Articolo metodologico

Amplificazione e riconoscimento dei microRNA attraverso l'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato come nuovo metodo di rilevamento e quantificazione

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DOI:

10.3791/68617

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7 ottobre 2025

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1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In questo articolo

Sommario

Il protocollo descrive un test di ibridazione in immunofluorescenza tandem con tessuto incluso in paraffina fissato in formalina per rilevare e quantificare contemporaneamente microRNA e proteine multiplexate.

Abstract

Quando si utilizzano i tradizionali metodi di rilevamento dell'imaging con ibridazione in situ (ISH) basati su sonda, i microRNA (miRNA) sono difficili da catturare a causa delle loro dimensioni, che variano da 19 a 25 nucleotidi. Tuttavia, poiché i miRNA sono regolatori epigenetici chiave che contribuiscono alla normale fisiologia e a numerose condizioni patologiche, comprendere il comportamento spazio-temporale dei miRNA è importante per svelare la loro funzione a livello cellulare e subcellulare. Ciò crea una chiara necessità di tecniche di rilevamento e visualizzazione adeguate. Pertanto, abbiamo creato l'amplificazione e il riconoscimento dei microRNA attraverso l'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato (MARLIN), che è stato sviluppato e ottimizzato utilizzando la colorazione a immunofluorescenza multiplex e le sonde di acido nucleico bloccato (LNA) mirate a un miRNA. Questo metodo è in grado di quantificare i miRNA con espressione proteica multiplexata, che consente la quantificazione di miRNA intracellulari ed extracellulari all'interno del microambiente tumorale (TME) con elevata sensibilità e riproducibilità. L'uso combinato di saggi di rilevamento dei miRNA e di cattura proteica può anche fornire una comprensione completa delle funzioni cellulari e dei meccanismi di regolazione all'interno di tale TME.

Introduzione

microRNA
Sebbene i microRNA (miRNA) siano incredibilmente piccoli, con una lunghezza compresa tra 19 e 25 nucleotidi, queste molecole di RNA a singolo filamento sono potenti regolatori dell'espressione genica, modulando gli RNA messaggeri (mRNA) post-trascrizionale attraverso interazioni sequenza-specifiche1. In sostanza, i miRNA agiscono come regolatori negativi legandosi agli mRNA bersaglio, impedendone la traduzione o promuovendone la degradazione attraverso la scissione dell'mRNA, a seconda del grado di complementarietà, che alla fine porta a una diminuzione della produzione proteica dal gene bersaglio. Mentre i miRNA sono fondamentalmente RNA non codificanti, circa il 40% di tutti i miRNA si trova ancora all'interno di introni o esoni di geni codificanti proteine2. Lo scopo funzionale dei miRNA comprende diversi processi biologici chiave come la proliferazione cellulare, l'angiogenesi, l'apoptosi, ecc. In particolare, la disregolazione dei miRNA è stata implicata nella tumorigenesi, poiché l'espressione aberrante di specifici miRNA e la regolazione genica mediata dai miRNA sono state associate alla trasformazione oncogenica in diversi tipi di cancro3.

Dalla loro scoperta, i miRNA sono stati ampiamente studiati in varie malattie grazie alla loro espressione tessuto-specifica e alle funzioni regolatorie, con la loro disregolazione legata a molte malattie, tra cui disturbi neurodegenerativi, disturbi autoimmuni e vari tumori 4,5,6. I modelli di espressione dei miRNA possono essere correlati con il tipo di cancro, lo stadio e le variabili cliniche, rendendo la profilazione dei miRNA uno strumento prezioso per la diagnosi e la prognosi del cancro 4,5,6,7. La scoperta di nuovi miRNA è stata accelerata anche dai progressi nelle tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, migliorando la comprensione del coinvolgimento dei miRNA in diversi processi biologici8. L'importanza dei miRNA è stata sottolineata dal Premio Nobel per la Medicina 2024 assegnato a Victor Ambros e Gary Ruvkun per la loro scoperta della funzione dei miRNA nella regolazione post-trascrizionale9.

Come preziosi biomarcatori per la diagnosi e la prognosi della malattia, è stato esplorato il potenziale terapeutico dei miRNA, portando allo sviluppo di farmaci mirati ai miRNA. Il potenziale terapeutico dei miRNA nel trattamento del cancro risiede nella loro capacità di regolare in modo coordinato moduli di geni, ripristinando potenzialmente le normali funzioni cellulari10. In precedenza, le terapie antitumorali basate su miRNA sono state sviluppate in monoterapia o in combinazione con terapie mirate esistenti per migliorare le risposte al trattamento e aumentare i tassi di guarigione11. Lo spettro dinamico dei miRNA li ha posizionati come risorse essenziali per strategie innovative di trattamento del cancro. Nel contesto della resistenza terapeutica, il targeting dei miRNA si è dimostrato promettente nel ridurre la recidiva e la resistenza ai trattamenti antitumorali tradizionali, migliorando potenzialmente la sopravvivenza dei pazienti prendendo di mira le cellule tumorali12. Esplorando il ruolo dei miRNA nella modulazione delle attività di vari tipi di cellule nel microambiente tumorale (TME), è possibile scoprire trattamenti antitumorali unici e clinicamente rilevanti.

Saggi disponibili per rilevare i miRNA
Attualmente, il metodo più comune per la misurazione dei miRNA si basa sull'RNA estratto per la PCR quantitativa in tempo reale (q-RT-PCR) o il sequenziamento di nuova generazione (NGS), perdendo il contesto spaziale. Ci sono aziende che forniranno saggi di microRNA TaqMan, che utilizzano primer stem-loop specifici per il bersaglio per la sintesi del cDNA, e sostanze chimiche a base di colorante verde SYBR con sintesi universale del cDNA. Questi test possono offrire un'elevata sensibilità e specificità e possono essere eseguiti su una gamma di strumenti q-RT-PCR. Sfortunatamente, i test TaqMan non possono fornire una quantificazione assoluta, il che può portare a problemi come falsi positivi e variabilità nei risultati13. Inoltre, nonostante la loro elevata sensibilità, l'applicazione di questi saggi in diversi tipi di campioni può essere limitata dalla necessità di un'ampia preparazione del campione e dalla potenziale interferenza di altri componenti nel campione.

Sequenziamento di nuova generazione (NGS): il miRNA-seq è sempre più popolare per l'analisi dell'espressione differenziale nell'intero miRNome dei biofluidi. Un vantaggio delle tecnologie NGS come i miRNA-seq è che consentono analisi parallele massicce dell'espressione dell'intero genoma dei miRNA, consentendo la quantificazione dei singoli miRNA, l'identificazione di variazioni di sequenza e la scoperta di nuovi miRNA14. Uno svantaggio sostanziale dei metodi basati sul sequenziamento, come il kit di preparazione di campioni di piccoli RNA IlluminaTruSeq, è l'induzione di distorsioni quantitative, che influenzano l'accuratezza delle analisi di espressione differenziale, dovute in gran parte all'omologia e alle minori lunghezze di lettura dei miRNA14. Non solo, ma la presenza di isomiR (varianti che differiscono per sequenza o lunghezza dalla sequenza canonica dei miRNA) e di artefatti tecnici può complicare l'interpretazione dei dati, portando potenzialmente a rilevamenti errati e fattori di confusione nei saggi dei biomarcatori14. Inoltre, diversi strumenti per l'analisi dei dati miRNA-seq, come sRNAbench e miRDeep2, possono produrre risultati variabili, influenzando la coerenza e l'affidabilità della scoperta di nuovi miRNA15,16. Anche qualcosa come la tecnologia dei microarray può essere insufficiente nella maggior parte dei casi. Sebbene possa fornire una piattaforma potente e ad alto rendimento per rilevare i livelli di miRNA o di espressione genica, rendendola adatta per studi sull'intero genoma, la tecnologia è ancora limitata dal numero di miRNA precedentemente identificati e non può verificare direttamente le interazioni miRNA-bersaglio, il che limita la loro utilità negli studi funzionali17.

Il fattore più importante che può essere sottolineato qui quando si confrontano tutte queste opzioni disponibili è la mancanza di contesto spaziale. Non forniscono alcun contesto in relazione alla morfologia dei tessuti o alla distribuzione spazio-temporale all'interno delle cellule. La visualizzazione del comportamento spazio-temporale dei miRNA è necessaria per svelare la loro funzione a livello cellulare e subcellulare. Attualmente, sono accessibili saggi di ibridazione in situ (ISH) con miRNAscope, che di solito utilizzano metodi di rilevamento cromogenico. Sebbene questi saggi consentano la visualizzazione dei miRNA con risoluzione di una singola cellula, i risultati sono carenti in termini di qualità, rendendo difficile distinguere tra l'espressione del miRNA e lo sfondo del campione. In genere, molti di questi producono saggi di bassa qualità, che sono inaffidabili e di solito richiedono una quantificazione manuale.

Pertanto, abbiamo sviluppato l'amplificazione e il riconoscimento di microRNA attraverso l'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato (MARLIN) utilizzando la colorazione in immunofluorescenza multiplex (mediante colorazione con proteina opale) e sonde di acido nucleico bloccato (LNA) mirate a un miRNA, all'interno di tessuti inclusi in paraffina (FFPE) fissati in formalina. Abbiamo raggiunto questo obiettivo implementando un sistema di amplificazione del segnale della tiramide (TSA) attivato da un anticorpo coniugato anti-digossigenina (DIG) perossidasi di rafano (HRP). L'HRP funge da catalizzatore per la TSA, mentre l'Anti-DIG si attacca alla sonda LNA. Questo test è di particolare utilità per comprendere la natura essenziale dei miR nella modificazione post-trascrittomica con le proteine e potenzialmente con altri RNA contemporaneamente. Inoltre, a causa della mancanza di un test disponibile in commercio in grado di quantificare sia l'espressione di miRNA che quella proteica, MARLIN fornisce un modo efficace per comprendere le relazioni in situ di miR e proteine all'interno di campioni FFPE.

I risultati iniziali della quantificazione del miR-181c-3p utilizzando MARLIN hanno dimostrato la fattibilità dell'analisi parallela di miRNA e proteine all'interno del contesto spaziale nativo del tessuto FFPE ovarico umano. Oltre a questo esempio, sulla base dei componenti di MARLIN, è teoricamente possibile espandere fino a quattro proteine utilizzando fluorofori di multiplexing fluorescenti commerciali come Alexa Fluor o altri coloranti a piccole molecole18.

Inoltre, poiché questa metodologia impiega variazioni rispetto ai metodi istologici standard, dovrebbe essere compatibile con altri tessuti FFPE di mammifero, data un'appropriata selezione di sonde e anticorpi. Questa metodologia preserva l'architettura spaziale e consente la quantificazione della colocalizzazione cellulare e subcellulare di miRNA e proteine. Questo approccio affronta una lacuna critica nella biologia spaziale mappando i modelli di co-espressione miRNA-proteina e la distribuzione spaziale, che possono essere direttamente contestualizzati all'interno di architetture tissutali native. Qui presentiamo MARLIN con una panoramica grafica dettagliata nella Figura 1. Sebbene il protocollo presentato sia ottimizzato per il miR-181c-3p, è possibile studiare altri miR, dato un design della sonda appropriato. I parametri critici per questo metodo includono: la valutazione della qualità dei tessuti e l'ottimizzazione delle concentrazioni delle sonde. Si raccomanda di valutare l'integrità dell'RNA del blocco di tessuto utilizzando una metrica DV200 utilizzando due sezioni da 10 μm ed estraendo l'RNA utilizzando un protocollo che preserva tutte le dimensioni dei frammenti di RNA. I campioni con un punteggio DV200 superiore a 50 o superiore e le concentrazioni del protocollo devono essere testati sistematicamente.

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Protocollo

Questo protocollo utilizza tessuti FFPE (FFPE) fissati in formalina di sezioni di tessuto tumorale ovarico umano provenienti da pazienti con HGSC. Questi campioni sono stati raccolti da pazienti precedentemente non trattate sottoposte a chirurgia citoriduttiva primaria per carcinoma ovarico. Tutti i campioni e i dati clinici sono stati ottenuti dall'archivio del cancro ovarico del Dipartimento di Oncologia Ginecologica e Medicina Riproduttiva secondo i protocolli approvati dall'Institutional Review Board dell'Università del Texas MD Anderson. Il consenso informato scritto dei pazienti è stato ottenuto dal personale della reception e gli studi sono stati condotti in conformità con le linee guida etiche riconosciute.

1. Preparazione dei tessuti

  1. Cuocere tutti i campioni FFPE per una notte a 60 °C e pulire ogni apparecchiatura e strumento con acqua priva di RNAsi. Assicurarsi che le sezioni abbiano uno spessore di circa 5 μm.
    NOTA: Questo protocollo è stato ottimizzato per i tumori ovarici, ma può potenzialmente essere utilizzato con altri tipi di tessuto dopo ulteriori test.
  2. Eseguire la deparaffinazione con tre cicli di xilene per 5 minuti ciascuno e 10 cicli di reidratazione per 3 minuti ciascuno (100% etanolo (EtOH) 2x, 95% EtOH 2x, 70% EtOH 2x, 50% EtOH 2x, 30% EtOH 2x). Lavare con 1 soluzione salina tamponata (TBS) per 2 minuti, una volta.
    NOTA: Questa fase di deceratura, sebbene consigliata, è facoltativa e dipende dal tipo di tessuto.
  3. Dopo la deparaffinazione e la reidratazione, applicare una soluzione di Perossido di Idrogeno al 3% (H2O2) per 10 min. Lavare per 2 minuti con 1x TBS, 2x. Quindi, applicare una soluzione di Paraformaldeide (PFA) al 3,7% per 10 minuti. Lavare per 2 minuti con 1x TBS, 2x.
    NOTA: Questo passaggio è facoltativo e deve essere preso in considerazione solo per i tessuti adiposi o per i campioni soggetti a distacco.
  4. Procedere al primo ciclo di recupero dell'antigene. Questo protocollo utilizza il sistema IR EZ-Retriever. Seguendo le istruzioni del sistema, cuocere i campioni nel microonde mentre sono immersi in un tampone EZ-AR1 fresco a 95 °C per 15 minuti. Lasciare raffreddare per 20 min.
  5. Lavare per 2 minuti con 1 TBS. Quindi per 2 minuti con 1x TBS-T (1x TBS con 0,1% Tween), 2x.

2. Applicazione delle proteine

  1. Disegna una barriera attorno a ogni sezione di tessuto con una penna barriera idrofobica.
  2. Aggiungere 1x soluzione bloccante degli anticorpi (sufficiente a coprire l'intera area del tessuto) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera di umidità (umidità ambiente e non controllata).
  3. Successivamente, diluire il primo anticorpo primario con la stessa soluzione bloccante, applicarne una quantità sufficiente a coprire l'intera area del tessuto e lasciare incubare per 1 ora a temperatura ambiente in una camera di umidità.
    NOTA: Durante lo sviluppo di questo protocollo, l'Anti-CD8 è stato utilizzato con una diluizione di 1:75.
  4. Lavare per 2 minuti in 1x TBS-T, 3x. Quindi, aggiungere l'Anti-Ms + Rb HRP e lasciare incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente in una camera di umidità (umidità ambiente e incontrollata).
  5. Lavare per 2 minuti in 1x TBS-T, 3x. Diluire il primo fluoroforo con il diluente di amplificazione a 1:100 e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente nella camera di umidità.
    NOTA: Durante lo sviluppo di questo protocollo, è stato utilizzato un fluoroforo di emissione a 690 nm. Da questo punto, si consiglia di utilizzare un'illuminazione minima per il resto della procedura dopo aver applicato il primo giro di fluoroforo.
  6. Lavare per 2 minuti in 1x TBS-T, 3x. Iniziare il secondo ciclo di colorazione degli anticorpi con il secondo ciclo di recupero dell'antigene nel microonde, immergendo nuovamente i campioni in un tampone EZ-AR1 fresco a 95 °C per 15 minuti, quindi raffreddando per 20 minuti.
  7. Lavare per 2 minuti con 1 TBS. Quindi lavare per 2 minuti con 1x TBS-T, 2x.
  8. Applicare nuovamente la soluzione anticorpale 1x per 30 minuti in una camera di umidità a temperatura ambiente (umidità ambiente e incontrollata).
  9. Diluire il secondo anticorpo primario con la stessa soluzione bloccante, applicarne una quantità sufficiente a coprire l'intera area del tessuto e lasciare incubare per una notte a 4 °C in una camera di umidità per almeno 16 ore.
    NOTA: Durante lo sviluppo di questo protocollo, Anti-EpCAM è stato utilizzato con una diluizione di 1:200.
  10. Inizia il giorno seguente lavando per 2 minuti in 1x TBS-T, 3x. Quindi aggiungere l'Anti-Ms + Rb HRP e lasciare incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente in una camera di umidità (umidità ambiente e incontrollata).
  11. Lavare per 2 minuti in 1x TBS-T, 3x. Diluire il secondo fluoroforo con il diluente di amplificazione a 1:100 e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente nella camera di umidità.
    NOTA: Durante lo sviluppo di questo protocollo, è stato utilizzato un fluoroforo di emissione a 620 nm.

3. Applicazione della sonda

  1. Lavare per 2 minuti in 1x TBS-T, 3x.
  2. Iniziare il terzo e ultimo prelievo dell'antigene con EZ-AR1 Elegance nel microonde a 107 °C per 15 minuti. Lasciare raffreddare per 20 min. Lavare per 3 minuti in 1 TBS.
  3. Applicare RNAscope Protease Plus (sufficiente a coprire l'intera area tissutale) e mantenere a 40 °C per 30 minuti. Usa un forno. Lavare per 5 minuti in 1x TBS, 2x.
  4. Eseguire la preparazione della sonda mediante denaturazione a 90 °C per 4 minuti della sonda LNA miRNA. Quindi diluire immediatamente la sonda utilizzando il tampone miRNA-ISH. Vorticare e far girare la soluzione della sonda.
    NOTA: Durante lo sviluppo di questo protocollo, la sonda bersaglio miR-181c-3p è stata utilizzata con una diluizione di 1:250.
  5. Applicare la sonda (sufficiente a coprire l'intera area del tessuto) e rimettere in forno per 1 ora a 60 °C. Lavare per 5 minuti in 5 tamponi salini di citrato di sodio (SSC).
  6. Eseguire cinque lavaggi rigorosi in SSC preriscaldato a 60 °C nel seguente ordine e diluizioni per 5 minuti ciascuno: un ciclo di SSC 5x, due cicli di SSC 1x e due cicli di SSC 0,2x.
  7. Lavare per 5 minuti in 0,2x SSC a temperatura ambiente. Incubare con tampone bloccante per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata. Utilizzare una combinazione di 1x TBS e polvere di reagente bloccante allo 0,5%, assicurarsi di agitare e far girare la soluzione bloccante prima dell'applicazione.
  8. Applicare un coniugato HRP anti-digossigenina (topo) (per questi campioni è stata utilizzata una diluizione di 1:500) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata.
  9. Lavare per 5 minuti in 1x TBS-T, 3x Applicare una diluizione consigliata di 1:50 del fluoroforo Tyramide Signal Amplification Plus Cyanine 3 (TSA+Cy3) per 10 minuti in una camera di umidità a temperatura ambiente (umidità ambiente e incontrollata). Assicurati di agitare e far girare la soluzione TSA+Cy3 prima dell'applicazione.
  10. Lavare per 5 minuti in 1x TBS-T, 3x.

4. Colorazione e montaggio nucleare

  1. Applicare la soluzione di lavoro 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (sufficiente a coprire l'intera area del tessuto) per 5 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata (umidità ambiente e non controllata).
    NOTA: Per questo protocollo, è stata utilizzata una diluizione di 1:1000, con il grezzo DAPI di lavoro diluito in TBS.)
  2. Lavare per 5 minuti in 1x TBS-T, 3x. Al termine, applicare i vetrini coprioggetti utilizzando il supporto di montaggio e lasciare asciugare i vetrini per 10 minuti. Conservare i vetrini a 4 °C al buio tra 24-72 ore prima dell'imaging e fino a tre mesi dopo.

5. Imaging e analisi

  1. Per l'imaging, utilizzare un microscopio a scansione di vetrini (preferibile) con ingrandimento 40x.
  2. Eseguire successive analisi quantitative per enumerare i puncta utilizzando DAPI e la controcolorazione delle proteine per la segmentazione e la fenotipizzazione cellulare.
    NOTA: Durante questo protocollo, abbiamo utilizzato l'imaging con un Phenoimager HT. Le scansioni complete dei vetrini sono state acquisite con un ingrandimento di 40x utilizzando filtri appropriati per i fluorofori presenti, e le immagini multiplex sono state quindi esportate come file OME-TIFF. Le immagini scansionate sono state quindi caricate nel software di analisi delle immagini Visiopharm per l'analisi quantitativa.

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Risultati

Quando si testa questo protocollo, è importante disporre di due sezioni seriali dello stesso campione rappresentativo per l'accuratezza e il confronto. In questo caso, è stato utilizzato un campione di carcinoma ovarico di alto grado (HGSC) per confrontare i risultati. Sono stati utilizzati un vetrino di controllo (Figura 2A-B) che avrebbe attraversato solo la colorazione dei miRNA e un vetrino di prova che a...

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Discussione

Sebbene l'importanza dei miRNA sia riconosciuta e compresa, le osservazioni sia dello sviluppo normale che degli stati patologici sono attualmente ostacolate dalla difficoltà di studiare i miRNA con metodi standard. La scarsità di metodi in situ ha portato allo sviluppo di MARLIN (miRNA FISH assay). Data l'omologia e la breve lunghezza dei miRNA, diventa una sfida visualizzare la loro posizione e l'effetto sulla regolazione post-trascrittomica. Lo sviluppo di questo protocollo u...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare le seguenti persone, Chi Lam Au Yeung e Manjunath Nimmakayalu, che hanno fatto parte del comitato di tesi di Basant mentre il saggio era in fase di sviluppo. Inoltre, Samuel Mok, che ha sezionato e fornito i campioni utilizzati. Infine, ringraziamo Johan Doré e Dan Winkowski, che hanno fornito un'ampia assistenza durante l'analisi e l'utilizzo del software Visiopharm. Questa ricerca è stata finanziata in parte dall'Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 e 891490), dalla Sie Foundation e dallo Stephanie C. Stelter Endowment Fund. Questa ricerca è stata eseguita in collaborazione con la Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, che è supportata in parte dal National Institutes of Health attraverso il Cancer Center Support Grant P30 CA016672 di MD Anderson e lo specialista di ricerca NCI 1 R50 CA243707-01A1 di Jared Burks.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x soluzione salina tamponata TRIS (TBS) pH 7,6 Thermo Fisher Scientific  J62662  K7Per lavaggi intermittenti tra una fase e l'altra
1x Diluente/Blocco/Blocco di Anticorpi Opalo;Akoya BiosciencesARD1001EASoluzione bloccante delle proteine
Diluente di amplificazione 1x Plus AutomationAkoya Bioscienze FP1609Usata per diluire i fluorofori opali
20x Concentrate  Tampone di citrato di sodio salino (SSC)Sigma-AldrichS6639-1LPer lavaggi di miRNA dopo l'ibridazione con sonda
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) Thermo Fisher Scientific/InvitrogenEN62248 / 62248Per la colorazione nucleare
Sistema di ibridazione ACD HybEZ IIACD Biotechne321711Forno usato per regolare la temperatura durante il protocollo miRNAscope
Anti-CD8 (D8A8Y), mAb coniglioTecnologie di segnalazione cellulare85336SEsempio di anticorpo primario utilizzato per ottimizzare questo protocollo
Anti-Digoxigenina (Topo) HRP ConiugatoRevvity Health Sciences IncNEF832001EAReagente secondario utilizzato per il rilevamento dei miRNA
Anti-EpCAM (E6V8Y), Rabbit mAbTecnologie di segnalazione cellulare93790Esempio di anticorpo primario utilizzato per ottimizzare questo protocollo
Blocco della polvere di reagenteAkoya Bioscienze FP1012Soluzione bloccante del miRNA
Alcol etilico 100% (200 proof)Pharmco111000200Per la deparaffinizzazione
EZ-AR1 BufferBioGeneXHK521-XAKUtilizzato per il prelievo di antigeni di sezioni di tessuto FFPE nella fase proteica
EZ-AR1 Elegance BufferBioGeneXHK546-XAKUtilizzato per il prelievo di antigeni di sezioni di tessuto FFPE nella fase di sonda del miRNA
Sistema IR EZ-RetrieverBioGeneXMW015-IRMicroonde utilizzato per il prelievo di antigeni di sezioni di tessuto FFPE
Soluzione di perossido di idrogeno 30% Sigma-Aldrich HX0640-5 Per la preparazione dei fazzoletti. Aiuta a bloccare l'attività endogena della perossidasi e a produrre prodotti molto colorati
Sonda miRNA miR-181c-3pQiagen339112Esempio di sonda miRNA utilizzata per ottimizzare questo protocollo
MiRCURY LNA miRNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)Qiagen339450 Usata per diluire la sonda del miRNA
Opal 620Akoya Bioscienze FP1495001KTFluoroferano per identificare l'anticorpo primario
Opal 690 Akoya Bioscienze FP1497001KTFluoroferano per identificare l'anticorpo primario
Opal Anti-Ms + Rb HRPAkoya BiosciencesARH1001EAAnticorpo secondario utilizzato come agente di rilevamento
Pierce 16% Formaldeide (w/v), Privo di metanoloThermo Fisher Scientific28908Produrre il 3,7% di PFA per la preparazione dei tessuti
Antifade a diamante ProLongThermo Fisher ScientificP36970Supporti di montaggio
RNAscope Proteasi PlusACD Biotechne322331Per permeabilizzare le sezioni tissutali   digerendo parzialmente proteine e esporre le molecole di miRNA target
Acqua priva di RNAsi  Corning 46-000-CM Pulire e preparare tutta l'attrezzatura, e usarli come diluito quando necessario   
Preadolescenti 20Sigma-AldrichP1379-25MLPer realizzare TBS-T
Amplificazione del segnale con tiramide più cianina 3Akoya Bioscienze NEL744001KTFluoroferano per identificare i miRNA
Sonde miRNA U6 e ScrambleQiagen339459Sonde di controllo opzionali
Grado istologico degli xileniThermo Fisher ScientificUN1307Per la deparaffinizzazione

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