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Articolo metodologico

Cartografia molecolare a doppia modalità: integrazione del rilevamento multiplex dell'mRNA con la citometria di massa per imaging proteico

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DOI:

10.3791/68616

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14 novembre 2025

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1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Hematopoietic Biology & Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive in dettaglio una metodologia per la rilevazione multiplex dell'mRNA con citometria di massa per imaging proteico in sezioni di tessuto incluse in formalina fissate con paraffina.

Abstract

La capacità di rilevare proteine e mRNA nello stesso test ci aiuta a capire come la cellula si sta preparando per un arrivo e quali segnali riceve mentre viaggia e interagisce nell'ambiente in cui si trova. L'imaging con plex più elevato consente ora la caratterizzazione simultanea di mRNA (trascrittomica spaziale) e proteine (proteomica spaziale) risolti spazialmente. Per evitare ridondanze, questi analiti possono essere analizzati in un'unica sezione di tessuto. Esistono molte tecnologie che consentono molte proteine e pochi mRNA o l'inverso, ma poiché gli analiti ad azione centrale sono proteine, questo manoscritto si concentra sull'integrazione della citometria di massa (IMC) con l'ibridazione in situ dell'mRNA (ISH) utilizzando sonde metalliche. Questo ci permette di capire quali messaggi la cellula sta innescando o sta inviando rapidamente al mondo mentre comunica nel suo microambiente. Inoltre, supera i limiti legati al rilevamento di proteine secrete o marcatori impegnativi che di solito sono difficili da quantificare e visualizzare utilizzando solo gli anticorpi. Questo protocollo riduce inoltre al minimo la necessità di compensazioni o post-elaborazione osservate nei metodi basati su fluorescenza a plesso superiore, poiché non vi è alcuna spillover spettrale fluorescente in un sistema di rilevamento basato su sonde metalliche, né vi sono considerazioni sull'autofluorescenza tessuto-specifica.

Introduzione

I tumori mostrano diversità strutturali e funzionali in vari pazienti. Il microambiente tumorale (TME), composto da cellule normali e maligne, è eterogeneo tra i pazienti. Le metastasi derivano da un residuo del tumore primario che fuoriesce nel flusso sanguigno sotto forma di gruppi di cellule e singole cellule, il che fornisce indizi sulla progressione della malattia e sulla risposta terapeutica 1,2. La complessità di questi microambienti deve essere compresa1. Sebbene i tumori comprendano ampi tipi di cellule, lo standard clinico è istologicamente basato su un singolo marcatore, che sta iniziando a cambiaredi 1,2. Le tecnologie di imaging multiplexato hanno offerto nuove direzioni in patologia. La proteomica, la genomica, la metabolomica e la lipidomica dei tumori umani risolte spazialmente sono ora possibili con una risoluzione di una singola cellula o vicina a 3,4,5,6.

Queste tecnologie possono sezionare le posizioni cellulari eterogenee e le interazioni nei tumori. L'utilizzo di un'appropriata metodologia di bioimaging a singola cellula consente la generazione di profili di molti biomarcatori proteici associati alla malattia nelle biopsie dei pazienti per informare la progettazione di terapie antitumorali. Le intuizioni provenienti dalle mappe cellulari spaziali saranno in grado di guidare la scelta della terapia di combinazione in grado di eliminare efficacemente i tumori con riduzione degli off-target, della resistenza e della recidiva1. Il problema è la capacità di sindacalizzare queste molte tecnologie diverse che in genere non lavorano in armonia sulla stessa sezione di tessuto7. Questo protocollo, delineato visivamente nella Figura 1, offre l'opportunità di esaminare spazialmente sia la proteomica che un sottoinsieme mirato di mRNA nella stessa sezione di tessuto e nella stessa cellula contemporaneamente a una plessità più elevata di quanto sia possibile con proteina fluorescente simultanea + RNA-ISH8. Questo può anche fungere da ponte per l'analisi parallela 3,4,6, con l'obiettivo di deconvoluzione dell'analisi dei dati. Sebbene sia presente la doppia rilevazione, è possibile esaminare anche le cellule che hanno avviato rapidamente la produzione di mRNA, ma per le quali la proteina secreta rimane non rilevabile a causa della limitata sensibilità e della mancanza di amplificazione del segnale inerente ai metodi di anticorpi primari marcati direttamente, rendendo particolarmente difficile la rilevazione delle molecole secrete. Il seguente protocollo è adattato da una rivelazione fluorescente/cromogenica a 12 plex per essere applicabile alla rivelazione basata su metalli tramite sonde modificate a riduzione di tiolo per la rilevazione simultanea in IMC.

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Protocollo

Questo protocollo utilizza tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) raccolti da pazienti precedentemente non trattati sottoposti a chirurgia citoriduttiva primaria per carcinoma ovarico sieroso di alto grado. Tutti i dati clinici sono stati ottenuti dall'archivio del Dipartimento di Oncologia Ginecologica e Medicina Riproduttiva secondo i protocolli approvati dall'Institutional Review Board dell'Università del Texas MD Anderson. È stato ottenuto il consenso informato scritto dai pazienti e gli studi sono stati condotti in conformità con le linee guida etiche riconosciute.

1. Precauzioni e preparativi

  1. Utilizzare sempre acqua priva di nucleasi (NFW) per preparare tutti i reagenti necessari.
  2. Eseguire tutti i passaggi utilizzando contenitori di plastica e senza l'uso di vetro per ridurre il legame del metallo con il vetro e la contaminazione del metallo.
  3. Mantenere l'area di lavoro molto pulita e spruzzare le superfici e le pipette con la soluzione di decontaminazione RNasi, seguita da etanolo al 70% preparato con NFW.
  4. Coniugare le sonde di rilevamento dell'mRNA tiolato (T1-T12) a metalli appropriati tramite un linker malemide come descritto da Schulz et al7, ulteriormente dettagliato in protocol.io nella Tabella dei materiali.
    NOTA: I bersagli proteici dovrebbero essere scelti per indicare la posizione di una cellula all'interno del tessuto (marcatori strutturali), identificare quali cellule sono presenti (marcatori fenotipici) e cosa stanno facendo le cellule (marcatori funzionali). Poiché alcuni marcatori funzionali sono espressi transitoriamente, l'inclusione di bersagli di mRNA consente l'identificazione di cellule che generano questi bersagli.

2. Preparazione e pre-elaborazione del campione

  1. Cuocere le sezioni di tessuto per una notte in forno asciutto a 60 °C.
  2. Eseguire la deparaffinazione: tre cicli di xilene per 5 minuti ogni ciclo e 10 cicli di reidratazione (100% etanolo (EtOH) x2, 95% EtOH x2, 70% EtOH x2, 50% EtOH x2, 30% EtOH x2), per 3 minuti ogni giro. Lavare con 1 soluzione salina tamponata (TBS) per 2 minuti, una volta. A seconda del numero di campioni che vengono elaborati contemporaneamente, utilizzare provette coniche da 50 mL (2 vetrini max) o cassette di colorazione IHC da 350 mL (24 vetrini max).
    NOTA: Questa fase di deceratura, sebbene consigliata, è facoltativa e dipende dal tipo di tessuto.
  3. Applicare una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 3,7% per 10 minuti incubando i vetrini di tessuto in una provetta da 50 ml con una quantità di soluzione di PFA sufficiente a coprire la sezione di tessuto.
  4. Recupero dell'antigene indotto dal calore (HEIR) utilizzando le microonde: utilizzando un forno a microonde monitorato dalla temperatura, riempire un vassoio con il tampone di recupero dell'antigene HEIR a pH 6 (350 ml) e i restanti vassoi con NFW. Posizionare le sezioni di tessuto in un rack di colorazione per vetrini da microscopio e aggiungerle al vassoio con il tampone di recupero dell'antigene.
    NOTA: Quando si esegue il recupero dell'antigene, assicurarsi che il tampone di recupero dell'antigene sia a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso.
  5. Eseguire il prelievo dell'antigene a 107 °C per 15 minuti, quindi lasciare raffreddare i vetrini di tessuto a RT per 20 minuti in una cappa chimica.
  6. Durante il recupero dell'antigene, sciacquare la carta umidificante in acqua, metterla in un vassoio per la colorazione dei vetrini per il controllo dell'umidità e posizionare il vassoio in un forno di ibridazione a 60 °C.
  7. Sciacquare i vetrini in TBS senza RNasi per 3 minuti, quindi asciugare i vetrini per 3 minuti.

3. Trattamento con proteasi

  1. Disegna una barriera idrofobica attorno a ogni sezione di tessuto con una penna barriera idrofobica. Lasciare asciugare completamente la barriera per circa 2 minuti.
  2. Caricare i vetrini asciutti nel supporto del carrello del vassoio dell'umidità aprendo il morsetto girevole.
  3. Aggiungere abbastanza gocce di proteasi per coprire completamente la sezione del tessuto. Rimuovere la vaschetta di controllo dell'umidità preriscaldata (60 °C, passaggio 2.6) dal forno di ibridazione e inserire il supporto del vetrino nella vaschetta di controllo dell'umidità. Richiudere la vaschetta di controllo dell'umidità e rimetterla nel forno di ibridazione. Incubare a 40 °C per 30 min.
  4. Durante questa incubazione, preparare i materiali del saggio RNA-ISH.
    1. Preparare 500 mL di 1x RNA-ISH tampone di lavaggio diluendo il 20x stock con NFW. Conserva su RT fino a un mese.
      NOTA: Se si verificano precipitazioni nel tampone di lavaggio 50x, risospendere riscaldando il tampone a 40 °C per 10-20 minuti prima di preparare il tampone di lavaggio 1x.
  5. Preparare 1 L di DTBS-T (0,5% Tween) in NFW aggiungendo 5 mL di Tween a 1 L di DPBS-T.
  6. Preparare le sonde bersaglio accoppiate con RNA-ISH ZZ:
    1. Scaldare le scorte di sonde mRNA e il diluente RNA-ISH a 40 °C in forno asciutto per 10 minuti. Agitare le sonde e farle girare verso il basso in una mini centrifuga da banco.
    2. Preparare 1 miscela (fino a 12 sonde, Tabella 1) diluendo le sonde stock 50x nel diluente RNA-ISH, assicurandosi di avere un volume finale sufficiente a coprire l'intera sezione del tessuto.
    3. Agitare bene e lasciare le sonde miscelate e il diluente RNA-ISH a RT fino all'uso.
  7. Rimuovere la vaschetta di controllo dell'umidità dal forno di ibridazione e rimuovere il supporto del vetrino. Rimettere la teglia nel forno.
  8. Posizionare le diapositive in un supporto per diapositive trasparente prelavato con NFW. Lavare i vetrini in NFW con una leggera agitazione per 5 minuti.
  9. Ripetere la fase di lavaggio con NFW fresco per 5 minuti.

4. Ibridazione delle sonde bersaglio

  1. Rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini. Rimuovere la teglia di controllo dell'umidità dal forno e posizionare il supporto per vetrini nella teglia.
  2. Aggiungere una quantità sufficiente di miscela di sonde appropriata per coprire interamente ogni sezione di tessuto. Chiudere la teglia e inserirla nel forno per 2 h a 40 °C.
  3. Posizionare il reagente RNA-ISH Amplifier 1 (alberi di coda ZZ per le code da T1 a T4) per equilibrare a RT 30 minuti prima della fine dell'incubazione, da utilizzare al punto 5.2.
  4. Una volta terminata l'incubazione, rimuovere la vaschetta di controllo dell'umidità dal forno di ibridazione e rimuovere il supporto per vetrini. Rimettere la teglia nel forno.
  5. Posizionare le diapositive in un supporto per diapositive trasparente prelavato con NFW. Lavare i vetrini in 1x tampone di lavaggio agitando leggermente per 2 minuti.
  6. Ripetere la fase di lavaggio con 1x tampone di lavaggio fresco per 2 minuti a RT.

5. Ibridare l'amplificatore RNA-ISH 1

  1. Rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini e posizionare i vetrini nel supporto per vetrini del vassoio dell'umidità. Inserire il supporto del vetrino nel vassoio di controllo dell'umidità.
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 1 e aggiungilo per coprire interamente ogni sezione. Chiudere la teglia e inserirla nel forno di ibridazione per 30 min a 40 °C. Posizionare il reagente RNA-ISH Amplifier 2 (alberi di coda ZZ per le code da T5 a T8) su RT, da utilizzare al punto 6.2.
  3. Rimuovere la vaschetta di controllo dell'umidità dal forno di ibridazione e rimuovere il supporto del vetrino. Rimettere la teglia nel forno.
  4. Posizionare le diapositive in un supporto per diapositive trasparente prelavato con NFW. Lavare i vetrini in 1x tampone di lavaggio agitando leggermente per 2 minuti.
  5. Ripetere la fase di lavaggio con 1 tampone di lavaggio fresco per 2 minuti a RT.

6. Ibridare l'amplificatore RNA-ISH 2

  1. Rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini. Rimuovere la teglia di controllo dell'umidità dal forno e posizionare il supporto per vetrini nella teglia
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 2 e aggiungilo per coprire ogni sezione. Chiudere la teglia e inserirla nel forno di ibridazione per 30 min a 40 °C.
  3. Posizionare il reagente RNA-ISH Amplifier 3 (alberi di coda ZZ per le code da T9 a T 12) su RT, da utilizzare al punto 7.2. Rimuovere il supporto per vetrini dal vassoio. Rimettere la teglia nel forno.
  4. Posizionare le diapositive in un supporto per diapositive trasparente prelavato con NFW. Lavare i vetrini in 1x tampone di lavaggio agitando leggermente per 2 minuti.
  5. Ripetere la fase di lavaggio con 1 tampone di lavaggio fresco per 2 minuti a RT.

7. Ibridare l'amplificatore RNA-ISH 3

  1. Rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini. Rimuovere la teglia di controllo dell'umidità dal forno e posizionare il supporto per vetrini nella teglia
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 3 e aggiungilo per coprire interamente ogni sezione. Chiudere la teglia e inserirla nel forno di ibridazione per 30 min a 40 °C.
  3. Durante l'incubazione, preparare la miscela di oligo metallici per la fase 8. Ogni oligo viene utilizzato a una concentrazione di 1:15 (da stock da 10uM, assicurandosi di avere un volume finale sufficiente a coprire l'intera sezione del tessuto). Agitare bene e lasciare gli oligo metallici misti a RT fino all'uso. Estrarre la teglia per il controllo dell'umidità dal forno, quindi rimuovere il supporto per vetrini dalla teglia. Successivamente, rimettere la teglia nel forno
  4. Posizionare le diapositive in un supporto per diapositive trasparente prelavato con NFW. Lavare i vetrini in 1x tampone di lavaggio agitando leggermente per 2 minuti.
  5. Ripetere la fase di lavaggio con 1x tampone di lavaggio fresco per 2 minuti a RT.

8. Ibridare gli oligo metallici

  1. Rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini. Rimuovere la teglia di controllo dell'umidità dal forno e posizionare il supporto per vetrini nella teglia. Aggiungere oligo metallici misti preparati al punto 7.3 (vortice prima dell'uso).
  2. Chiudere la teglia e inserirla nel forno di ibridazione per 45 min a 40 °C.
  3. Rimuovere la vaschetta di controllo dell'umidità dal forno di ibridazione e rimuovere il supporto del vetrino. Rimettere la teglia nel forno.
  4. Posizionare le diapositive in un supporto per diapositive trasparente prelavato con NFW. Lavare i vetrini in 1x tampone di lavaggio agitando leggermente per 2 minuti.
  5. Ripetere la fase di lavaggio con 1x tampone di lavaggio fresco per 2 minuti a RT.

9. Anticorpi coniugati con metalli

  1. Per bloccare siti non specifici, applicare un volume sufficiente di tampone bloccante per coprire l'intera sezione di tessuto e incubare per 30 minuti a RT.
  2. Durante l'incubazione, preparare la miscela di anticorpi da utilizzare nella fase 10.1 diluendo gli anticorpi (Tabella 1) nel tampone diluente anticorpo.

10. Incubazione con anticorpi coniugati con metalli

  1. Dopo aver bloccato l'incubazione del tampone, scartare il tampone bloccante dai vetrini tissutali ed erogare un volume sufficiente della miscela per addominali (dal passaggio 9.2) per coprire l'intera sezione tissutale.
  2. Collocare il vetrino in una camera di umidità e incubare per una notte (~16 h) a 4 °C.

11. Colorazione del DNA

  1. Preparare una nuova soluzione di Ir-Intercalator.
    1. A partire da una soluzione madre da 500 μM, preparare una soluzione di lavoro 1:2000 in TBS privo di RNasi. La soluzione di lavoro può essere aliquotata e conservata a -20 °C (non congelare-scongelare).
  2. Posizionare le diapositive in un supporto per diapositive trasparente prelavato con NFW. Lavare i vetrini nel tampone TBS-T agitando leggermente per 5 minuti.
  3. Ripetere il lavaggio in TBS-T.
  4. Vetrini colorati con soluzione di lavoro Ir (dal passaggio 11.1.1) per 5 minuti a RT.
  5. Posizionare le diapositive in un supporto per diapositive trasparente prelavato con NFW. Lavare i vetrini nel tampone TBS-T agitando leggermente per 5 minuti.
  6. Ripetere il lavaggio in TBS-T.
  7. Lavare due volte in TBS, 5 minuti (mescolare lentamente).
  8. Immergere rapidamente il vetrino in ddH2O per evitare la cristallizzazione dei sali presenti nel TBS sul tessuto.
  9. Asciugare la diapositiva sotto una cappa chimica (10 min) e conservarla a 4 °C fino all'acquisizione dell'immagine.

12. Acquisizione dell'immagine

  1. Caricare il vetrino nella camera di ablazione di IMC.
  2. Acquisisci un'immagine panoramica per identificare la regione di interesse (ROI).
  3. Mappare i ROI nel software di acquisizione delle immagini.
  4. Applica il modello di acquisizione.
  5. Regolare la potenza del laser (energia di ablazione) in base al tipo di campione. Il valore predefinito è impostato su 0 dB.
    NOTA: Si consiglia di testare l'energia di ablazione con più piccole aree di tessuto (30 μm x 30 μm), aumentando la potenza di 1 dB ogni volta. Selezionare l'energia di ablazione più bassa che libera il campione senza bruciare nel vetrino. Normalmente, questo si traduce in una potenza laser di 3-4 dB. Occasionalmente, se il tessuto è più spesso di quanto consigliato, la potenza del laser aumenterà a 5 dB.
  6. Avviare l'ablazione laser. Il sistema dirige il laser verso il ROI e abla le proteine marcate con il metallo, generando pennacchi di aerosol che vengono trasferiti alla torcia al plasma accoppiato induttivamente (ICP), dove i pennacchi vengono vaporizzati, atomizzati e ionizzati nel plasma.
  7. Misurare la quantità di ciascun isotopo misurata dal rivelatore e convertita in dati.

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Risultati

La capacità di rilevare proteine e mRNA nello stesso test ci aiuta a capire come la cellula si sta preparando per un arrivo, ma anche quali code sta ricevendo mentre viaggia e interagisce con il suo ambiente. Come si vede nei dati rappresentativi, la rilevazione di mRNA e proteine sono componenti fondamentali nella ricerca di biologia spaziale, poiché i limiti inferiori di rilevamento possono essere piuttosto impegnativi in base al modo in cui progrediscono le fasi di etichettatura, rive...

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Discussione

La multi-omica multiplex è un'evoluzione fondamentale nei dati raccolti, mirando alle interazioni cellula-cellula e cellula-quartiere che influiscono sulla progressione della malattia e sul trattamento. L'analisi di questi dati nello stesso campione e quindi nella stessa cellula è fondamentale, poiché molti bersagli proteici sono espressi transitoriamente o differiscono nel livello di espressione dell'mRNA e della proteina, quindi l'introduzione di un rilevamento mirato dell'mRNA combina...

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Dichiarazioni

Jared K. Burks è un consulente per Standard BioTools.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata eseguita in collaborazione con la Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, che è supportata in parte dal National Institutes of Health attraverso il Cancer Center Support Grant P30 CA016672 di MD Anderson. Questa ricerca è stata anche supportata in parte dal MD Anderson's Cancer Center's Support Grant Development Award, Imaging Mass Cytometry Spatial Transcriptomics via RNAscope, P30CA016672, NIH/NCI, PI - Pisters. Lo sforzo del JKB è stato sostenuto in parte dal P30 CA016672 e dal NCI Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1. Lo sforzo di SFB è stato sostenuto in parte dall'Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 e 891490), dall'Honorable Tina Brozman Foundation for Ovarian Cancer Research, dal MDACC Ovarian Cancer SPORE Developmental Research Program, NIH 1R01CA261952-01A1. Lo sforzo di SFB, JKB e BG è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione 1U01CA294459-01. Gli autori ringraziano Samuel Mok, che ha sezionato e fornito i campioni utilizzati.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
  https://www.protocols.io/view/oligonucleotide-polymer-conjugation-for-imaging-ma-dm6gpjz91gzp/v2.Protocols.IOdx.doi.org/10.17504/protocols.io.dm6gpjz91gzp/v2Coniugazione oligonucleotide-polimero per la citometria di massa di imaging V.2 
10 TBS senza RNAsiThermo Fisher Scientific J62780. K7Per lavaggi intermittenti tra una fase e l'altra
Sistema di ibridazione ACD HybEZ IIACD Biotechne321711Forno per lame da cuoca
Diluente anticorpaleDakoS0809 Tampone diluente anticorpale
Anticorpo: B7-H3BethylA700-025CF, A700-026CFClone: BLR025F, BLR026F
Anticorpi: B7-H4Thermo Fisher Scientific 14-5949-82Clone: H74
Anticorpo: BRD4(6F11)BethylA700-005CFClone: BL-151-6F11
Anticorpo: CCR6R& DMAB195-100Clone: 53103
Anticorpo: CD11bAbcam ab209970Clone: EPR1344
Anticorpo: CD25Abcam ab215378Clone: EPR6452
Anticorpi: CD278/ICOSCST 89601BFClone: D1K2T
Anticorpo: CD31Abcam ab207090Clone: EPR3094
Anticorpo: CD33Abcam ab238784Clone: SP266
Anticorpi: CD3e e nbsp;CST85061BFClone: D7A6E
Anticorpo: CD4Abcamab181724Clone: EPR6855
Anticorpo: CD44Thermo Fisher Scientific MA1-10225Clone: IM7
Anticorpo: CD45Thermo Fisher Scientific 14-9457-82Clone: CD45-2B11
Anticorpo: CD8aCST 85336BFClone: D8A8Y
Anticorpo: CXCL13R& DAF801Clone: Policlonale
Anticorpo: CXCR5R& DMAB190-100Clone: CXCR5
Anticorpi: gamma-H2AXBethylA700-053CFClone: BLR053F
Anticorpo: Granzyme BSanta CruzSC-8022 XClone: 2C5
Anticorpo: KAP1BethylA700-014CFClone: BL-248-2G6
Anticorpo: Ki67BethylA700-021CFClone: BLR021E
Anticorpi: LCK CST2984BFClone: D88
Anticorpo: MFAP5N/AN/APMID: 31332047 / Clone: 130A  (Nota: progettato su misura) 
Anticorpo: SMACST56856BFClone: 1A4
Anticorpo: VEGFSTB-Fluidigm3163028DClone: G153-494
Anticorpo: VISTACST64953BFClone: D1L2G
AZ-AR1 Elegance Citra BioGeneXHK546-XAKBuffer di recupero dell'antigene
Alcol etilico 100% (200 proof)Pharmco111000200Per la deparaffinizzazione
EZ & ndash; Retriever IRBioGeneXMW016-IRSistema di prelievo antigenico per sezioni tissutali FFPE
Sistema di ibridazione HybEZ IIACD Biotechne321710Il sistema comprende: forno HybEZ (PN 321710/321720), una teglia per il controllo dell'umidità (PN 310012), carta umidificante HybEZ (2 fogli PN 310025), vassoio per lavaggio EZ-Batch (PN 321717), portavetri EZ-Batch (PN 321716)
Penna PAP VectorLabsH-4000Recinto barriera idrofobico
Soluzione Intercalatore IRThermo Fisher Scientific NC1038184Utilizzato per identificare cellule nucleate
KERATIN 18/8CST 4546BFClone: C51
Metal OligosVariVariTag metallico che varia da T1 a T12 a seconda di quale serve
Acqua priva di nucleasi (NFW)Corning 46-000-CM Pulire e preparare tutta l'attrezzatura, e utilizzarli come diluente quando necessario
RNAscope Protease Plus ACD Biotechne322331 Utilizzato per permeabilizzare le membrane cellulari dei campioni
Portavetri RNAscope EZ-BatchACD Biotechne310017Progettato per processare manualmente fino a 20 vetrine in modo efficiente
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 ACD Biotechne324409Reagenti per RNAScope
Sonda RNAscope HiPlex - Sonde bersaglioACD BiotechneVariIntervalli da T1 a T12 a seconda di quale sia necessario
Soluzione di decontaminazione RNase RNaseZapThermo Fisher ScientificAM9782Una soluzione di decontaminazione superficiale che distrugge le RNasi
Portavetri per portavetri per microscopio a grigliera per le tintine, 24 posti in plastica resistente ai prodotti chimiciScientifico ottimale3028Per la tintura di più vedute
Preadolescenti 20Thermo Fisher Scientific AAJ20605APPer lavaggi intermittenti tra una fase e l'altra
Blocco proteico per ultravisioneThermo Fisher Scientific TA125PBQBuffer di blocco

Riferimenti

  1. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  2. Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncol. 5 (8), 1195-1204 (2019).
  3. Parolini, M., et al. Microplastic contamination in snow from western Italian Alps. Int J Environ Res Public Health. 18 (2), 768(2021).
  4. Carstens, J. L., et al. Stabilized epithelial phenotype of cancer cells in primary tumors leads to increased colonization of liver metastasis in pancreatic cancer. Cell Rep. 35 (2), 108990(2021).
  5. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precis Oncol. 4 (1), 1-12 (2020).
  6. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  7. Schulz, D., et al. Simultaneous multiplexed imaging of mRNA and proteins with subcellular resolution in breast cancer tissue samples by mass cytometry. Cell Syst. 6 (1), 25-36.e25 (2018).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  10. Mok, S. C., et al. A gene signature predictive for outcome in advanced ovarian cancer identifies a survival factor: microfibril-associated glycoprotein 2. Cancer Cell. 16 (6), 521-532 (2009).
  11. Yeung, T. L., et al. Anticancer immunotherapy by MFAP5 blockade inhibits fibrosis and enhances chemosensitivity in ovarian and pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 25 (21), 6417-6428 (2019).
  12. Ogura, H., et al. Interleukin-17 promotes autoimmunity by triggering a positive-feedback loop via interleukin-6 induction. Immunity. 29 (4), 628-636 (2008).
  13. Murakami, M., et al. Local microbleeding facilitates IL-6- and IL-17-dependent arthritis in the absence of tissue antigen recognition by activated T cells. J Exp Med. 208 (1), 103-114 (2011).
  14. Hou, W., Jin, Y. -H., Kang, H. S., Kim, B. S. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibiting cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. J Virol. 88 (15), 8479-8489 (2014).
  15. Geskin, L. J., Viragova, S., Stolz, D. B., Fuschiotti, P. Interleukin-13 is overexpressed in cutaneous T-cell lymphoma cells and regulates their proliferation. Blood. 125 (18), 2798-2805 (2015).
  16. Aspord, C., et al. Breast cancer instructs dendritic cells to prime interleukin 13-secreting CD4+ T cells that facilitate tumor development. J Exp Med. 204 (5), 1037-1047 (2007).
  17. Votava, M., et al. The expression profiles of CD47 in the tumor microenvironment of salivary gland cancers: a next step in histology-driven immunotherapy. BMC Cancer. 22 (1), 1-12 (2022).
  18. Liu, X., Kwon, H., Li, Z., Fu, Y. X. Is CD47 an innate immune checkpoint for tumor evasion. J Hematol Oncol. 10 (1), 1-10 (2017).
  19. Salerno, F., Guislain, A., Cansever, D., Wolkers, M. C. TLR-mediated innate production of IFN-γ by CD8+ T cells is independent of glycolysis. J Immunol. 196 (9), 3695-3705 (2016).
  20. Kalia, V., et al. Prolonged interleukin-2Rα expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 32 (1), 91-103 (2010).
  21. Cancino-Díaz, J. C., et al. Interleukin-13 receptor in psoriatic keratinocytes: overexpression of the mRNA and underexpression of the protein. J Invest Dermatol. 119 (5), 1114-1120 (2002).
  22. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  23. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  24. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  25. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  26. Chevrier, S., et al. Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry. Cell Syst. 6 (5), 612-620.e15 (2018).
  27. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J Histochem Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  28. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. In situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  29. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-12 (2023).
  30. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  31. Glasson, Y., et al. Single-cell high-dimensional imaging mass cytometry: one step beyond in oncology. Semin Immunopathol. 46 (1), 1-12 (2023).

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