Method Article

Rilevamento sequenziale di biomolecole in campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina con imaging per spettrometria di massa

DOI:

10.3791/68618

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October 24th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Texas at Austin, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo di imaging per spettrometria di massa per la rilevazione sequenziale di metaboliti, glicani legati all'N e peptidi triptici in campioni di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I tessuti sono ambienti cellulari complessi, costituiti da una vasta gamma di tipi di cellule e biomolecole che interagiscono tra loro per svolgere le funzioni dell'organo. Tradizionalmente, le tecniche per l'analisi di biomolecole come metaboliti, glicani e proteine comportavano l'omogeneizzazione dei tessuti, distruggendo tutte le informazioni spaziali. Questi metodi tradizionali hanno inibito la comprensione completa delle complesse interazioni molecolari intra ed extracellulari. L'imaging con spettrometria di massa (MSI), d'altra parte, non solo preserva le informazioni spaziali delle biomolecole nei tessuti, ma consente anche di rilevare più classi di analiti dalla stessa sezione di tessuto attraverso l'analisi sequenziale con una risoluzione quasi di una singola cellula. Questo ci permette di ricavare un quadro più completo delle interazioni molecolari tra diverse classi di biomolecole. Il protocollo qui presentato delinea i passaggi per eseguire l'imaging con spettrometria di massa di metaboliti, glicani legati all'N e peptidi triptici in sequenza dalla stessa sezione di tessuto con una risoluzione di 20 μm. Una considerazione coscienziosa dell'ordine in cui vengono visualizzate le classi di analiti, insieme a un'attenta gestione delle sezioni per garantirne l'integrità, consente di raccogliere più immagini di alta qualità dalla stessa sezione. Questi dati possono essere successivamente integrati con altri dati omici spaziali (trascrittomica, immunoistochimica, ecc.) raccolti da sezioni seriali, dove la stessa cellula può essere analizzata in queste sezioni adiacenti.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'imaging con spettrometria di massa (MSI) è una potente tecnica che consente il rilevamento e la visualizzazione di centinaia o migliaia di biomolecole da sezioni di tessuto sottile, senza la necessità di una conoscenza a priori delle esatte molecole presenti nel tessuto, il che la rende uno strumento eccellente per la scoperta di biomarcatori1. Sebbene diversi tipi di MSI siano utilizzati da diversi laboratori, tra cui la ionizzazione ElectroSpray a desorbimento (DESI)2,3, la ionizzazione ElectroSpray a desorbimento laser assistito da matrice infrarossa (IR-MALDESI)4 e la spettrometria di massa a ioni secondari (SIMS)5, la desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI) rimane la più comunemente utilizzata e la più versatile. La maggior parte delle classi di biomolecole può essere rilevata da MSI personalizzando la preparazione del campione, compreso il lavaggio/pretrattamento del tessuto, la digestione enzimatica e la matrice/solvente utilizzato 6,7. MALDI MSI è stato utilizzato per la rilevazione di metaboliti, lipidi, glicani, proteine e peptidi proteolitici.

Gli studi MSI sono stati utilizzati in una varietà di studi clinici e preclinici per comprendere meglio i meccanismi della malattia 8,9, migliorare la classificazione e la stadiazione del cancro10,11, prevedere l'esito del trattamento12, migliorare la diagnosi13 e determinare i margini molecolari del tumore14, tra gli altri. La maggior parte di questi studi si è concentrata sulla rilevazione di una sola classe di analiti. Tuttavia, è spesso interessante analizzare più di una classe di biomolecole dallo stesso campione. Tradizionalmente, ciò è stato eseguito con sezioni seriali di tessuti. Ma più recentemente, sono stati mostrati esempi di analisi sequenziale di più classi di analiti dalla stessa sezione di tessuto. Ad esempio, Yagnik et al. hanno dimostrato l'imaging lipidico del tessuto congelato seguito da MALDI Immunohistochemistry dalla stessa sezione per la classificazione del tipo di cellula15. Clift et al. hanno dimostrato l'applicazione sequenziale di PNGaseF, Collagenasi e Tripsina a sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina (FFPE) per l'imaging di glicani N-legati, proteine della matrice extracellulare e proteine generali, rispettivamente16. Escobar et al. hanno dimostrato l'analisi sequenziale di glicani legati all'N, O-GlcNAc e peptidi triptici dalla stessa sezione di tessuto congelato17. Questi tipi di esperimenti vengono realizzati attraverso un'attenta pianificazione sperimentale per analizzare prima gli analiti più facilmente perduti, seguiti da quelli più stabili nel tessuto. In molti casi, i lavaggi utilizzati per rimuovere classi di molecole indesiderate aiutano a migliorare altre classi di molecole6, una proprietà che può essere sfruttata, in cui ogni lavaggio che rimuove la matrice precedentemente applicata aiuta anche a migliorare il segnale della successiva classe di analiti da visualizzare.

Recentemente, abbiamo pubblicato un flusso di lavoro per l'analisi sequenziale di metaboliti, glicani legati all'azoto e peptidi triptici dalla stessa sezione del tessuto di carcinoma ovarico FFPE18. Qui, presentiamo il flusso di lavoro dettagliato per l'analisi di queste tre classi di biomolecole dalla stessa sezione di tessuto; una panoramica del protocollo è illustrata in dettaglio nella Figura 1. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo protocollo che descrive in dettaglio questo flusso di lavoro per l'imaging sequenziale da tessuto FFPE. In breve, le sezioni di tessuto vengono decerate con xilene prima di essere rivestite con matrice di 1,5-diamminonaftalene (10 mg/mL in acetonitrile al 50%) per l'imaging dei metaboliti in modalità ionica negativa. La matrice viene quindi rimossa, le sezioni reidratate e recuperate con l'antigene, prima di essere spruzzata con PNGasi F (0,1 μg/μL in bicarbonato di ammonio) per rilasciare glicani legati all'N in situ. Dopo l'incubazione, le sezioni vengono rivestite con matrice di acido α-ciano-4-idrossicinnamico (CHCA) (10 mg/mL in acetonitrile al 70%, acido trifluoroacetico allo 0,1%) e sottoposte a imaging in modalità ioni positivi. La matrice viene quindi rimossa di nuovo, la reidratazione e il recupero dell'antigene ripetuti e le sezioni vengono spruzzate con tripsina (0,075 μg/μL in bicarbonato di ammonio) e incubate prima di essere nuovamente rivestite con matrice CHCA (10 mg/mL in acetonitrile al 70%, acido trifluoroacetico allo 0,1%) e visualizzate in modalità ionica positiva. Tutte le soluzioni devono essere preparate fresche, immediatamente prima dell'uso e, se possibile, gli esperimenti devono essere eseguiti nell'arco di 3 giorni consecutivi. In caso di ritardi, le sezioni devono essere conservate in un congelatore a -80 °C in essiccazione.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo utilizza tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) raccolti da pazienti precedentemente non trattati sottoposti a chirurgia citoriduttiva primaria per carcinoma ovarico sieroso di alto grado. Tutti i dati clinici sono stati ottenuti dall'archivio del cancro ovarico del Dipartimento di Oncologia Ginecologica e Medicina Riproduttiva secondo i protocolli approvati dall'Institutional Review Board dell'Università del Texas MD Anderson. Il consenso informato scritto dei pazienti è stato ottenuto dal personale della reception e gli studi sono stati condotti in conformità con le linee guida etiche riconosciute.

1. Preparazione del campione per l'imaging dei metaboliti

NOTA: Questo protocollo presuppone che sezioni di tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina (spessore 4 μm) siano già state montate su vetrini da microscopio, poiché i campioni clinici devono generalmente essere sezionati all'interno di un nucleo di patologia clinica dagli istotecnici. Poiché il lavoro qui presentato viene eseguito sullo strumento TOF di riferimento, la misurazione TOF ortogonale allevia la necessità di vetrini conduttivi tradizionalmente utilizzati negli esperimenti MSI. L'uso di vetrini da microscopio standard è anche più favorevole ai flussi di lavoro standard nei laboratori di patologia clinica, oltre a consentire l'uso di tessuti d'archivio già presenti sui vetrini.

  1. Tracciare dei segni di riferimento ai quattro angoli del vetrino utilizzando un graffietto a diamante.
  2. Deparaffinizzare le sezioni mediante immersione in xilene di grado istologico per 3 min.
    NOTA: Lo xilene è nocivo e deve essere utilizzato in una cappa chimica.
  3. Immergere le sezioni in xilene fresco per 3 minuti.
  4. Lasciare asciugare il vetrino a temperatura ambiente.
  5. Posizionare la diapositiva in un target dell'adattatore per diapositive.
  6. Acquisisci un'immagine ottica del vetrino utilizzando uno scanner piano con risoluzione di 4.800 dpi.
  7. Creare una matrice MALDI sciogliendo 15 mg di 1,5-diamminonaftalene (DAN) in 1,5 mL di ACN al 50%. Sonicare fino a completa dissoluzione, ~5 min. Filtrare la soluzione della matrice prima di caricarla nel ciclo di campionamento.
    NOTA: Il DAN è un sospetto cancerogeno e deve essere utilizzato con dispositivi di protezione individuale adeguati. La spruzzatura della matrice deve essere eseguita in una cappa chimica.
  8. Spruzzare il vetrino con una soluzione DAN utilizzando uno spruzzatore robotizzato di reagenti con i seguenti parametri: Velocità del cingolo - 1.200 mm/s; Distanza tra i cingoli - 3 mm; temperatura dell'ugello - 60 °C; Altezza ugello - 40 mm; Portata - 100 μL/min; Passaggi - 4; N 2 Pressione - 10 psi; Modello - CC
  9. Applicare 0,5 μl di fosforo rosso sospeso in metanolo in una posizione nota sul vetrino.

2. Raccolta dei dati di imaging dei metaboliti

  1. Posizionare i vetrini preparati in un adattatore per vetrini II e caricarli in uno spettrometro di massa timsTOF fleX MALDI QTOF.
  2. Caricare il metodo appropriato per la raccolta dei dati in modalità ioni negativi in timsControl con tims OFF. Se lo strumento non era già in modalità ioni negativi, attendere almeno 25 minuti dopo aver cambiato polarità per l'equilibrio prima della calibrazione e della raccolta dei dati con i seguenti parametri dello strumento per i metaboliti: intervallo m/z - 50 - 600; Gamma di scansione laser - 16,0 μm sia in X che in Y; Dimensione del campo risultante - 20,0 μm sia in X che in Y; Colpi laser - 150; Fluenza laser - ~30%; Imbuto 1 RF - 150,0 Vpp; Imbuto 2 RF - 200,0 Vpp; RF multipolare - 200,0 Vpp; Energia di collisione - 10,0 eV; Collisione RF - 500.0 Vpp; Tempo di trasferimento - 55,0 μs; Memorizzazione PrePulse - 5,0 μs (Figura supplementare S1).
  3. Eseguire un profilo di destinazione (fare clic sul pulsante Genera ora ) e una regolazione della messa a fuoco (fare clic sul pulsante Regola ora ) nella scheda Portacampioni. Regolare la posizione del laser in X e Y, se necessario, sulla linguetta del laser per assicurarsi che il laser sia esattamente allineato con il mirino.
  4. Raccogli uno spettro di fosforo rosso sommando almeno cinque serie di colpi laser dal punto sul vetrino.
  5. Eseguire una calibrazione facendo clic sul pulsante Calibra nella scheda Calibrazione. Rimuovere eventuali picchi con intensità molto bassa o alto errore ppm.
    NOTA: Anche i cluster di fosforo (P2 e P4) generalmente danno un segnale molto debole. Il punteggio di calibrazione deve essere del 100% prima di fare clic su accetta. In caso contrario, cancella lo spettro sommato e acquisiscine uno nuovo.
  6. Avviare il software flexImaging . La GUI di acquisizione delle immagini si avvierà automaticamente.
  7. Selezionare Configura una nuova esecuzione di imaging nella finestra Scegli esecuzione di imaging .
  8. Scegliere Flusso di lavoro classico nella finestra Seleziona flusso di lavoro .
  9. Nella finestra Archiviazione dati , fornire un nome per l'esecuzione di imaging e una directory dei risultati per i dati.
    NOTA: gli spazi non devono essere utilizzati nei nomi dei file.
  10. Nella finestra Impostazioni di acquisizione , scegliere Regioni di misurazione definite dall'utente e digitare 20 nella casella Larghezza raster . Fare clic su Sfoglia per selezionare il metodo timsControl creato in precedenza.
  11. Nella finestra Immagine di esempio , fare clic su Sfoglia per selezionare l'immagine ottica acquisita utilizzando lo scanner piano.
  12. Nella finestra Teach Sample , eseguire un allineamento a tre punti tra l'immagine ottica e la diapositiva; quindi, spostare il supporto del campione sul primo fiduciale inciso sul vetrino e allineare il mirino in timsControl con una caratteristica distinta nell'incisione. Ingrandisci l'immagine (si consiglia il 100% di zoom), imposta l'immagine di esempio su Imposta punti di apprendimento e fai clic sulla stessa posizione nell'immagine ottica. Ripeti questo processo altre 2 volte per un totale di tre punti di apprendimento. Fare clic su Avanti per completare l'insegnamento.
  13. Fare clic su OK per uscire dalla procedura guidata di esecuzione della nuova imaging.
  14. Verificare l'accuratezza dell'insegnamento facendo clic sul pulsante Posiziona portacampioni nel software. Ingrandisci e fai clic su una caratteristica distinta del quarto punto fiduciale (inutilizzato) nell'immagine; il portacampioni si sposterà in questa posizione all'interno di timsControl. Verificate che il puntatore a croce sia allineato con la feature selezionata. Se non sono allineati, cancellare l'apprendimento in flexImaging e ripetere il processo di apprendimento per migliorare la precisione.
  15. Nel software, selezionare lo strumento Aggiungi regione di misurazione poligonale e delineare i tessuti da riprodurre. Ogni clic del mouse creerà un punto di ancoraggio. Premi il pulsante backspace sulla tastiera per rimuovere i punti, uno per uno. Una volta disegnata la regione, fare doppio clic con il mouse per chiudere il poligono.
  16. Controllare il segnale sparando il laser in alcuni punti all'interno del tessuto. Fare clic su una posizione nell'immagine utilizzando il pulsante Posiziona portacampioni , come nel passaggio 2.14, per controllare l'insegnamento. Lo spettro sarà dominato da picchi di matrice intorno a m/z 157 e 313; Ingrandisci la regione m/z al di sotto di 154 e 250-300 per mostrare molti picchi di metaboliti di piccole molecole e acidi grassi, rispettivamente. Regolare la fluenza laser secondo necessità per un segnale ottimale.
  17. Salvare il metodo timsControl.
  18. Avviare l'acquisizione delle immagini facendo clic sul pulsante Avvia esecuzione automatica nel software
    NOTA: L'imaging in modalità ioni negativi con matrice DAN consente di rilevare, tra gli altri, numerosi metaboliti del ciclo TCA, amminoacidi e acidi grassi.

3. Preparazione del campione per l'imaging dei glicani legati all'N

  1. Dopo aver rimosso il campione dallo spettrometro di massa, rimuovere la matrice DAN immergendo il vetrino in etanolo al 100% (200 proof) per 1 minuto.
  2. Reidratare il vetrino nei barattoli Coplin: etanolo fresco al 100% per 1 minuto; etanolo al 95% per 1 minuto; etanolo al 70% per 1 minuto; Acqua per 3 min; Acqua fresca per 3 min.
  3. Lasciare asciugare il vetrino per ~15 minuti.
  4. Eseguire il recupero dell'antigene immergendo il vetrino in 100 mM di tampone Tris (ottenuto sciogliendo 6,06 g di Tris Base in 500 mL di acqua e regolando il pH secondo necessità), pH 9, in un barattolo Coplin con un coperchio posizionato liberamente sulla parte superiore che viene posto in una camera di decloaking con 500 mL di acqua nella camera. Riscaldare a 95 °C per 20 min.
  5. Togliete il barattolo Coplin dalla camera di decloaking e mettetelo sul piano di lavoro a raffreddare per 20 minuti.
  6. Sostituisci lo scivolo con l'acqua dopo cinque cambi. Per i primi tre, versare metà della soluzione e sostituirla con acqua. Per gli ultimi due, versare tutta la soluzione e sostituirla con acqua.
  7. Lasciare asciugare completamente lo scivolo.
  8. Creare una camera di umidità per l'incubazione del vetrino dopo l'applicazione di PNGaseF. Tagliare un cerchio di una salvietta assorbente per coprire il fondo di una capsula di Petri di 100 mm di diametro. Arrotolare due salviette da laboratorio per creare cuscini su entrambi i lati della capsula di Petri (Figura 2). Aggiungere 8 ml di acqua per saturare queste salviette e mettere il coperchio sulla capsula di Petri e metterla in forno a 37 °C per almeno 30 minuti per preriscaldare.
    NOTA: L'interno del piatto dovrebbe apparire pieno di vapore.
  9. Preparare PNGaseF ricostituendo 100 μg di enzima liofilizzato in 200 μL di bicarbonato di ammonio 100 mM, pH 7,8 e vortex da miscelare. Trasferire la soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e diluire a 1 mL con acqua.
  10. Spruzzare il vetrino con PNGaseF utilizzando lo spruzzatore robotico di reagenti con i seguenti parametri. Utilizzare la pompa a siringa per applicazioni a basso volume/bassa portata: Velocità di pista - 1200 mm/s; Distanza tra i cingoli - 3 mm; temperatura dell'ugello - 45 °C; Altezza ugello - 40 mm; Portata - 25 μl/min; Passaggi - 15; N 2 Pressione - 10 psi; Modello - CC
  11. Posizionare il vetrino nella capsula di Petri preriscaldata, con il fazzoletto rivolto verso l'alto, con un'estremità su ciascuno dei cuscini per salviette da laboratorio. Riposizionare il vetrino e sigillare la capsula di Petri con una pellicola sigillante adesiva. Mettere in forno a 37 °C e posizionare un termoforo per rettili impostato a 40 °C sopra la capsula di Petri.
    NOTA: Ciò mantiene il coperchio la parte più calda del piatto e impedisce la formazione di condensa sul coperchio e la caduta sul tessuto, causando artefatti nelle immagini.
  12. Incubare il vetrino per 2 ore per consentire la digestione.
  13. Togliete il vetrino dalla capsula di Petri e lasciate asciugare per ~5 minuti.
  14. Realizzare la matrice MALDI sciogliendo 15 mg di acido α-ciano-4-idrossicinnamico (CHCA) in 1,5 mL di ACN al 70%, TFA allo 0,1%, 10 mM di fosfato di ammonio.
    NOTA: Il TFA è caustico e deve essere utilizzato in una cappa con adeguati dispositivi di protezione individuale.
  15. Sonicare fino a completa dissoluzione, ~5 min.
  16. Filtrare la soluzione della matrice prima di caricarla nel ciclo di campionamento.
  17. Spruzzare il vetrino con CHCA utilizzando lo spruzzatore robotizzato di reagenti con i seguenti parametri: Velocità del cingolo - 1.200 mm/s; Distanza tra i cingoli - 3 mm; Temperatura dell'ugello - 75 °C; Altezza ugello - 40 mm; Portata - 120 μl/min; Passaggi - 3; N 2 Pressione - 10 psi; Modello - HH
  18. Applicare 0,5 μl di fosforo rosso sospeso in metanolo in una posizione nota sul vetrino.

4. Raccolta dati di imaging dei glicani N -linked

  1. Posizionare i vetrini preparati nel target dell'adattatore per vetrini e caricarli nello spettrometro di massa MALDI QTOF.
  2. Caricare il metodo appropriato per la raccolta dei dati in modalità ioni positivi in timsControl. Se lo strumento non era già in modalità ioni positivi, attendere almeno 25 minuti dopo aver cambiato la polarità per l'equilibratura prima della calibrazione e della raccolta dei dati con i seguenti parametri dello strumento per i glicani: intervallo m/z - 700-3500; Gamma di scansione laser - 16,0 μm sia in X che in Y; Dimensione del campo risultante - 20,0 μm sia in X che in Y; Colpi laser - 200; Fluenza laser - ~25%; Imbuto 1 RF - 450,0 Vpp; Imbuto 2 RF - 500,0 Vpp; RF multipolare - 500,0 Vpp; Energia di collisione - 10,0 eV; Collisione RF - 2.700,0 Vpp; Tempo di trasferimento - 140,0 μs; Memorizzazione PrePulse - 14,0 μs (Figura supplementare S2).
  3. Eseguire un profilo target (fare clic sul pulsante Genera ora ) e una regolazione della messa a fuoco (fare clic sul pulsante Regola ora ) nella scheda Sample Carrier . Regolare la posizione del laser in X e Y, se necessario, sulla linguetta del laser per assicurarsi che il laser sia allineato con il mirino.
  4. Raccogli uno spettro di fosforo rosso sommando almeno cinque serie di colpi laser dal punto sul vetrino.
  5. Eseguire una calibrazione facendo clic sul pulsante Calibra nella scheda Calibrazione. Rimuovere eventuali picchi con intensità molto bassa o alto errore ppm.
    NOTA: Il punteggio di calibrazione deve essere del 100% prima di fare clic su Accetta. In caso contrario, cancella lo spettro sommato e acquisiscine uno nuovo.
  6. Aprire il file .mis precedentemente utilizzato per l'imaging dei metaboliti nel software.
  7. Salvare il file con un nuovo nome che indica che si tratta di dati glicani.
  8. In Modifica | Proprietà dell'esecuzione dell'imaging, modificare il metodo di acquisizione con il metodo del glicano desiderato.
  9. Cancellare l'insegnamento precedente utilizzando Modifica | Punti di insegnamento chiari.
    NOTA: La diapositiva non sarà nella stessa identica posizione dopo averla rimossa e ricaricata nell'adattatore per diapositive.
  10. Eseguire nuovi insegnamenti utilizzando Modifica | Imposta i punti di insegnamento; impostare 3 punti come è stato fatto nella procedura guidata di imaging originale (passaggio 2.12).
  11. Verificare l'accuratezza dell'insegnamento facendo clic sul pulsante Posiziona portacampioni nel software. Ingrandisci e fai clic su una caratteristica distinta del quarto punto fiduciale (inutilizzato) nell'immagine. Il portacampioni si sposterà in questa posizione all'interno di timsControl; Verificare che il puntatore a croce sia allineato con la feature selezionata.
    NOTA: Se il mirino non è allineato, cancellare l'insegnamento e ripetere il processo di apprendimento per migliorare la precisione.
  12. Salva il file.
  13. Controllare il segnale sparando il laser in alcuni punti all'interno del tessuto. Fare clic su una posizione nell'immagine utilizzando il pulsante Posiziona portacampione come nel passaggio 4.11 per verificare l'insegnamento. Confermare che lo spettro ha picchi di glicani abbondanti con picchi dominanti tipicamente a m/z 1.663 e 1.809. Regolare la fluenza laser secondo necessità per un segnale ottimale.
  14. Salvare il metodo timsControl.
  15. Avviare l'acquisizione delle immagini facendo clic sul pulsante Avvia esecuzione AutoXecute .

5. Preparazione del campione per l'imaging del peptide triptico

  1. Rimuovere la matrice CHCA immergendo il vetrino in etanolo al 100% (200 proof) per ~1 min
  2. Reidratare il vetrino nei barattoli Coplin come segue: Etanolo fresco al 100% per 1 minuto; etanolo al 95% per 1 minuto; etanolo al 70% per 1 minuto; Acqua per 3 min; Acqua fresca per 3 min.
  3. Lasciare asciugare il vetrino per ~15 minuti.
  4. Eseguire il recupero dell'antigene immergendo il vetrino in 100 mM di tampone Tris, pH 9, in un barattolo Coplin con un coperchio posizionato liberamente sulla parte superiore che viene posto in una camera di decloaking con 500 ml di acqua nella camera. Riscaldare a 95 °C per 20 min.
    NOTA: Questo secondo recupero dell'antigene è necessario per denaturare le proteine per un accesso più efficiente della tripsina ai siti di scissione.
  5. Togliete il barattolo Coplin dalla camera di decloaking e mettetelo sul piano di lavoro a raffreddare per 20 minuti.
  6. Sostituisci lo scivolo con l'acqua dopo cinque cambi. Per i primi tre, versare metà della soluzione e sostituirla con acqua. Per gli ultimi due, versare tutta la soluzione e sostituirla con acqua.
  7. Lasciare asciugare completamente lo scivolo.
  8. Preparare la tripsina ricostituendo 100 μg di enzima liofilizzato in 200 μL di acido acetico 100 mM e pipettare su e giù per mescolare. Aliquotare in dimensioni appropriate per l'esperimento (in genere 40 μL) e conservare a -20 °C.
  9. Preparare un'aliquota di 40 μl di tripsina aggiungendo 350 μl di bicarbonato di ammonio 100 mM, pH 7,8 e 39 μl di ACN. Mescola bene.
    NOTA: L'acetonitrile (10% ACN) aumenta l'attività della tripsina rispetto alla soluzione acquosa e riduce la tensione superficiale della soluzione da spruzzare19.
  10. Spruzzare il vetrino con tripsina utilizzando uno spruzzatore robotizzato di reagenti con i seguenti parametri. Utilizzare la pompa a siringa per applicazioni a basso volume/bassa portata: Velocità di pista - 750 mm/s; Distanza tra i cingoli - 3 mm; Temperatura dell'ugello - 30 °C; Altezza ugello - 40 mm; Portata - 10 μL/min; Passaggi - 12; N 2 Pressione - 10 psi; Modello - HH
  11. Posizionare un quadrato di salvietta assorbente sul fondo di una capsula Petri di 100 mm di diametro; assicurarsi che gli angoli tocchino appena il bordo del piatto e distribuire 1 ml di acqua sulla salvietta.
  12. Posizionare il vetrino sulla parte superiore della salvietta, con il fazzoletto rivolto verso l'alto, posizionare il coperchio sulla piastra di Petri e sigillare la piastra di Petri con una pellicola sigillante adesiva.
  13. Incubare il vetrino per 4 ore a 37 °C per consentire la digestione.
  14. Togliete il vetrino dalla capsula di Petri e lasciatelo asciugare per ~5 minuti.
  15. Realizzare la matrice MALDI sciogliendo 15 mg di acido α-ciano-4-idrossicinnamico (CHCA) in 1,5 mL di ACN al 70%, TFA allo 0,1%, 10 mM di fosfato di ammonio.
  16. Sonicare fino a completa dissoluzione, ~5 min.
  17. Filtrare la soluzione della matrice prima di caricarla nel ciclo di campionamento.
  18. Spruzzare il vetrino con CHCA utilizzando uno spruzzatore robotizzato di reagenti con i seguenti parametri: Velocità del cingolo - 1200 mm/s; Distanza tra i cingoli - 3 mm; Temperatura dell'ugello - 75 °C; Altezza ugello - 40 mm; Portata - 120 μl/min; Passaggi - 4; N 2 Pressione - 10 psi; Modello - HH
  19. Applicare 0,5 μl di fosforo rosso sospeso in metanolo in una posizione nota sul vetrino.

6. Raccolta dati di imaging di peptidi triptici

  1. Posizionare i vetrini preparati in un adattatore per vetrini e caricarli in uno spettrometro di massa TIMSTOF MALDI QTOF.
  2. Caricare il metodo appropriato per la raccolta dei dati in modalità ioni positivi in timsControl. Se lo strumento non era già in modalità ioni positivi, attendere almeno 25 minuti dopo aver cambiato la polarità per l'equilibratura prima della calibrazione e della raccolta dei dati utilizzando i seguenti parametri dello strumento per i peptidi: intervallo m/z - 600-4500; Gamma di scansione laser - 16,0 μm sia in X che in Y; Dimensione del campo risultante - 20,0 μm sia in X che in Y; Colpi laser - 200; Fluenza laser - ~25%; Imbuto 1 RF - 450,0 Vpp; Imbuto 2 RF - 500,0 Vpp; RF multipolare - 600,0 Vpp; Energia di collisione - 10,0 eV; Collisione RF - 3400.0 Vpp; Tempo di trasferimento - 180,0 μs; Memorizzazione PrePulse - 18,0 μs (Figura supplementare S3).
  3. Eseguire un profilo di destinazione (fare clic sul pulsante Genera ora ) e una regolazione della messa a fuoco (fare clic sul pulsante Regola ora ) nella scheda Portacampioni. Regolare la posizione del laser in X e Y, se necessario, sulla linguetta del laser per assicurarsi che il laser sia allineato con il mirino.
  4. Raccogli uno spettro di fosforo rosso sommando almeno cinque serie di colpi laser dal punto sul vetrino.
  5. Eseguire una calibrazione facendo clic sul pulsante Calibra nella scheda Calibrazione. Rimuovere eventuali picchi con intensità molto bassa o alto errore ppm. Verificare che il punteggio di calibrazione sia del 100% prima di fare clic su Accetta. In caso contrario, cancella lo spettro sommato e acquisiscine uno nuovo.
  6. Aprire il file .mis utilizzato in precedenza per l'imaging dei glicani.
  7. Salva il file con un nuovo nome che indica che si tratta di dati peptidici.
  8. In Modifica | Proprietà di esecuzione dell'imaging, modificare il metodo di acquisizione con il metodo peptidico desiderato.
  9. Cancellare l'insegnamento precedente utilizzando Modifica | Punti di insegnamento chiari.
    NOTA: La diapositiva non sarà nella stessa identica posizione dopo averla rimossa e ricaricata nell'adattatore per diapositive.
  10. Eseguire nuovi insegnamenti utilizzando Modifica | Imposta i punti di insegnamento; impostare tre punti come è stato fatto nella procedura guidata di imaging originale (passaggio 2.12).
  11. Verificare l'accuratezza dell'insegnamento facendo clic sul pulsante Posiziona portacampioni . Ingrandisci e fai clic su una caratteristica distinta del quarto punto fiduciale (inutilizzato) nell'immagine. Il portacampioni si sposterà in questa posizione all'interno di timsControl; Verificare che il puntatore a croce sia allineato con la feature selezionata.
    NOTA: Se il mirino non è allineato, cancellare l'insegnamento e ripetere il processo di apprendimento per migliorare la precisione.
  12. Salva il file.
  13. Controllare il segnale sparando il laser in alcuni punti all'interno del tessuto. Fare clic su una posizione nell'immagine utilizzando il pulsante Posiziona portacampione come al punto 6.11 per controllare l'insegnamento. Confermare che lo spettro ha abbondanti picchi peptidici con picchi dominanti tipicamente a m/z 944, 1.105 e 1.198. Regolare la fluenza laser secondo necessità per un segnale ottimale.
  14. Salvare il metodo timsControl.
  15. Avviare l'acquisizione delle immagini facendo clic sul pulsante Avvia esecuzione AutoXecute .

7. Colorazione istologica

NOTA: Sono disponibili diversi metodi per l'ematossilina e l'eosina. Qui viene presentato un metodo Carazzi modificato frequentemente utilizzato in questo laboratorio.

  1. Rimuovere la matrice CHCA immergendo il vetrino in etanolo al 100% per 1 minuto.
  2. Colorare il vetrino come segue: etanolo al 95% per 30 s; etanolo al 70% per 30 s; Acqua per 30 s; Ematossilina per 2 min; Acqua per 30 s; etanolo al 70% per 30 s; etanolo al 95% per 30 s; Eosina per 1 min; etanolo al 95% per 30 s; 100% etanolo per 30 s; Xilene per 2,5 min; Vetrino coprioggetti con supporto di montaggio.
  3. Lasciare asciugare il vetrino per >1 h e rimuovere eventuali bolle premendo delicatamente sul vetrino coprioggetti.
  4. Digitalizza con uno scanner digitale per diapositive.

8. Visualizzazione dei dati

NOTA: È possibile eseguire un'analisi approfondita con SCiLS Lab che esula dall'ambito di questo protocollo. Qui, descriveremo solo la creazione di file di base, la visualizzazione dei dati e la ricerca di picchi rispetto ai database per l'identificazione putativa.

  1. Avvia SCiLS Lab 2025b e scegli Nuovo.
  2. Selezionare i file di dati da caricare nel software.
    NOTA: Con SCiLS Lab Pro, è possibile caricare insieme più file di dati raccolti con gli stessi parametri per la normalizzazione reciproca e visualizzarli contemporaneamente.
  3. Disponi i campioni nel layout preferito. Sposta i campioni facendo clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinandoli. Ruota i campioni facendo clic con il pulsante destro del mouse e trascinandoli. Seleziona Avanti.
  4. Nella finestra Impostazioni asse di massa , apportare le modifiche necessarie. I valori predefiniti in genere funzionano bene per i dati timsTOF. Fare clic su Avanti.
  5. Nella finestra Ricerca funzionalità , impostare i valori appropriati per il prelievo automatico dei picchi durante l'importazione. Fare clic su Avanti.
    NOTA: Questo non funziona bene per i dati sui metaboliti del tessuto FFPE e dovrebbe essere saltato.
  6. Le impostazioni di importazione verranno visualizzate nella finestra Riepilogo importazione . Fai clic su Importa.
  7. Fornire un nome file e una posizione in cui salvare il file SCiLS.
    NOTA: A seconda delle dimensioni del file, l'importazione potrebbe richiedere da alcuni minuti a diverse ore.
  8. Al termine, sarà visibile una finestra di riepilogo . Fare clic su Apri set di dati importati per interagire con il file SCiLS.
  9. In alto a destra del software, fai clic sul menu a discesa accanto a Normalizzazione e seleziona Root Mean Square.
    NOTA: Questo è il metodo più appropriato per i dati timsTOF data la scarsità dei dati del centroide importati e fornirà la migliore visualizzazione.
  10. In File | Proprietà file, impostare la larghezza dell'intervallo su un valore appropriato, in genere 10 - 15 ppm per i dati timsTOF. Verificare che il valore sia appropriato valutando se si estende sull'ampiezza di un picco nello spettro medio.
  11. Ingrandisci lo spettro medio nella parte inferiore del software, facendo clic e trascinando o ruotando la rotellina del mouse in avanti.
  12. Seleziona un picco da visualizzare posizionando il mirino all'apice e facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sulla rotellina del mouse.
  13. Aggiungi ioni di interesse all'elenco attivo di Immagini ioniche premendo Ctrl + barra spaziatrice.
  14. Salvare l'elenco delle funzioni curate facendo clic sul pulsante Salva come elenco funzioni nella parte inferiore della finestra delle immagini ioniche sul lato destro del software.
  15. Aprire un elenco di funzioni salvate facendo clic su File | Tabella delle funzioni e ricerca utilizzando MetaboScape di metaboliti putativi o ID di glicani, se MetaboScape è installato e configurato sulla stessa rete. In alternativa, convertire i file SCiLS in file .imzML per l'importazione in METASPACE (https://metaspace2020.org/) per l'identificazione putativa.
    NOTA: Una descrizione completa delle capacità di SCiLS Lab è disponibile nel Manuale dell'utente sotto l'opzione del menu Aiuto .

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il completamento di questo protocollo dovrebbe portare a tre robusti set di dati MSI dalla stessa sezione di tessuto. Nella visualizzazione dell'intero spettro dei dati dei metaboliti, lo spettro sarà fortemente dominato dai picchi della matrice a m/z 157 e 315. Questo è normale per il tessuto FFPE. Molti segnali di metaboliti e acidi grassi saranno osservati ingrandendo gli intervalli m/z <155 e tra 250 e 300. La Figura 3 mostra esempi dello spettro completo e degli intervalli ingranditi...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La raccolta di dati MSI sequenziali da una singola sezione di tessuto richiede un'attenta attenzione ai dettagli. Ci sono alcuni passaggi che sono assolutamente cruciali per ottenere dati di alta qualità. Innanzitutto, è necessario prestare attenzione se si prepara più di un vetrino contemporaneamente. Quando si posizionano i vetrini o ci si sposta tra i barattoli Coplin, fare attenzione a non posizionare due vetrini nella stessa posizione nel barattolo. Ciò comporterà un'esposizione ina...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'EHS e l'Università del Texas presso la Austin Mass Spectrometry Imaging Facility sono supportati da un Cancer Prevention and Research Institute of Texas Award (RP240559). Questa ricerca è stata finanziata in parte dall'Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 e 891490), dalla Sie Foundation e dallo Stephanie C. Stelter Endowment Fund. Questa ricerca è stata eseguita in collaborazione con la Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, che è supportata in parte dal National Institutes of Health attraverso il Cancer Center Support Grant P30 CA016672 di MD Anderson e lo specialista di ricerca NCI 1 R50 CA243707-01A1 di Jared Burks.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5-diamminonaftaleneFisher ScientificoD010125GMatrice MALDI per l'imaging dei metaboliti
AcetonitrileFisher ScientificoPannello A955-4Solvente di grado LC-MS utilizzato per la preparazione della matrice
Acido &alfa;-ciano-4-idrossicinnamicoSigma-Aldrich70990-1G-FMatrice MALDI per l'imaging di glicani e peptidi
Bicarbonato di ammonioFisher ScientificoA643-500Tampone per enzimi
Fosfato ammonicoSigma-AldrichNumero 467782-50GAdditivo per ridurre i cluster di matrici durante l'imaging
Camera di decloaking NxGenBiocare MedicaleN/AUtilizzato per il recupero dell'antigene dei tessuti
EtanoloFisher Scientifico04-355-223Solvente di grado LC-MS utilizzato per la preparazione e la colorazione della matrice
Spruzzatore robotizzato per reagenti M5HTX ImagingN/AUtilizzato per l'applicazione di enzimi e matrici ai tessuti
MetanoloFisher ScientificoA456-4Solvente di grado LC-MS per la produzione di sospensione di fosforo rosso
Tripsina di grado MSFisher ScientificoPI90058Enzima per la digestione delle proteine
Adattatore scorrevole MTP IIDaltonici Bruker8235380Adattatore per l'inserimento dei vetrini del microscopio nello spettrometro di massa
Scanner digitale per vetrini NanoZoomer SQHamamatsu CorpN/AUtilizzato per generare immagini di microscopia digitale di tessuti colorati
Scanner piano Perfection V600EpsonN/AUtilizzato per generare un'immagine ottica della diapositiva per la raccolta dei dati MSI
Sigillo di PetriFisher Scientifico50-212-518Per sigillare la capsula di Petri durante la digestione enzimatica
PNGaseFBiografia del BulldogNZPP550LYEnzima per la scissione dei glicani N-linked dalle proteine
Fosforo rossoSigma-Aldrich04004-250GCalibratore MALDI per modalità ioni positivi e negativi
Laboratorio SCiLS (2025b)Daltonici BrukerN/ASoftware per la visualizzazione dei dati MSI
timsTOF fleX Spettrometro di massa QTOFDaltonici BrukerN/AUtilizzato per la raccolta di dati di spettrometria di massa
Acido trifluoraceticoFisher Scientifico85183Additivo per matrici per diminuire il pH per l'imaging in modalità ionica positiva
Tris BaseFisher ScientificoBP152-500Tampone per il recupero dell'antigene
AcquaFisher ScientificoW64Solvente di grado LC-MS utilizzato per matrici, enzimi e colorazione
WypAll X60Fisher Scientifico19-413-113Salvietta assorbente per l'incubazione di enzimi umidificati
XileneFisher ScientificoX3P-1GALAgente compulsore per macchie

References

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