti i dati clinici sono stati ottenuti dall'archivio del cancro ovarico del Dipartimento di Oncologia Ginecologica e Medicina Riproduttiva secondo i protocolli approvati dall'Institutional Review Board dell'Università del Texas MD Anderson. Il consenso informato scritto dei pazienti è stato ottenuto dal personale della reception e gli studi sono stati condotti in conformità con le linee guida etiche riconosciute.

NOTA: Tutti i reagenti, se non diversamente specificato, sono diluiti in acqua deionizzata priva di nucleasi.

1. Correggere e incorporare i campioni

NOTA: La scelta del fissativo e della durata della fissazione influisce fortemente sulle prestazioni dei saggi e, in generale, i saggi spaziali vengono spesso eseguiti con FFPE in quanto preserva l'architettura patologica. Questo protocollo delinea l'uso del tessuto FFPE, pertanto il seguente protocollo è suggerito per i campioni di tessuto FFPE. Tuttavia, la qualità dell'RNA è influenzata dai processi di fissazione, così come gli epitopi proteici, ma in misura minore. Questi metodi di fissazione, la fissazione incompleta e la degradazione del campione possono aumentare il legame non specifico nella proteomica basata su anticorpi. In terzo luogo, la fluorescenza costitutiva viene tipicamente spenta durante l'elaborazione FFPE, ma alcuni fluorofori persistono moderatamente e richiedono test per assicurarsi che siano estinti.

  1. Sezionare il tessuto a uno spessore di ≤ 5 mm per garantire una fissazione uniforme e prevenire le barriere di diffusione indotte dal grasso. Fissare immediatamente le sezioni in formalina tamponata con fosfato al 10% (pH 7,0) a 4 °C per 24 ore per ottimizzare l'RNA e la proteina24.
  2. Processare i tessuti fissati in un processatore di tessuti o elaborati manualmente utilizzando i seguenti passaggi
    1. Disidratare sezioni di tessuto in etanolo di grado molecolare in acqua priva di nucleasi da (70%, 75%, 95% 2x, 100% 3x per 1 ora ciascuna).
    2. Quindi, immergere il fazzoletto in xilene 2 volte per 1 ora ciascuna a temperatura ambiente (~23 °C).
  3. Riscaldare la cera di paraffina a 60 °C. Immergere la scatola di fazzoletti nella cera di paraffina per 2 volte per 1 ora ciascuna.
  4. Posizionare il fazzoletto gonfiato e orientare i fazzoletti nello stampo, riempire con cera di paraffina fresca e raffreddare rapidamente a 4 °C25.
    NOTA: I migliori risultati per l'RNA si otterranno completando tutti i passaggi entro 48 ore.

2. Valutazione della qualità dell'RNA

  1. Utilizzare tre sezioni seriali, eseguendo tutte e tre le diapositive in parallelo o eseguendo le diapositive di controllo prima del pannello di destinazione per garantire che il blocco sia sufficiente. Le sonde di controllo positivo accoppiate prendono di mira i geni di housekeeping per valutare la qualità dei tessuti e l'integrità spaziale in tutto il tessuto, che può essere influenzata dalle differenze di perseveranza. I controlli comunemente usati includono UBC (un gene ad alta espressione), PPIB (espressione moderata) e POLR2A (bassa espressione)26. Utilizzare set di sonde di controllo negativo, come Dab1 (un RNA di batteri del suolo) su ciascun canale di rilevamento. Facoltativamente, includere tutte le sonde di controllo positive e negative sullo stesso campione insieme alle sonde target. In questa configurazione, posizionare i controlli negativi Dab1 nei canali T2-T4, assegnare i controlli positivi dall'espressione più bassa a quella più alta a T1, T5 e T9 e assicurarsi che le sonde target occupino i canali rimanenti.
    OPZIONALE: Inoltre, per campioni con qualità di RNA sconosciuta, può essere utile determinare un valore di distribuzione 200 (punteggio DV200). Si consigliano punteggi DV200 superiori a 30, con campioni di qualità superiore a 50 o superiori preferiti27. Questo punteggio è un'indicazione della qualità dell'RNA e una maggiore qualità del campione aumenta la probabilità che l'RNA-ISH funzioni in modo efficace27.

3. Precauzioni e preparazioni dell'RNA

NOTA: È buona norma decontaminare l'area delle RNasi e pulirla e quindi spruzzare l'area di lavoro con etanolo al 70% prima della lavorazione, oltre a utilizzare un'area priva di RNasi, indossare sempre guanti puliti, un camice da laboratorio e una maschera per ridurre al minimo l'introduzione di RNasi dalla pelle o dal respiro. Utilizzare solo acqua e materiali di consumo privi di RNasi ed evitare di toccare i sacchetti di alimentazione. Queste precauzioni, oltre a mantenere i tessuti/vetrini freschi e asciutti, sono essenziali per mantenere l'integrità dell'RNA durante gli esperimenti.

  1. Tagliare le sezioni su vetrini caricati positivamente con un microtomo e posizionare la regione di interesse al centro del vetrino, che si coordina con l'area di imaging (varia a seconda del sistema; qui, è di circa 12,5 mm x 12,5 mm).
    NOTA: Tenere presente che lo spessore ideale per ogni sezione è compreso tra 4-6 μm per i tessuti FFPE.
  2. Cuocere i vetrini FFPE in un forno asciutto e privo di RNAsi, con il tessuto rivolto verso l'alto, a 60 °C per un minimo di 1 ora e fino a una notte per i tessuti adiposi o altrimenti soggetti a distacco.
  3. Pretrattamento FACOLTATIVO
    NOTA: Sebbene il pretrattamento sia facoltativo, alcuni passaggi sono inoltre facoltativi come descritto di seguito.
    1. Preparare il perossido di idrogeno al 3%: in una provetta conica da 50 mL, aggiungere 5 mL di perossido di idrogeno al 30% a 45 mL di 1x PBS. Conservare il perossido di idrogeno rimanente a temperatura ambiente (~23 °C), con il coperchio fissato con parafilm, per un massimo di tre mesi.
      NOTA: Il perossido di idrogeno è un forte ossidante. Tenere lontano da materiali combustibili, fonti di calore e metalli. Utilizzare in un'area della cappa chimica con dispositivi di protezione individuale (DPI; ad es. occhiali, guanti e camice da laboratorio). Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e l'inalazione. Sciacquare la pelle con acqua per 15 minuti se esposta. Consultare un medico in caso di ingestione o inalazione. Concentrazioni più elevate possono causare gravi ustioni e possono incendiarsi o esplodere con materiali organici o determinati metalli. Aggiungere sempre perossido di idrogeno all'acqua per evitare reazioni violente.
    2. Preparare il 3,7% di formaldeide: in una cappa chimica, aggiungere 1 mL di formaldeide al 16% per 3,3 mL di 1x PBS. Conservare la formaldeide avvolta con parafilm per un massimo di tre mesi.
      NOTA: La formaldeide può causare gravi danni agli occhi, irritazione respiratoria ed è sospettata di causare il cancro. L'esposizione prolungata o ripetuta può portare a sensibilizzazione cutanea e reazioni allergiche. Utilizzare solo in una cappa chimica e indossare DPI adeguati (guanti, occhiali/visiera, maschera, camice da laboratorio, ecc.). Evitare il contatto con la pelle, il contatto con gli occhi e l'inalazione. Tenere lontano da fonti di calore e fiamme libere. Smaltire la paraformaldeide e i materiali contaminati come rifiuti pericolosi e, se possibile, preparare solo la quantità necessaria per l'uso immediato.
    3. Deparaffinare lavando il vetrino di tessuto ponendolo in provette coniche da 50 mL contenenti: Xilene (40 mL) per 3 lavaggi a 5 minuti ciascuno in una cappa chimica.
      OPZIONALE: Al posto dello xilene, è possibile utilizzare un agente di pulizia istologica a base non xilene, ma potenzialmente lascerà residui di paraffina e influirà sulla qualità dell'immagine. Ciò comporta l'inserimento delle fette in provette coniche da 50 mL contenenti quanto segue: Agente di pulizia istologica a base non xilenica (40 mL) per due lavaggi a 15 minuti ciascuno. Le sezioni dei blocchi realizzati con cera d'api possono essere difficili da decerare con non xilene. Per miscele di cera/paraffina sconosciute, si consiglia di utilizzare lo xilene con le corrette precauzioni di sicurezza. Lo xilene è una sostanza pericolosa e infiammabile e l'esposizione prolungata può causare danni al sistema nervoso centrale, al fegato e ai reni. Utilizzare solo in una cappa chimica e indossare DPI (ad es. guanti, maschere e camici da laboratorio). Smaltire lo xilene e i materiali contaminati come rifiuti pericolosi. In caso di esposizione, consultare immediatamente un medico.
    4. Reidratare lavando il vetrino di tessuto mettendolo in una provetta conica da 50 ml contenente quanto segue: 100% etanolo (40 ml) per 2 lavaggi da 3 minuti ciascuno; etanolo al 95% (40 mL) per 2 lavaggi a 3 minuti ciascuno; etanolo al 70% (40 mL) per 2 lavaggi a 3 minuti ciascuno; etanolo al 50% (40 mL), per 2 lavaggi da 3 minuti ciascuno; 30% di etanolo (40 mL) per 2 lavaggi a 3 minuti ciascuno; 1x lavaggio PBS (40 mL) per 1 lavaggio a 2 min.
    5. Bloccare il tessuto con perossidasi mettendolo in una camera di umidità a temperatura ambiente (~23 °C) e coprendo il tessuto con circa 100-200 μL di perossido di idrogeno al 3%, per 1 lavaggio a 10 minuti, quindi lavare il fazzoletto con 1x lavaggio PBS (40 mL), per 2 lavaggi a 2 minuti ciascuno.
      NOTA: Il blocco della perossidasi è facoltativo e spegne gli enzimi perossidasi residui nei tessuti per ridurre la colorazione aspecifica e può ridurre l'autofluorescenza tissutale. Ciò è particolarmente importante per i tessuti con elevata autofluorescenza, come il midollo osseo, i reni, il fegato, il polmone, l'intestino e il cervello, dove forti segnali di fondo possono interferire con l'imaging nelle bande di emissione TRITC e FITC 28,29,30,31,32.
    6. Eseguire la fissazione della formaldeide posizionando il tessuto in una camera di umidità a temperatura ambiente e coprendo il tessuto con circa 100-200 μL di formaldeide al 3,7%, per 1 lavaggio a 10 minuti, quindi lavare il tessuto con 1 lavaggio PBS (40 mL), per 2 lavaggi a 2 minuti ciascuno.
      NOTA: Questo passaggio è facoltativo ma consigliato per tessuti ad alto contenuto di grasso o altri tessuti che hanno problemi ad aderire ai vetrini.

4. Recupero dell'antigene

NOTA: Il metodo di deceratura e recupero dell'antigene raccomandato e descritto qui differisce dal metodo raccomandato per seqRNA-ISH+seqIF dal produttore, che utilizza un dispositivo di recupero dell'antigene a calore controllato di grande capacità.

  1. Recupero dell'antigene indotto dal calore (HEIR) utilizzando le microonde
    1. Utilizzando un forno a microonde a temperatura monitorata, aggiungere una quantità sufficiente di soluzione tampone HEIR pH 9,0 disponibile in commercio (circa 250 ml) per coprire i vetrini nel supporto per vetrini sotto il termometro, se applicabile.
      NOTA: Il recupero dell'antigene per l'RNA viene in genere eseguito a pH 6,0, tuttavia le seguenti metodologie sono per pH 9,0 per una maggiore efficienza del legame anticorpale.
  2. Inserire i vetrini in soluzione tampone nel microonde e controbilanciare eventuali camere vuote, se applicabile, con acqua distillata doppia. Il calore scorre nel microonde per 15 minuti a 107 °C (il tempo totale è solitamente di 30 minuti per il tampone HEIR per raggiungere la temperatura).
  3. Raffreddare i vetrini mettendoli sotto una cappa chimica a temperatura ambiente per circa 20 minuti.
  4. Lavare i vetrini in 1x PBS in una provetta conica da 50 mL (40 mL), per 1 lavaggio per 2 min.
  5. Conservare i vetrini in una busta per vetrini con tappo a vite o in una provetta conica da 50 mL riempita con 1x PBS (o un tampone multicolorante commerciale) e procedere immediatamente, oppure conservare a 4 °C per un massimo di 7 giorni, ma idealmente meno di 72 ore prima di procedere con seqRNA-ISH+seqIF.

5. Preparare le soluzioni stock

  1. Preparare un tampone di imaging dell'RNA 40x
    1. Preparare il tampone per l'imaging dell'RNA 40x combinando 400 mg di tampone per l'imaging dell'RNA in polvere e 25 mL di acqua deionizzata priva di nucleasi
    2. Agitare la soluzione risultante fino a completa dissoluzione e successivamente aliquotare in provette per microcentrifuga da 1,5 mL (1 mL per provetta)
    3. Congelare e conservare a -20 °C per un massimo di tre mesi, evitando cicli di gelo-disgelo.
  2. Preparare 20 tamponi salino-sodio citrato (SSC)
    1. Sciogliere 157,3 g di cloruro di sodio (NaCl) e 88,2 g di citrato di sodio (Na3C6H5O7) in 800 mL di acqua deionizzata priva di nucleasi.
    2. Misurare il pH e titolarlo a pH 7,0 goccia per goccia con acido cloridrico (HCl) 1 M.
    3. Autoclave per sterilizzare.
      NOTA: L'SSC sterile 20x può essere acquistato anche da diverse aziende. Dopo l'apertura, conservare a temperatura ambiente a 4 °C.
    4. Preparare 4 tamponi SSC combinando 1 mL di 20x SSC stock con 4 mL di acqua deionizzata priva di nucleasi

6. RNA-ISH sequenziale + immunofluorescenza sequenziale

NOTA: Tutti i passaggi descritti nel presente documento sono adattati dal protocollo del produttore per il seqRNA-ISH+seqIF delineato nella Tabella dei materiali, in quanto tale la maggior parte dei reagenti è identificata come reagenti commerciali compatibili con il sistema. Questi reagenti sono identificati e/o forniti dal produttore e progettati per essere compatibili con il sistema. Le modifiche sono possibili e delineate nella discussione, ma potrebbero richiedere ulteriori test e lavaggio fluidico per prevenire l'accumulo. Il software calcolerà il volume totale di reagenti necessari dopo che il pannello e il protocollo sono stati progettati e inseriti. Tuttavia, vengono presentate le modifiche consigliate. Il volume totale varierà sempre in base al numero di cicli e destinazioni utilizzati per protocollo. Tuttavia, le diluizioni di anticorpi e RNA-ISH non saranno calcolate dal sistema a meno che ogni singola combinazione non venga inserita come elemento univoco nel database. Per questo protocollo, sono necessari 400 uL di cocktail di anticorpi per vetrino campione.

  1. Preparazione del sistema
    1. Prima di seqRNA-ISH+seqIF, sciacquare accuratamente tutta la microfluidica con acqua priva di nucleasi.
    2. Spruzzare all'esterno del sistema con una soluzione di decontaminazione a base di RNAsi, seguita da etanolo al 70%.
  2. Preparare i reagenti generali
    1. Tampone di lavaggio: 50 mL di tampone multicolorante 20x compatibile con il sistema, commerciale, + 950 mL di acqua deionizzata priva di nucleasi
    2. Acqua: 100 ml di acqua deionizzata priva di nucleasi.
    3. Etanolo: 100 ml di etanolo al 70%.
    4. Tampone di imaging: 16 mL di soluzione di imaging commerciale compatibile con il sistema 10x + 140 mL di acqua deionizzata priva di nucleasi + 4 mL di stock di imaging commerciale compatibile con il sistema.
    5. Buffer di eluizione: 152 di sistema compatibile, commerciale, soluzione di eluizione 1 + 8 di sistema compatibile, commerciale, soluzione di eluizione 2
    6. Tampone di spegnimento: 130 mL di acqua deionizzata priva di nucleasi + 14 mL di soluzione di estinzione 1 compatibile con il sistema, commerciale + 16 mL di soluzione di estinzione 2 compatibile con il sistema.
  3. Preparare i reagenti di colorazione per il protocollo RNA-ISH
    NOTA: Questo passaggio può essere completato la sera prima e conservato a 4 °C al buio. Sebbene le raccomandazioni del produttore affermino che le sonde raggruppate possono essere utilizzate fino a un anno, non è consigliabile raggruppare le sonde con più di una settimana di anticipo a causa di problemi di contaminazione. Per le sonde, è meglio picchiettare o pipettare delicatamente su e giù per mescolare e centrifugarle delicatamente per farle girare prima dell'uso.
    1. Soluzione di permeabilizzazione compatibile con il sistema, commerciale, priva di proteinasi a 500 μl per vetrino in una provetta per microcentrifuga compatibile con il sistema.
    2. Pool RNA-ISH Amplificatori basati sul ciclo (Tabella 1) per un totale di 500 μL per vetrino per ciascuno dei seguenti in una provetta per microcentrifuga compatibile con il sistema: i) alberi di coda ZZ per le code da T1 a T4, ii) alberi di coda ZZ per le code da T5 a T8, iii) alberi di coda ZZ per le code da T9 a T 12.
    3. Fluorofori specifici per l'albero della coda della piscina, adattamento dell'amplificatore, per un totale di 500 μl per vetrino per ciascuno dei seguenti in una provetta per microcentrifuga compatibile con il sistema: i) Fluoroforo per l'albero da T1 a T4, ii) Fluoroforo per l'albero da T5 a T8, iii) Fluoroforo per T9 a T 12.
      NOTA: Questo passaggio è sensibile alla luce
    4. Preparare 1 mL di una diluizione 1:200 di DAPI commerciale (concentrazione madre di 1 mg/mL) in tampone multicolorante commerciale a base di acqua deionizzata priva di nucleasi per vetrino
      NOTA: La procedura è stata eseguita secondo il produttore, che include DAPI come parte dei reagenti standard. Se si utilizzano formulazioni personalizzate di DAPI diluite in N,N-dimetilformammide (DMF), le diluizioni possono variare e sarà necessario condurre test di titolazione. Tuttavia, si raccomanda di utilizzare una concentrazione intorno a 1:1000-1:2000 di una concentrazione madre di 1 mg/mL. In genere, questo si verifica a una concentrazione superiore al normale rispetto ai protocolli di colorazione manuale, poiché deve durare attraverso più cicli di imaging e stripping. Le formulazioni DAPI fresche in DMF tendono ad essere più brillanti delle formulazioni DAPI disponibili in commercio. I reagenti con formammide, come il DAPI, devono essere assegnati sotto una cappa chimica. La formamide può causare tossicità riproduttiva e danni agli organi ed è sospettata di essere cancerogena. Utilizzare DPI appropriati (ad es. guanti e camice da laboratorio).
    5. Preparare il tampone di imaging RNA-ISH immediatamente prima dell'uso con 12,125 acqua deionizzata priva di nucleasi, 1,5 mL di tampone di imaging 10x Stock B e 275 μL di 40x Imaging Buffer Stock A (scongelato o appena fatto)
    6. Preparare fino a 10 coppie di anticorpi primari (gli anticorpi proteici primari sono descritti nella Tabella 2) per seqIF in base alle diluizioni testate per titolazione in tampone multicolorante commerciale per un totale di 400 μl per vetrino in una provetta per microcentrifuga compatibile con il sistema. Assicurarsi che ogni ciclo di seqIF contenga un solo anticorpo primario per specie ospite.
    7. Preparare i fluorofori secondari (Tabella 3) più DAPI secondo le combinazioni di anticorpi primari al punto 6.3.7 per seqIF secondo le diluizioni testate per titolazione. Diluire in tampone multicolorazione per un totale di 400 μl per ciclo in una provetta conica da 50 mL con un volume morto minimo di 1 mL. Le concentrazioni esemplificative per gli anticorpi secondari Alexa Fluor e DAPI sono le seguenti: diluizione 1:200 per Alexa Fluor 555, diluizione 1:400 per Alexa Fluor 647, diluizione 1:1800 per DAPI (da 1 mg/mL DAPI in DMF)
      NOTA: Questo passaggio è sensibile alla luce. L'aggiunta di DAPI ai database secondari non è conforme al protocollo del produttore, in quanto può aiutare a mantenere l'espressione DAPI durante più cicli di seqIF, il che aiuta ad allineare le immagini dopo l'esecuzione. La maggior parte dei software di elaborazione delle immagini, come quello incluso in questo sistema, utilizza il segnale DAPI per confermare l'allineamento dell'imaging ciclico per la colocalizzazione fluorescente.

7. Funzionamento del sistema

  1. Eseguire il sistema secondo le istruzioni del produttore, i tempi di esecuzione approssimativi per due vetrini su un seqRNA-ISH a 12 plessi con un seqIF proteico a 20 plessi sono di 48 ore per una finestra di imaging di 12,5 cm x 12,5 cm.
  2. Al termine dell'esecuzione di seqRNA-ISH+seqIF, il vetrino può essere rimosso e conservato in 1x PBS o immediatamente utilizzato per ulteriori seqIF (per un massimo di 40 proteine).
    NOTA: È importante pulire e lavare la microfluidica del sistema utilizzando acqua priva di nucleasi prima e dopo ogni corsa per ridurre il potenziale di contaminazione.

8. FACOLTATIVO: Analisi di immagini e statistiche

  1. Procedere con l'analisi delle immagini e delle statistiche tramite strumenti di analisi delle immagini o di analisi patologica.

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Risultati

Come esempio di questo metodo, abbiamo eseguito il seguente seqRNA-ISH (Tabella 1) + SeqIF (Tabella 2 e Tabella 3) su due vetrini di un carcinoma ovarico sieroso umano di alto grado.

La Figura 2 illustra la sovrapposizione di seqRNA-ISH+seqIF su un campione di tessuto tumorale ovarico. I marcatori proteici strutturali come il collagene 1 vengono utilizzati per identificare le regioni tumorali, mentre i marcatori f...

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Discussione

La fase più critica nella preparazione e nella manipolazione dei campioni è la riduzione della contaminazione da RNAsi. Ciò può essere ottenuto utilizzando maschere per prevenire la contaminazione dal respiro e pulendo le superfici di lavoro con una soluzione di decontaminazione a base di RNasi e etanolo al 70% prodotto con acqua priva di nucleasi. Per i vetrini FFPE, è meglio tagliare più vetrini adiacenti dai blocchi FFPE per seqRNA-ISH+seqIF e conservarli a 4 °C con essiccante. Per il...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata in parte dall'Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 e 891490), dalla Sie Foundation e dallo Stephanie C. Stelter Endowment Fund. Questa ricerca è stata eseguita in collaborazione con la Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, che è supportata in parte dal National Institutes of Health attraverso il Cancer Center Support Grant P30 CA016672 di MD Anderson e lo specialista di ricerca NCI 1 R50 CA243707-01A1 di Jared Burks.

Vorremmo anche ringraziare Emily Martersteck di Lunaphore per l'assistenza tecnica e la formazione.

Gli autori hanno ricevuto una serie di sonde mirate e di controllo RNAScope come parte di un programma di accesso anticipato da Bio-Techne a un prezzo scontato e alcuni reagenti sono stati forniti gratuitamente per l'uso in questo studio. Il produttore non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati o nella preparazione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenEN62248 / 62248Per la colorazione nucleare (prodotto utilizzato durante questo studio, 62247 è stato interrotto)
Provette da centrifuga sterili coniche in polipropilene da 50 mlThermo Fisher Scientifico339652Utilizzato per aliquote & soluzioni secondarie miste
Alcool isopropanolo sterile al 70%Salvietta texanaMotore TX3270Per la decontaminazione delle superfici
AnticorpiDiversoDiversoUtilizzato per i target primari, varia in base al canale utilizzato
APOE - Host: Mouse, Clone: 960318R& DMAB41443-100(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
aSMA - Host: Mouse, Clone: 1A4CSTCodice 69319SF(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
Microtomo a taglio automaticoLeica14051956472Sezionamento di tessuti
CD10 - Ospite: Coniglio, Clone: E5P7SCSTCodice 65534S(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
CD11c - Ospite: Coniglio, Clone: D3V1ECST93233SF(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
CD163 - Ospite: Coniglio, Clone: D6U1JCST93498S(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
CD163 - Ospite: Coniglio, Clone: ja51-30InvitrogenMA5-32684(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
CD20 - Host: Mouse, Clone: L26DietilicoA500-017ACF(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
CD31 - Host: Mouse, Clone: 3F8E2ProteinTech66065-2-Ig(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
CD33 - Ospite: Coniglio, Clone: BLR061GDietilicoA700-061CF(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
CD4 - Ospite: Coniglio, Clone: EPR6855Abcamab181724(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
CD45 - Ospite: Coniglio, Clone: BL-178-12C7DietilicoA700-012(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
CD45RO - Host: Mouse, Clone: UCHL1DietilicoA500-020ACF(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
CD56 - Ospite: Coniglio, Clone: BLR152JDietilico99746(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
CD66b - Ospite: Coniglio, Clone: BLR111HInvitrogenMA5-44413(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
CD68 - Host: Mouse, Clone: KP-1Bioleggenda916104(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
CD8 - Host: Mouse, Clone: C8/144BBioleggenda372902(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
CD86 - Ospite: Coniglio, Clone: E2G8PCSTCodice: 76755SF(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
Col 1A1 - Host: Mouse, Clone: E3E1XCSTCodice 66948S(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
Provette DNA LoBind 2mLEppendorf22431048Utilizzato per soluzioni di sonde a RNA miste
Drierite 21005 Essiccante indicanteCole-Palmer21005Essiccante per essiccatore
Lame per microtomo Edge-RiteThermo Fisher Scientific / Invitrogen4280LIstologia - Utilizzato durante il sezionamento dei campioni
Alcool etilico 100% (200 proof)Pharmco111000200Per deparaffinazione
EZ-AR2 Tampone EleganceBioGeneXHK547-XAKUtilizzato per il recupero dell'antigene di sezioni di tessuto FFPE
FOXP3 - Ospite: Coniglio, Clone: PoliclonaleDietilicoA700-034CF(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
Capra anti-Topo IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21425(nota: specifico per questo studio) Anticorpo secondario adsorbito incrociato F(ab')2-capra anti-IgG di topo (H+L), Alexa Fluor™ 555
Capra anti-Topo IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-48289/A-21237(nota: specifico per questo studio) Anticorpo secondario adsorbito incrociato F(ab')2-capra anti-IgG di topo (H+L), Alexa Fluor™ Più 647
Capra anti-Coniglio IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21430(nota: specifico per questo studio) Anticorpo secondario adsorbito incrociato F(ab')2-capra anti-coniglio IgG (H+L), Alexa Fluor™ 555
Capra anti-Coniglio IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenCodice A-21246(nota: specifico per questo studio) Anticorpo secondario adsorbito incrociato F(ab')2-capra anti-coniglio IgG (H+L), Alexa Fluor™ 647
GZMB - Ospite: Coniglio, Clone: PoliclonaleProteinTech13588-1-AP(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
Hs-POLR2A-T1ACD BiotechneCodice 310457-T1Sonda umana a bassa espressione
Hs-PPIB-T5ACD BiotechneCodice 313907-T5Controllo della sonda a media espressione umana
Hs-UBC-T9ACD BiotechneCodice 310047-T9Controllo umano ad alta espressione
Soluzione di perossido di idrogeno 30%Sigma-AldrichHX0640-5Per la preparazione dei tessuti. Aiuta a bloccare l'attività endogena della perossidasi e a produrre prodotti altamente colorati. Per fare una soluzione di perossido di idrogeno al 3%
Ker8/18 - Host: Mouse, Clone: PoliclonaleProteinTech66187-1-PBS(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
LRP5 - Ospite: Coniglio, Clone: HPA030505SigmaHPA030505-100UL(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
Lunaphore 20x Multistaining BufferBio-TecnologieBU06Utilizzato come diluente e per lavaggi per il COMET
Lunaphore COMET ChipBio-TecnologieMK03chip mcirofluidics per strumento COMET
Lunaphore COMETBio-TecnologieCM10-SAutocolorante Seq-IF
Kit tampone di eluizione LunaphoreBio-TecnologieBU07-LSoluzione 1 & Soluzione 2 per le fasi di eluizione del COMET
Kit tampone per imaging LunaphoreBio-TecnologieBU09Soluto & Solvente utilizzato per l'imaging durante l'esecuzione COMET
Tamponi di tempra LunaphoreBio-TecnologieBU08-LSoluzione 1 & Soluzione 2 per le fasi di tempra del COMET
MicropipettaDiversoN/Aper preparazione di reagenti
Periostina - Ospite: Topo, Clone: 1A11A3ProteinTech66491-1-PBS(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
Pierce 16% Formaldeide (p/v), senza metanoloThermo Fisher Scientifico28908Per produrre il 3,7% di PFA per la preparazione dei tessuti
Ingresso 320102 sonda (canale T2)ACD Biotechne300040Controllo negativo DapB in T2
Ingresso 320102 sonda (canale T3)ACD Biotechne300040Controllo negativo DapB in T3
Ingresso 320102 sonda (canale T4)ACD Biotechne300040Controllo negativo DapB in T4
Soluzione madre di scissione RNAscope HiPlexBio-TecnologieP/N 324399Reagente per la scissione durante il test RNAScope
RNAscope HiPlex Pro per COMET Kit da 12 plex e 20 vetriniBio-Tecnologie322075Reagenti & Tamponi per RNAScope
Sonda HiPlex per RNAscope - Hs-APOE-T2ACD BiotechneCodice 433093-T2(nota: specifico per questo studio) Accesso anticipato RNAscope e commercio; Sonda HiPlex CS - Hs-APOE-T2
Sonda HiPlex per RNAscope - Hs-ARG1-T4ACD Biotechne401581-T4(nota: specifico per questo studio) Accesso anticipato RNAscope e commercio; Sonda HiPlex CS - Hs-ARG1-T4
Sonda HiPlex per RNAscope - Hs-CD274-T1ACD BiotechneCodice 600863-T1(nota: specifico per questo studio) Accesso anticipato RNAscope e commercio; Sonda HiPlex CS - Hs-CD274-T1
Sonda HiPlex per RNAscope - Hs-CD40-T6ACD BiotechneCodice 445973-T6(nota: specifico per questo studio) Accesso anticipato RNAscope e commercio; Sonda HiPlex CS - Hs-CD40-T6
Sonda HiPlex RNAscope - Hs-CXCL1-01-T12ACD BiotechneCodice 1256473-T12(nota: specifico per questo studio) Accesso anticipato RNAscope e commercio; Sonda HiPlex CS - Hs-CXCL1-01-T12
Sonda HiPlex per RNAscope - Hs-GZMB-T7ACD BiotechneCodice 468453-T7(nota: specifico per questo studio) Accesso anticipato RNAscope e commercio; Sonda HiPlex CS - Hs-GZMB-T7
Sonda HiPlex per RNAscope - Hs-IFNG-T3ACD BiotechneCodice 310503-T3(nota: specifico per questo studio) Accesso anticipato RNAscope e commercio; Sonda HiPlex CS - Hs-IFNG-T3
Sonda RNAscope HiPlex - Hs-IL23a-T8ACD BiotechneCodice: 562853-T8(nota: specifico per questo studio) Accesso anticipato RNAscope e commercio; Sonda HiPlex CS - Hs-IL23A-T8
Sonda RNAscope HiPlex - Hs-IL6-T9ACD Biotechne400883-T9(nota: specifico per questo studio) Accesso anticipato RNAscope e commercio; Sonda HiPlex CS - Hs-IL6-T9
Sonda RNAscope HiPlex - Hs-TNFa-T11ACD BiotechneCodice 310423-T11(nota: specifico per questo studio) Accesso anticipato RNAscope e commercio; Sonda HiPlex CS - Hs-TNFa-T11
Sonda HiPlex per RNAscope - Hs-VEGFa-T5ACD Biotechne423163-T5(nota: specifico per questo studio) Accesso anticipato RNAscope e commercio; Sonda HiPlex CS - Hs-VEGFa-T5
Sonda HiPlex per RNAscope - Hs-VISTA-T10ACD BiotechneCodice 491513-T10(nota: specifico per questo studio) Accesso anticipato RNAscope e commercio; Sonda HiPlex CS - Hs-VISTA-T10
RNAscope HiPlex12 CS Sonda di controllo negativoACD Biotechne324347Pannello di controllo negativo completo a 12 plex raccomandato dal produttore. DapB in T1-T12.
RNAscope HiPlex12 CS Sonda a controllo positivo-HsACD Biotechne324317Pannello di controllo positivo umano completo a 12 plex consigliato dal produttore. Hs -RTU per il seguente gene housekeeping nei canali da T1 a T12: Polr2a, PPIB, UBC, HPRT1, TUBB, RPL28, RPL5, B2M, ACTB, LDHA-O1, RPLP0-X-RPLP0P2, GAPDH.
Acqua priva di RNAsiCorning46-000-CMPer pulire e preparare tutte le apparecchiature e per utilizzarle come diluente quando necessario
Soluzione di decontaminazione RNaseZap RNasiThermo Fisher ScientificoAM9782Una soluzione di decontaminazione delle superfici che distrugge le RNasi
RNeasy FFPE KitQiagen73504 & 19093Per l'estrazione dell'RNA e Misurazione DV200
Busta per diapositiveSimport ScientificM9504MAper la conservazione dei vetrini in tampone liquido.
Lama di rasoio industriale per uso generico di progettazione chirurgicaThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-812-236Istologia - Utilizzato durante il sezionamento dei campioni
TOX 1/2 - Ospite: Coniglio, Clone: E613QCSTCodice 62886SF(nota: specifico per questo studio) Anticorpo proteico primario
Grado istologico dello xileneThermo Fisher ScientificoUN1307Per deparaffinazione

Riferimenti

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