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Articolo metodologico

Profilazione spaziale completa di trascrittomi indipendenti dalla specie tramite Stereo-seq

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DOI:

10.3791/68619

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31 ottobre 2025

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1Department of Hematopoietic Biology and Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Veterinary Medicine & Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Genetics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo per eseguire una profilazione trascrittomica spaziale completa dell'RNA dell'ospite, virale, fungino e del microbioma da sezioni di tessuto incluse in paraffina fissate in formalina utilizzando Stereo-seq, che consente la mappatura ad alta risoluzione di diversi trascrittomi preservando l'architettura dei tessuti.

Abstract

La composizione spaziale delle cellule all'interno dell'ospite, così come i batteri o le cariche virali all'interno del tessuto, possono influenzare l'interazione dei tipi di cellule e degli analiti che guidano la cellula attraverso processi specifici del tipo di cellula. Lo stereo-seq per i tessuti FFPE utilizza il priming casuale su codici a barre spaziali, che è diverso dai metodi standard di trascrittomica spaziale, che utilizzano l'A'tailing per catturare l'RNA messaggero (mRNA) o basato su sonda per catturare i trascritti specie-specifici. Questi metodi non abbracciano le conoscenze più attuali sull'impatto e l'importanza di altri tipi di RNA da RNA lungo non codificante, RNA mitocondriale, microRNA o altre specie, RNA, come microbico, virale e fungino. Di seguito viene descritta una procedura passo-passo dal sezionamento dei tessuti alla preparazione della libreria per l'applicazione stereo-seq spaziale indipendente dalla specie con rilevamento dell'RNA utilizzando una metodologia di sonda casuale, compatibile con i tessuti inclusi in formalina fissata in paraffina (FFPE). Questo metodo Stereo-seq ha una perlina di cattura casuale di 0,22 μm di dimensione che si ripresenta in un array ogni 0,5 μm, consentendo la risoluzione subcellulare da una tecnologia basata sul sequenziamento. Poiché questo metodo rileva sia l'RNA ospite che quello non ospite, il protocollo richiede considerazioni specifiche per consentire la determinazione di ciò che si trova all'interno del tessuto rispetto a ciò che è stato depositato sul tessuto durante il processo di raccolta, conservazione, taglio e rilevamento (ad esempio, contaminanti ambientali e di manipolazione). Infine, questo protocollo consente di avere un'alta risoluzione (a singola cellula) di specie multi-RNA in un contesto spaziale, fornendo informazioni sull'intra e inter-attoma di tipi cellulari e specie patologiche.

Introduzione

Le tecnologie spazio-omiche hanno rivoluzionato lo studio dell'eterogeneità cellulare dei tessuti, consentendo la quantificazione simultanea di più bersagli, DNA (genomica), RNA (trascrittomica), metaboliti (metabolomica) o proteine (proteomica)1. La risoluzione di questi diversi saggi varia spesso, fornendo diverse limitazioni nella misurazione degli analiti, sia con una maggiore sparsità nella misurazione di una singola cellula 2,3 che nel contesto spaziale nativo4. Al contrario, i metodi di massa come il sequenziamento dell'RNA forniscono solo l'espressione genica media su interi campioni e oscurano l'eterogeneità cellulare2, o il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq)2,3, che richiede la dissociazione dei tessuti per il sequenziamento di singole cellule, spesso richiede il filtraggio. Pertanto, questi metodi escludono grandi cellule e aggregati, mentre i metodi bioinformatici cercano di rimuovere frammenti e doppietti, che inducono distorsioni 5,6,7. La trascrittomica spaziale conserva l'architettura dei tessuti, fornendo informazioni critiche sull'organizzazione e le interazioni cellulari. La maggior parte dei metodi di sequenziamento spaziale non mirati non ha una risoluzione a singola cellula, richiedendo quindi la deconvoluzione delle aree di cattura spaziale che contengono da 10 a 100 cellule 8,9,10. Tuttavia, nell'ultimo decennio, la trascrittomica spaziale ha superato le esigenze di questi metodi, poiché ci sono stati progressi nella risoluzione, aree di cattura più ampie e l'integrazione di approcci multi-omici, utilizzando strategie sperimentali o nuove tecniche 1,11,12.

Il sequenziamento omico a risoluzione spaziale avanzata (Stereo-seq) fornisce una risoluzione su scala nanometrica (500 nm) e un'area di cattura su scala centimetrica, con cattura trascrittomica completa indipendente dalla specie che consente la cattura di RNA codificante, non codificante e non ospite13. Questo metodo è attualmente la più alta risoluzione per la trascrittomica spaziale e dispone di opzioni per fornire i campi visivi più ampi. Tuttavia, questo metodo presenta alcune limitazioni notevoli, tra cui i requisiti di tempo e manodopera di circa 15 ore di tempo pratico, che coprono 4 giorni per completare le librerie pronte per il sequenziamento. In confronto, altre tecnologie di trascrittomica spaziale basate sul sequenziamento, come la trascrittomica spaziale basata su sonda, la trascrittomica spaziale basata su array di cattura polyA, Slide-seq e la codifica a barre deterministica nei tessuti per il sequenziamento omico spaziale (DBiT-seq) richiedono in genere da 5 a 8 ore di tempo pratico in 2 o 3 giorni (Tabella 1). Per molti ricercatori, questi progressi superano le sfide tecniche e sono ideali per la costruzione di atlanti spaziali trascrittomici completi per studiare la progressione della malattia a livello cellulare e subcellulare, in particolare se stratificati con altre tecnologie1.

Il protocollo Stereo-seq ha possibilità che vanno oltre la tradizionale trascrittomica dell'mRNA, che si basa su sonde poly-T per catturare i trascritti di mRNA poliadenilati. Questi metodi possono essere modificati aggiungendo la poliadenilazione a tessuti freschi14 o sonde specie-specifiche per set di geni predefiniti target15 per l'analisi dell'espressione spaziale. Invece, Stereo-seq utilizza sonde nucleotidiche casuali per selezionare diversi RNA indipendentemente dalla specie, inclusi RNA microbici, RNA fungini, RNA virali e RNA non poliadenilati come RNA potenziatori, RNA circolari e RNA lunghi non codificanti (lncRNA)16. In teoria, è possibile catturare RNA più piccoli o elementi riparativi come piccoli RNA interferenti (siRNA), microRNA (miRNA) e trasposoni17. Tuttavia, attualmente la bioinformatica e la mappatura di questi RNA rimangono impegnative e vengono spesso filtrate durante l'allineamento iniziale, che in genere utilizza un cutoff di 30 bp.

Di seguito è descritto un protocollo dettagliato, con le nostre modifiche per la cattura casuale dei nucleotidi da parte di un produttore su chip di nanosfere di DNA (DNB) per garantire una migliore comprensione e gestione di un protocollo Stereo-seq illustrato nella Figura 1. Questo protocollo include strategie per i biologi molecolari per testare nuovi tessuti FFPE su Stereo-seq con cattura nucleotidica casuale per produrre rese più coerenti e più elevate da campioni archiviati e tessuti adiposi di qualità inferiore. Il protocollo delineato è ottimizzato per i campioni di FFPE dalla maggior parte degli organi, indipendentemente dalla specie di origine. Tuttavia, questo protocollo non include le attuali modifiche necessarie per gestire tessuti difficili come il midollo osseo, che richiedono la decalcificazione.

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Protocollo

In questo documento sui metodi non vengono forniti dati clinici per il campione di paziente con carcinoma ovarico sieroso di alto grado naïve al trattamento. Tuttavia, i dati clinici associati sono stati raccolti seguendo protocolli approvati dall'Institutional Review Board (IRB) presso l'MD Anderson Cancer Center dell'Università del Texas, Dipartimento di Oncologia Ginecologica e Medicina Riproduttiva, dai partecipanti che hanno fornito il consenso informato scritto.

NOTA: Si raccomanda di indossare una maschera chirurgica e guanti durante l'intero protocollo per prevenire la contaminazione da RNasi. Si consiglia ai ricercatori con i capelli lunghi di tirarli indietro o addirittura di indossare una retina per capelli. Utilizzare sempre acqua sterile priva di nucleasi (NFW) e provette di DNA/RNA prive di nucleasi e a basso legame per massimizzare la resa. I tessuti non mammiferi, come i tessuti vegetali, possono richiedere l'ottimizzazione dell'aderenza, che coinvolge la poli-L-lisina (PLL) e tempi di permeabilizzazione prolungati a causa delle pareti cellulari. Sebbene la cattura molecolare rimanga teoricamente fattibile, è necessaria una convalida sperimentale poiché i tessuti vegetali non vengono testati nel nostro attuale flusso di lavoro.

1. Valutare la qualità dell'RNA e il valore di distribuzione dei frammenti di RNA 200 punteggi

  1. Valuta la qualità dell'RNA utilizzando il valore di distribuzione dei frammenti di RNA 200 (DV200), che misura la percentuale di RNA superiore a 200 bp.
  2. Utilizzare due sezioni da 10 μm dello stesso blocco di tessuto destinate all'elaborazione Stereo-seq.
    NOTA: L'elaborazione immediata è ottimale, ma i campioni possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 1 settimana, -20 °C per 4 settimane o -80 °C per 6 mesi.
  3. Estrarre l'RNA utilizzando un protocollo di estrazione selettiva dell'RNA senza dimensioni, come descritto da Patel et al.18 , per consentire una valutazione accurata della distribuzione delle dimensioni dei frammenti di RNA.
  4. Valutare la qualità dell'RNA con uno dei seguenti utilizzando un analizzatore di frammenti per determinare il punteggio DV200, o la percentuale di area sotto la curva che rappresenta frammenti di RNA più lunghi di 200 bp. Idealmente, il tessuto dovrebbe avere un punteggio DV200 (> 50%) e una concentrazione (> 10 ng/μL).

2. Pulizia dell'area di lavoro

  1. Pulire tutte le superfici con il 30% di candeggina. Lasciare asciugare le superfici per almeno 30 minuti per evitare la formazione di cloroformio dalla combinazione di candeggina ed etanolo.
  2. Pulire le superfici con salviette per la decontaminazione del DNA (DDW). Spruzzare su tutte le superfici con la soluzione di decontaminazione RNasi (RDS) e poi con etanolo al 70% preparato con NFW.
    NOTA: Non mescolare mai candeggina o altri alcolici. Questa combinazione ha prodotto cloroformio, che è altamente tossico e può causare perdita di coscienza, danni agli organi o morte anche a basse esposizioni.

3. Preparazione del chip di cattura casuale degli oligonucleotidi (N-chip) stereo-seq

  1. Pulire l'area di lavoro come descritto nei passaggi 2.1 e 2.2, inclusi tutti i sistemi utilizzati in questo passaggio.
  2. Rimuovi lo Stereo-seq N-chip dalla confezione, registra l'ID del chip e pulisci i bordi dello Stereo-seq N-chip e il vetrino con etanolo al 100% senza toccare il chip. Lasciare asciugare completamente all'aria.
  3. Applicazione di resina per fissare il truciolo alla slitta (opzionale per gli utenti che utilizzano xileni).
    NOTA: Sebbene gli agenti di pulizia non xilenici siano spesso raccomandati dai fornitori commerciali, è stato osservato che gli agenti di pulizia non xilenici possono essere meno efficaci a seconda della miscela di paraffina. Spesso non sono compatibili con alcune materie plastiche, resine sintetiche o tessuti incorporati nella cera d'api e non eliminano in modo efficiente le paraffine fortemente reticolate o ad alto punto di fusione. In caso di dubbi sulla composizione della paraffina utilizzata per l'inclusione del campione, si consiglia di utilizzare xileni per una chiarificazione ottimale. Inoltre, gli xileni sono in grado di eliminare meglio i tessuti adiposi, come il seno, le ovaie, gli ovuli o il tessuto cerebrale.
    1. Agitare o mescolare bene la resina per assicurarsi che sia bianca in modo omogeneo. Utilizzando una micropipetta, applicare con cautela 10 μl di resina ceramica a polimerizzazione UV attorno al bordo del chip Stereo-seq N (Figura 2A).
      NOTA: La resina può causare irritazione alla pelle e agli occhi e può portare a reazioni allergiche cutanee con l'esposizione ripetuta. Durante il pipettaggio o la manipolazione di questa resina, indossare sempre guanti in nitrile, occhiali di sicurezza e camice da laboratorio. Lavorare in un'area ben ventilata e indossare una maschera quando si utilizzano grandi volumi o se si riscalda la soluzione ed evitare il contatto diretto con la pelle o gli occhi.
    2. Utilizzare un tampone di schiuma sigillato, rimuovere la resina in eccesso, lasciando solo una linea sottile attorno al bordo del chip. Posizionare il vetrino nel dispositivo di polimerizzazione UV, assicurandosi di non toccare la superficie del truciolo.
    3. Posiziona il chip applicato con la resina sopra una maschera opaca sulla sorgente di luce UV da 405 nm per illuminare il retro del vetrino e polimerizzare per 5 minuti. Ciò è illustrato nella Figura 2B.
      NOTA: Non sovraesporre lo Stereo-seq N-chip ai raggi UV e non toccare la resina sulla superficie del chip, poiché potrebbe causare effetti dannosi alle nanosfere.
    4. Dopo l'indurimento, utilizzare tamponi di schiuma sigillati imbevuti di ciascuno dei seguenti elementi: etanolo di grado molecolare al 100%; 70% di etanolo; e infine NFW per pulire intorno al bordo dove è stata posizionata la resina. Se le macchie bianche si staccano, pulire nuovamente il bordo. Non toccare mai la superficie del truciolo (Figura 2C).
    5. Lasciare asciugare completamente lo scivolo all'aria. Dopo l'ispezione, conservare i trucioli per una notte a 4 °C con un essiccante, se necessario. Tuttavia, si consiglia di continuare immediatamente con la preparazione e il sezionamento dei trucioli, quando possibile.
      NOTA: Indossare sempre dispositivi di protezione individuale adeguati, compresi gli occhiali protettivi dai raggi UV, quando si lavora con la luce UV. Maneggiare l'etanolo e la resina in un'area ben ventilata, preferibilmente una cappa aspirante. Smaltire i materiali di scarto secondo le linee guida istituzionali.
  4. Preparazione di chip con poli-L-lisina (opzionale per tessuti adiposi o tessuti con problemi di aderenza.)
    1. Pulire l'area di lavoro come descritto nei passaggi 2.1 e 2.2, inclusi tutti i sistemi utilizzati in questo passaggio.
      NOTA: Non spruzzare sostanze chimiche direttamente nella macchina PCR. Per tutte le fasi pre-PCR, lavorare in una cappa PCR, se possibile, per prevenire la contaminazione, compresa la precedente amplificazione del cDNA.
    2. Immergere il chip tre volte in NFW fresco utilizzando una provetta conica da 50 mL.
    3. Asciugare il truciolo con aria compressa, utilizzando tutta la forza dell'aria compressa con un angolo di circa 60°-80° che attraversa diagonalmente (45°) la superficie del truciolo a circa 5 cm di distanza dalla superficie del truciolo (Figura 2E). Se la superficie appare torbida, ripetere il lavaggio con NFW fresco e asciugare nuovamente (la superficie nuvolata di solito significa che la ceramica non è stata sufficientemente lavata via o polimerizzata nei passaggi precedenti).
    4. Applicare 150 μl di soluzione PLL per coprire l'intera superficie del chip. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (da 22 °C a 25 °C). Ciò è illustrato nella Figura 2D.
    5. Rimuovere la soluzione PLL e lavare il chip due volte con acqua priva di nucleasi per 10-15 s.
    6. Asciugare accuratamente i bordi della diapositiva dopo il secondo lavaggio (senza toccare il truciolo).
    7. Asciugare saldamente il truciolo con aria compressa, utilizzando tutta la forza dell'aria compressa con un angolo di circa 60°-45° che attraversa diagonalmente la superficie del truciolo a partire da una distanza di circa 5 cm dalla superficie del truciolo (Figura 2E).
      NOTA: Il chip deve essere completamente asciutto entro 30 s o meno. Se ci vuole più tempo, il DNB verrà disturbato, causando artefatti nell'acquisizione.
    8. Procedere al montaggio entro 1 ora e mantenere il truciolo asciutto.
      NOTA: Se la superficie del truciolo appare torbida dopo l'asciugatura, lavare con NFW fresco e ripetere il processo di asciugatura. Se ci sono artefatti sulla superficie del chip dopo l'essiccazione, ciò può causare problemi di cattura in quelle aree. Evitare di usare PLL per aderire se il tessuto non lo richiede. Il contatto con il chip può causare graffi e perdita di aree di cattura prima del rilascio del cDNA o una cattura non uniforme dopo il rilascio. La resina sulla superficie del truciolo porta alla perdita maculata delle aree di cattura. Posizionare il chip troppo vicino all'ugello dell'aria compressa può creare cristalli e uno spruzzo di segni DBN danneggiati sulla superficie del chip; Tuttavia, questo è raro e di solito si verifica solo se l'ugello tocca quasi il chip e la bombola dell'aria compressa è troppo fredda. Si consiglia di esercitarsi più volte con i chip di valutazione, poiché questo passaggio è tecnicamente impegnativo.

4. Sezionamento e montaggio dei tessuti

  1. Assicurarsi che l'area di lavoro sia pulita come descritto nei passaggi 2.1 e 2.2. Assicurarsi che vengano utilizzate nuove lame e NFW per tutti i bagni d'acqua e il ghiaccio durante il sezionamento e il montaggio dei tessuti. Non toccare direttamente il chip e coprirne solo l'80% con un fazzoletto.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare uno spessore di 5 μm per i tessuti standard o di 4 μm per i tessuti ad alto contenuto di grassi. Utilizzare un nastro di sezioni seriali per abbinare le modalità tra i campioni, se applicabile.
  2. Asciugare i vetrini a 42 °C per 3 ore in forno o su una macchina per PCR con il coperchio aperto. Quindi trasferire i vetrini o modificare la temperatura sul forno o sulla macchina PCR a 37 °C e cuocere per una notte per 12-48 ore. Si consiglia di utilizzare circa 18 ore.
  3. Punto di arresto opzionale: Dopo l'essiccazione, sigillare i vetrini in sacchetti di alluminio con essiccante a 4 °C per un massimo di 1 settimana prima di procedere.
    NOTA: Tempi di asciugatura più lunghi possono ridurre l'integrità dell'RNA. Un'asciugatura troppo breve comporterà una minore adesione dei tessuti al vetrino. La cottura a una temperatura più elevata può ridurre l'integrità dell'RNA. I vetrini possono essere spediti per l'elaborazione esterna (ad esempio, l'analisi dell'ospite). Tuttavia, la spedizione non è consigliata per l'analisi del microbioma a causa dell'aumento della potenziale contaminazione durante il trasporto.

5. Deparaffinare i vetrini

  1. Assicurarsi che l'area di lavoro sia pulita come descritto nei passaggi 2.1 e 2.2.
  2. Preparare i reagenti per la deparaffinizzazione e il protocollo Stereo-seq.
    1. Aliquotare i reagenti necessari: due xileni da 30 mL in provette coniche da 50 mL, due 30 mL di etanolo al 100% in provette coniche da 50 mL.
    2. Preparare i seguenti reagenti diluiti con NFW: 96% di etanolo per chip (2 conici o 1 mL richiesti), 90% di etanolo per chip, 80% di etanolo per chip, 70% di etanolo per chip, 50% di etanolo per chip, 30% di etanolo per chip, 2,5 mL di 5x soluzione salina-citrato di sodio (SSC) da una soluzione 20x, 5 mL di 0,01N HCl (diluire 0,1N HCl con NFW a pH 2). Per le diluizioni di etanolo, preparare una soluzione da 30 mL in provette coniche da 50 mL o una soluzione da 500 μL in una provetta da 1,5 mL se si utilizzano guarnizioni in silicone.
    3. Preparare le seguenti soluzioni e tenerle in ghiaccio: i) 32,5 mL di SSC 0,1x da una soluzione 5x (conservare 30 mL di soluzione in una provetta conica e mettere gli altri 2,5 mL in una provetta da 5 mL per un uso futuro), ii) 400 μL di SSC 0,1x con IR al 5%, conservare in ghiaccio.
    4. Preparare i seguenti reagenti diluiti con 0,1 N HCl.
      1. Preparare una soluzione di reagente di permeabilizzazione (PR) 10x aggiungendo 1 mL di HCl 0,1 N al reagente liofilizzato fornito in commercio.
        NOTA: Tenere in ghiaccio solo per 1 ora, assicurarsi di aliquotare per un uso futuro e congelare a -20 °C.
      2. Preparare 500 μl di soluzione 1x PR (diluire un'aliquota di soluzione 10x PR con 0,01 N di HCl, tenere in ghiaccio per un massimo di 6 ore).
        NOTA: È fondamentale che il pH dell'HCl 0,01 N sia entro il 10% del pH 2,0, poiché gli enzimi a base di pepsina si comportano in modo ottimale a pH 2.
  3. Deparaffinare i vetrini immergendoli in xileni (consigliato) per 2 giri da 20 minuti ciascuno.
  4. Immediatamente, reidratare il campione con etanolo (100%, 96%, per 2 cicli, 5 minuti ciascuno, seguiti da 90%, 70%, 50% e 30% per 1 giro, 2 minuti). Infine, reidratare con NFW per 1 minuto. Per le diluizioni dell'etanolo, utilizzare 30 mL di soluzione in una provetta conica da 50 mL per ciascun vetrino se si preparano campioni per studi sul microbioma, oppure utilizzare 30 mL per ogni due vetrini se si preparano campioni non di microbioma. Per tutte le diluizioni successive, preparare 30 mL di soluzione in una provetta conica da 50 mL oppure, se si utilizzano guarnizioni in silicone, utilizzare 500 μL di soluzione per chip da 1 cm2 per coprire completamente l'area del chip.
    OPZIONALE: Si consiglia di posizionare una camera in silicone da un vetrino di rimozione a 3 camere attorno al chip per creare una tenuta dopo la fase di etanolo al 100%, come illustrato nella Figura 2F-H. Ciò consente l'uso di volumi minori di reagenti e riduce il rischio di danneggiare il chip. In alternativa, è possibile utilizzare provette coniche da 50 ml per immergere completamente il vetrino Stereo-seq durante tutta la procedura.

6. (Opzionale) Imaging nucleare e colorazione con ssDNA

NOTA: Lasciare che il reagente di reticolazione FFPE raggiunga la temperatura ambiente ( ~25 °C) prima dell'uso in 6.1. Sono possibili altre soluzioni di colorazione, ma la colorazione nucleare a fluorescenza è attualmente necessaria per la segmentazione di singole cellule e il binning cellulare dei dati trascrittomici.

  1. Colorazione a fluorescenza con colorante a filamento singolo di DNA (ssDNA)
    1. Preparare 2 μL di soluzione di colorazione ssDNA nel tampone SSC diluendo il reagente Qubit ssDNA con 5 tamponi SSC a una diluizione 1:1 per 1 o 2 chip.
      NOTA: La diluizione dell'ssDNA può cambiare in base al microscopio utilizzato durante l'imaging.  Pertanto, i nuovi microscopi dovrebbero essere testati con un set di diluizioni di coloranti ssDNA utilizzando un chip di valutazione e un tessuto di prova per determinare la migliore gamma dinamica.
    2. Creare una miscela master della soluzione colorante (200 μl per chip) utilizzando una diluizione 1:20 dell'inibitore della RNasi (RI), una diluizione 1:200 della diluizione dell'ssDNA e il restante SSC 5x.
    3. Aggiungere la soluzione colorante (150 μl per chip) e incubare al buio per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere delicatamente la soluzione colorante dall'angolo del chip utilizzando una pipetta.
      NOTA: Se si utilizza la camera in silicone rimovibile, rimuoverla prima di colorare il chip con la miscela di colorante ssDNA.
    4. Lavare il truciolo due volte con 0,1x SSC (150 μl per truciolo ogni volta) per 10-15 s. Asciugare accuratamente i bordi della diapositiva con carta per lenti dopo il secondo lavaggio (senza toccare il chip).
    5. Aggiungere ~3-5 μL di glicerolo (usarne meno per un microscopio invertito) per montare il cloverslip (fare attenzione alle bolle).
      NOTA: Assicurarsi che venga applicato il volume corretto di glicerolo sull'area del vetrino, in genere circa 4 μl per una chip da 1 cm2. L'uso di una quantità eccessiva di glicerolo può causare lo spostamento del vetrino coprioggetti quando il vetrino viene tenuto in verticale. L'uso di una quantità insufficiente di glicerolo aumenta il rischio di danni ai tessuti quando il vetrino coprioggetti viene rimosso e può introdurre bolle, che possono influire negativamente sui risultati dell'imaging e della segmentazione di singole cellule.
    6. Far cadere il vetrino coprioggetti da un'altezza di circa 1 cm sul chip. Se si utilizza un microscopio intervenuto, assicurarsi che il vetrino coprioggetti non scivoli via quando viene tenuto in verticale. Se lo fa, rimonta senza aggiungere altro glicerolo.
    7. Acquisisci immagini fluorescenti di tessuti colorati con ssDNA con un microscopio a campo largo con una sovrapposizione del 10% tra i riquadri dell'immagine.
      NOTA: Si consiglia di eseguire una mappa di messa a fuoco manuale di 9-13 punti con un microscopio a campo largo utilizzando un obiettivo 10x. È possibile utilizzare un microscopio confocale, ma è molto più sensibile ai cambiamenti focali nel tessuto e nel chip.
    8. Unisci in software di elaborazione delle immagini come ImageJ, utilizzando la sovrapposizione teorica per generare il posizionamento approssimativo di ogni piastrella e successivamente eseguire la sovrapposizione computazionale di corrispondenza dei pixel per mettere a punto la piastrellatura delle immagini
    9. Elabora le immagini nel software StereoMap e assicurati che il controllo qualità delle immagini venga superato prima di procedere.
    10. Immergere il vetrino Stereo-seq in 30 mL di SSC 0,1x fino a quando il vetrino coprioggetti non si stacca.

7. Processo di dereticolazione

NOTA: Evitare di toccare o inclinare il chip durante questa fase e pipettare delicatamente.

  1. Assicurarsi che il reagente di reticolazione FFPE sia a temperatura ambiente calda (~25 °C) e ispezionare per assicurarsi che non vi siano particelle che rendono la soluzione torbida. Se sono visibili particelle, riscaldare a 55 °C e raffreddare a 30 °C prima dell'uso.
  2. Accendere il termociclatore con le seguenti impostazioni: 30 °C per l'equilibratura (un coperchio riscaldato a 85 °C); 95 °C per un'incubazione di 30 minuti; Tempo di mantenimento infinito di 4 °C.
  3. Assemblare la guarnizione della cassetta, quindi posizionare la slitta per trucioli Stereo-seq nella cassetta.
  4. Aggiungere il reagente di reticolazione FFPE (400 μl per chip) nel pozzetto della cassetta contenente il chip. Applicare del nastro sigillante sulla cassetta e verificare che sia ben sigillata.
  5. Iniziare l'incubazione di 30 minuti a 95 °C dal punto 7.2. Trascorsi 10 minuti, mettere 10 mL di metanolo in un contenitore da 15 mL (sarà necessario circa 1 mL per vetrino) in un congelatore a -20 °C.
  6. Rimuovere con cautela il truciolo dal termociclatore, trasferire la cassetta sul banco e staccare il nastro sigillante.
  7. Rimuovere ed eliminare il reagente di reticolazione FFPE utilizzando una pipetta. Una volta rimossi tutti i reagenti di reticolazione, staccare ed eliminare la cassetta e la guarnizione.
  8. Equilibrare il vetrino Stereo-seq a temperatura ambiente ~23 °C. Sotto una cappa aspirante sterile, asciugare il bordo del vetrino e applicare una nuova camera di silicone (se applicabile). Aggiungere 500 μL di metanolo refrigerato dal congelatore a -20 °C, assicurandosi che l'intera sezione sia completamente sommersa per 20 minuti.
    NOTA: In alternativa, l'intero vetrino Stereo-seq può essere immerso in una provetta conica da 50 mL riempita con 30 mL di metanolo refrigerato.
  9. Preriscaldare la soluzione 1x PR su un blocco secco a 37 °C per 10 minuti prima dell'uso circa 5 minuti prima della fine della fissazione con metanolo (passaggio 7.8).
  10. Al termine del fissaggio, spostare il vetrino su una cappa aspirante sterile. Rimuovere il metanolo in eccesso sul vetrino e attendere l'evaporazione del metanolo rimanente sul chip (~5 min). Assemblare una nuova cassetta e una nuova guarnizione. Una volta che il metanolo è completamente evaporato, posizionare il vetrino per chip Stereo-seq nella cassetta.

8. Permeabilizzazione e trascrizione inversa

NOTA: Per i passaggi 8.1-8.11, pipettare lentamente e non toccare il chip. Una pressione eccessiva causerà diffusione o segni nei DNB.

  1. Aggiungere 200 μl di reagente di permeabilizzazione al chip. Applicare del nastro sigillante alla cassetta scorrevole Stereo-seq e assicurarsi che sia ben sigillata.
  2. Incubare a 37 °C per 30 min.
  3. Preparare il tampone di lavaggio aggiungendo 380 μl di SSC 0,1x e 20 μl di RI (inibitore dell'RNA) per ogni vetrino. Preparare 400 μl per vetrino e tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
  4. Estrarre i reagenti per la trascrizione inversa FFPE (FFPE RT), quindi centrifugare tutti i seguenti e mantenere la miscela enzimatica, gli oligo e i dimeri sul ghiaccio. Riscaldare il tampone FFPE RT a temperatura ambiente (~23 °C).
  5. 5 min prima della fine della permeabilizzazione, preparare 200 μl per chip di miscela FFPE RT. Aggiungere il tampone FFPE RT (158 μL), la miscela enzimatica FFPE RT (30 μL), l'oligo FFPE RT (10 μL) e il dimero FFPE (2 μL). Mescolate delicatamente e tenetelo in ghiaccio.
  6. Mantenendo il chip sul termociclatore, modificare la temperatura di incubazione a temperatura ambiente (~23 °C). Rimuovere il sigillo ed eliminare delicatamente la soluzione 1x PR.
  7. Lavare il truciolo molto delicatamente con 200 μl di SSC 0,1x (con 5% di RI) per 1 cm2 chip.
  8. Rimuovere il lavaggio 0,1x SSC (con il 5% di RI) dall'angolo del chip.
  9. Aggiungere 200 μl di soluzione FFPE RT all'angolo del chip.
  10. Applicare del nastro sigillante alla cassetta scorrevole Stereo-seq e assicurarsi che sia ben sigillata; in caso contrario, l'evaporazione riduce la resa.
  11. Iniziare il protocollo FFPE RT incubazione reazione isotermica a 42 °C con coperchio riscaldato a 45 °C per (da 5 a 24 ore).
    NOTA: Si consiglia di incubare per 12-16 ore e di essere coerenti tra gli esperimenti.

9. Rilascio e purificazione del cDNA

NOTA: Per i passaggi 9.6-9.7, pipettare lentamente e non toccare il chip. Una pressione eccessiva causerà diffusione o segni nei DNB.

  1. Preparare 400 μl di tampone di rilascio del cDNA riscaldando il tampone di rilascio del cDNA a 55 °C per sciogliere l'eventuale precipitato formatosi.
  2. Equilibrare il tampone di rilascio del cDNA a una temperatura ambiente calda (25 °C). Non mettere sul ghiaccio.
  3. Far girare il tampone di rilascio del cDNA e l'enzima di rilascio del cDNA a 100 x g in una centrifuga da tavolo prima dell'uso.
  4. Preparare il tampone cDNA aggiungendo 20 μL di enzima di rilascio a 380 μL di tampone di rilascio cDNA.
  5. Mantenendo il chip sul termociclatore, modificare la temperatura di incubazione a temperatura ambiente (~23 °C). Rimuovere il sigillo e rimuovere delicatamente ed eliminare la soluzione FFPE RT.
  6. Lavare il truciolo una volta, incredibilmente delicatamente, con 0,1x SSC per truciolo (200 μl).
  7. Rimuovere 0,1x SSC dall'angolo del chip, pipettando con molta cautela.
  8. Aggiungere 400 μl della soluzione di rilascio di cDNA preparata a ciascun chip.
  9. Sigillare la cassetta dei vetrini Stereo-seqs applicando del nastro sigillante (o del coperchio PCR) sulla cassetta. Assicurarsi che la cassetta sia sigillata ermeticamente per evitare evaporazione, perdite o contaminazione.
  10. Incubare a 55 °C per ≥ 5 ore (minimo da 5 ore fino a 24 ore) con coperchio riscaldato a 60 °C.
    NOTA: Si consiglia di incubare per 5-7 ore o di essere coerenti tra gli esperimenti con 2 ore.

10. Raccogliere la miscela di rilascio del cDNA

  1. Preriscaldare NFW a 37 °C (almeno 500 μl per chip da 1 cm2).
  2. Rimuovere il sigillo e pipettare energicamente in ogni angolo e centro del chip sopra il fazzoletto, ma non raschiare o toccare il fazzoletto. Raccogliere tutta la miscela di rilascio di cDNA dal chip e trasferirla in una provetta da centrifuga da 1,5 o 2,0 mL. Registrare i numeri di identificazione del chip (ID chip) su ogni tubo.
  3. Aggiungere 350 μl di NFW preriscaldato direttamente sulla superficie del chip. E ancora una volta pipettare energicamente con una pipetta più piccola (P100 o P200), inclinando la punta per applicare una maggiore forza di taglio, ma senza toccare il tessuto o raschiare il chip.
  4. Combinare il lavaggio del passaggio 10.3 (350 μl) con la miscela di rilascio del cDNA del passaggio 10.2 (400 μl). Assicurati di combinare solo i campioni di un singolo chip.
  5. Posizionare 100 μL di NFW sul chip, sigillare il vetrino del chip Stereo-seq nella cassetta e conservarlo in frigorifero fino alla fine del protocollo.
    NOTA: In caso di bassa resa, prendere in considerazione il rilascio del cDNA. La presenza di DNA sul chip può essere valutata utilizzando un colorante ssDNA e reimaging con o senza vetrino coprioggetti.

11. Raccogliere la pulizia della perlina di cDNA

  1. Risospendere il cDNA del passaggio 10.4 con un volume uguale di perle di immobilizzazione reversibile in fase solida (SPRI). Mescolare fino a quando le perle non sono distribuite uniformemente in tutta la soluzione per selezionare frammenti di DNA superiori a ~100 bp.
  2. Incubare per 10 minuti a una temperatura compresa tra 27 °C e 37 °C (30 °C consigliati).
    1. Durante l'incubazione. Preparare 5 ml di etanolo fresco all'80% in NFW per ogni 2 chip lavorati.
  3. Prelevare le provette con la miscela di perle incubate e centrifugare brevemente a 100 x g su una centrifuga da tavolo.
  4. Posizionare le provette su un rack di separazione magnetico e incubare per almeno 5 minuti (fino a quando il liquido diventa limpido).
  5. Rimuovere con cura il surnatante senza disturbare le perle e conservarlo in un tubo pulito con etichetta. Etichetta di rilascio del cDNA con ID chip e data.
  6. Aggiungere 1,5 mL di etanolo all'80% alle provette senza disturbare le perle e incubare per 30 s prima di rimuovere l'etanolo.
  7. Ripetere il passaggio 11.6 un'altra volta, questa volta rimuovendo quanto più etanolo possibile utilizzando una piccola punta per pipetta senza disturbare le microsfere.
  8. Asciugare all'aria le perle nei tubi fino a quando non sono più riflettenti. Il tempo varia, quindi controlla regolarmente per evitare che si secchi eccessivamente (crepe), che si tradurranno in una bassa resa.
    NOTA: Misurare l'umidità e la temperatura della stanza. Ad alte temperature (27 °C) e bassa umidità (meno del 20%), le perle si asciugano molto rapidamente (da 3 a 5 minuti). A basse temperature (23 °C) e ad alta umidità (più del 40%), le perle si asciugano molto più lentamente (da 7 a 15 minuti).
  9. Rimuovere i tubi di perlina dal rack del magnete, aggiungere 22 μL di NFW e mescolare a vortice.
  10. Incubare in un bagno asciutto o in una macchina per PCR a 27 °C per 5-15 minuti.
  11. Centrifugare brevemente e riposizionare la provetta sulla griglia di separazione magnetica fino a quando il liquido non diventa limpido (da 2 a 5 minuti).
  12. Trasferire 21 μL di surnatante contenente cDNA nella provetta PCR da 0,2 mL marcata con il campione senza disturbare le microsfere.
  13. Ripetere i passaggi da 11.9 a 11.12 per ciascuna provetta, raccogliendo un totale di 42 μL di cDNA. Proseguire direttamente con l'amplificazione del cDNA (passaggi da 12.1 a 12.8).
    NOTA: Il ritardo nell'avvio dell'amplificazione comporterà una diminuzione della resa, un aumento delle letture brevi e la degradazione del modello di DNA a filamento singolo.

12. Amplificazione del cDNA

  1. Rimuovere la miscela di amplificazione del cDNA e i primer FFPE cDNA dal congelatore e posizionarli su ghiaccio umido per scongelarli.
  2. Centrifugare la miscela di amplificazione del cDNA e i primer FFPE del cDNA su una centrifuga da tavolo a ~100 x g.
  3. Aggiungere 50 μl di soluzione di amplificazione del cDNA e 8 μl di primer FFPE cDNA a ciascuna provetta di cDNA da 42 μl da (passaggio 11.13) e posizionarla in un termociclatore con l'adattatore a tappo piatto per evitare la deformazione della provetta.
  4. Eseguire il programma del termociclatore per l'amplificazione del cDNA: denaturazione iniziale: 95 °C per 5 min; cicli: [98 °C per 20 s, 58 °C per 20 s, 72 °C per 3 min] × 15 cicli; allungamento finale: 72 °C per 5 min; temperatura di mantenimento: 12 °C (in caso di lavorazione immediata) / 4 °C (in caso di mantenimento notturno).
  5. Misurare la concentrazione di DNA di 1 μL di cDNA prima e dopo la pulizia delle microsfere.
    NOTA: La quantità di prodotto cDNA prima della purificazione deve essere calcolata in modo da superare 1 μg per ogni chip da 1 cm². La concentrazione post-purificazione deve essere di almeno 10 ng/μL. Rese inferiori sono tipicamente associate a una ridotta diversità delle librerie. Una significativa perdita di campione in questa fase è correlata con i punteggi DV200; tuttavia, DV200 non è un perfetto predittore dei risultati.
  6. Ripetere la pulizia delle microsfere di cDNA dai passaggi 11 (pulizia delle microschele) utilizzando il prodotto PCR dal passaggio 12.4, con tre modifiche: utilizzare un rack magnetico PCR più piccolo, aggiungere solo 200 μL di etanolo all'80% nel passaggio 11.6 e risospendere in 22 μL di tampone Tris-EDTA (TE) (pH 8) al passaggio 11.9.
  7. Conservare le perle in una provetta con 20 μL di NFW, etichettate con i nomi dei campioni, il codice a barre, la data e l'ID del chip.
  8. Misurare la distribuzione dei frammenti di cDNA utilizzando un analizzatore di frammenti. L'intervallo di dimensioni del frammento dovrebbe essere compreso tra 250 e 400 bp. Se i frammenti sono troppo piccoli, ripetere la pulizia delle perline, ma utilizzare la temperatura ambiente (~25 °C) invece di 27 °C.
    PUNTO DI ARRESTO OPZIONALE: Dopo aver misurato il cDNA, può essere conservato a -20 °C per un massimo di 1 mese e a -80 °C per un massimo di 1 anno. Le perle possono essere conservate in NFW per 1 settimana a 4 °C. Non congelare le perline.

13. Preparazione della biblioteca (giorno 4)

  1. Preparazione della miscela di reazione di amplificazione
    1. Rimuovere la soluzione di amplificazione PCR della libreria, i set di codici a barre della libreria, il prodotto cDNA e NFW. Scongelare il cDNA e i reagenti su ghiaccio e acqua a temperatura ambiente e centrifugare a 100 x g per 10 s.
  2. Determinare la strategia del codice a barre della libreria per ogni 25 μL di miscela di primer per codici a barre PCR.
    NOTA: Per questo sequenziatore, tutte le basi devono essere rappresentate allo stesso modo in ogni posizione in un set di codici a barre. La maggior parte dei kit commerciali compatibili con questo sono quindi progettati con tetrade con codici a barre predefiniti (set da quattro). Queste tetrade possono essere applicate a singoli campioni quando si dividono su una corsia di sequenziamento, oppure possono essere raggruppate insieme per un singolo campione quando si sequenzia un campione per corsia. Mantenere i codici a barre bilanciati è fondamentale, poiché i codici a barre sbilanciati ridurranno la quantità di dati utilizzabili generati dal sequenziatore.
  3. Determinare il volume di cDNA per 20 ng (ad esempio, 10 ng/μL richiederebbero 2 μL). Usando questo, crea una soluzione NFW (25 μL) di cDNA diluito (diluito a ~1 ng/μL).
  4. Combinare la miscela di amplificazione della libreria (50 μL) con il cDNA diluito in NFW (25 μL) e la miscela di primer per codici a barre PCR (25 μL) nella provetta PCR da 0,2 mL.
  5. Mescolare il pozzetto pipettandolo e centrifugare a 100 x g per 10 s. (Non vortice)
  6. Inserire le provette PCR da 0,2 ml nel termociclatore e assicurarsi di avere un inserto per evitare che le provette vengano schiacciate.
  7. Eseguire il programma del termociclatore per l'amplificazione del cDNA: denaturazione iniziale: 95 °C per 5 min; cicli: [98 °C per 20 s, 58 °C per 20 s, 72 °C per 3 min] × 8 cicli; allungamento finale: 72 °C per 5 min; temperatura di mantenimento: 12 °C (in caso di lavorazione immediata) / 4 °C in caso di mantenimento notturno.
    NOTA: È possibile utilizzare quantità variabili di cDNA in ingresso per preparare la libreria. Tuttavia, la quantità utilizzata influenzerà il numero di cicli di PCR necessari per l'amplificazione. Ad esempio, il fornitore raccomanda 20 ng di DNA in ingresso e l'uso di 8 cicli. È anche possibile utilizzare 40 ng con 7 cicli o 80 ng con 6 cicli. Si sconsiglia l'uso di meno di 20 ng o più di 80 ng di cDNA in ingresso.

14. Pulizia delle perline di amplificazione della libreria

  1. Quantificare il prodotto della libreria non elaborata come fatto nel passaggio 12.5.
  2. Ripetere la pulizia delle microsfere dal passaggio 11 (pulizia delle microschele) utilizzando il prodotto grezzo della libreria dal passaggio 13.7 con tre modifiche: utilizzare un rapporto tra perlina e prodotto di 0,8:1, utilizzare un rack magnetico PCR più piccolo, utilizzare solo 200 μL di etanolo all'80% rispetto al passaggio 11.7 e risospendere in 22 μL di tampone TE (pH 8) al passaggio 11.9. Preparare circa 1 ml di etanolo fresco all'80% per due patatine da 1 cm2 .
  3. PUNTO DI ARRESTO OPZIONALE: Dopo aver misurato la libreria, può essere conservata a -20 °C per un massimo di 1 mese e a -80 °C per un massimo di 1 anno. Le perle possono essere conservate a NFW per 1 settimana a 4 °C. Non congelare le perline.

15. Sistema DNBSEQ-T7RS per il sequenziamento di DNB innescati con oligonucleotidi casuali Stereo-Seq

  1. Utilizzando un kit PE75 sul sistema DNBSEQ-T7RS, allocare i cicli come 25 per la lettura 1 e 62 per la lettura 2 (PE25+62), seguiti da un indice di 10 bp:
    1. La prima lettura (lettura 1 di 25 cicli) acquisisce l'ID chip spaziale (CID) o le informazioni specifiche della posizione dai codici a barre basati su chip.
    2. La seconda lettura (lettura 2 di 62 cicli) cattura l'identificatore molecolare (MID), una sequenza casuale di 6 bp, direttamente attaccata agli inserti genici con 3 cicli di buio aggiuntivi utilizzati per la correzione della fase e la calibrazione dell'offset del codice a barre. Questo è seguito da un inserto genico di 30-59 bp dalla lettura 2, che viene identificato mappando genomi o trascrittomi noti.
      NOTA: Sono possibili inserti genici più lunghi, ma richiederebbero diversi kit terminali accoppiati e modifiche al flusso di lavoro di mappatura.
    3. Il ciclo di indicizzazione per il demultiplexing copre 10 bps in base ai codici a barre di sequenziamento raggruppati nel passaggio 13.2.
      NOTA: Tempo di sequenziamento tipico di circa 10-12 ore per una cella a flusso da 75 PE. Il sequenziamento viene spesso eseguito presso un nucleo di sequenziamento o una struttura commerciale e non un processo interno per la maggior parte dei laboratori, in quanto richiede un DNBSEQ-T7RS o uno strumento di sequenziamento simile.

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Risultati

I dati seguenti dimostrano la capacità di eseguire la segmentazione di singole cellule utilizzando la pipeline SAW e la mappatura su RNA non poliadenilati come il tRNA (TRDMT1) da una sezione FFPE. I dati imparziali di Stereo-seq consentono di esaminare l'importanza non solo degli mRNA, ma anche dei tRNA, degli rRNA e degli RNA non ospiti (se pertinenti). Utilizzando l'output diretto della pipeline SAW16 e lo stereopy per la valuta...

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Discussione

Il protocollo Stereo-seq è altamente dettagliato e prevede diversi passaggi critici che richiedono precisione, tempismo e un ambiente pulito per garantire il successo, soprattutto con la profilazione del microbioma o non dell'ospite che può richiedere precauzioni specifiche.

È richiesto l'uso di acqua priva di nucleasi durante tutte le fasi e il chip di cattura non deve essere toccato con nient'altro che il campione e i reagenti. Prestare la massima attenzione...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che questo lavoro non è stato finanziato da Complete Genomics. Tuttavia, Complete Genomics sostiene i costi di pubblicazione di questo articolo.  Non è stata data loro una copia anticipata né un input sul contenuto.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata in parte dall'Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 e 891490), dalla Sie Foundation e dallo Stephanie C. Stelter Endowment Fund. Questa ricerca è stata condotta in collaborazione con la Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, il Dipartimento di Medicina e Chirurgia Veterinaria e l'Advanced Genomics Technology Core, che è supportata in parte dal National Institutes of Health attraverso il Cancer Center Support Grant P30 CA016672 di MD Anderson e lo specialista di ricerca NCI 1 R50 CA243707-01A1 di Jared Burks.

Vorremmo anche ringraziare Compete Genomics, in particolare Brandon Vanderbush e Tanzeen Yusuff per la formazione tecnica e la risoluzione dei problemi, così come Jia "Jackie" Zhao, Yongfu Wong ed Erin Petrilli. L'autore (o gli autori) ha ricevuto un set di FFPE OMNI e reagenti di sequenziamento, nonché l'accesso al programma di accesso anticipato T7, da Complete Genomics a un prezzo scontato. Inoltre, alcuni reagenti sono stati forniti gratuitamente per l'uso in questo studio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubi centrifughe da 1,5 mL DNAsi/RNAsi regolariThermo Fisher Scientific / Invitrogen3456Per mescolare i reagenti (le altre bande vanno bene) e nbsp;
100% etanoloSigma-AldrichE7023Grado molecolare
Tubi centrifughe sterili conici in polipropilene da 15 mLThermo Fisher Scientific / Invitrogen339650Utilizzato per aliquote 
20x Concentrate  Tampone di citrato di sodio salino (SSC)Sigma-AldrichS6639-1LUsato per fare 5 SSC per le macchie e 1 SSC per i passaggi di lavaggio e la rimozione del sottovesto.
Strumento bioanalizzatore 2100AgilentScontatiStrumento: Bioanalizzatore
Camera a 3 pozzi, rimovibileIbidi80381Camera in silicone per ridurre i volumi durante la reidratazione e la fissazione del metanolo.
Sorgente di luce UV da 405nmVariN/APer la polimerizzazione della resina UV
Tubi centrifughe sterili conici in polipropilene da 50 mLThermo Fisher Scientific / Invitrogen339652Utilizzato per aliquote e per la deparaffinizzazione 
Alcol isopropanolo sterile al 70%Texwipe TX3270Per la decontaminazione superficiale 
Kit di DNA ad alta sensibilità AgilentAgilent5067-4626Per la caratterizzazione da bioanalizzatore di cDNA e librerie
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513Per la caratterizzazione dell'RNA da bioanalizzatore
Lamina di alluminioVariN/APer coprire il vetrino durante la colorazione con ssDNA.
Beckman Coulter SPRIselectBeckman Coulter Scienze della Vita  B23317/B23318/B23319SPRI Beads cDNA e pulizia della biblioteca
CandegginaVariN/APulizia della postazione di lavoro per rimuovere la contaminazione da microbioma
Tamponi in schiuma sigillati CONSTIXContec19161023Per una pulizia precisa con resina
CoperturaSigma-AldrichBR470045-2000EA
Pacchetti DesiccantiVariN/AImpacchi essiccanti senza RNasi, senza polvere.
Mascherina usa e gettaThermo Fisher Scientific / Invitrogen12-888-001Protezione, contaminazione da RNAse e sterilità 
Salviette per la cancellazione del DNASigma-AldrichL9060-250EADecontaminazione pulendo le superfici (salviette umide)
Tubi di legame con DNA 1,5 mLEppendorf 22431021Utilizzato per la raccolta di cDNA e amplificazioni post-biblioteca.
Tubi di legame con DNA 2mLEppendorf 22431048Utilizzato per la raccolta del cDNA prima dell'amplificazione.
DNBSEQ OneStep Kit di Reagenti DNB MakeGenomica completa940-001891-00Reagenti per la preparazione e amplificazione delle nanosfere di DNA (DNB)
Kit per reagenti detergenti DNBSEQ-T7RSGenomica completa940-001903-00Cartuccia per lavare dopo il completamento della sequenziazione
Kit di reagenti di carico DNBSEQ-T7RS DNBGenomica completa940-001894-00Reagenti e piastre per caricare i DNB verso la cella di flusso
Cella di Flusso a Sequenziamento DNBSEQ-T7RSGenomica completa940-001902-001 corsia/cella di flusso
DNBSEQ-T7RS Kit di visualizzazione stereo-seq per la visualizzazioneGenomica completa940-001893-00La cartuccia e i reagenti per il sequenziamento.
Sistema DNBSEQ-T7RSGenomica completaQuesto set di visualizzazione stereo-seq utilizza la tecnologia DNBSEQ. Una corsa di sequenziamento inizia con l'ibridazione di un ancoraggio di DNA, poi una sonda fluorescente viene collegata al DNA Nanoball (DNB) utilizzando la chimica combinatoria del sequenziamento dell'ancora della sonda (cPAS). Infine, il sistema di imaging ad alta risoluzione cattura il segnale fluorescente. Dopo l'elaborazione digitale del segnale ottico, il sequencer genera informazioni di sequenziamento di alta qualità e accurate.
Aria compressa con polvereMatinM-6318È importante usare questo marchio o uno con propellente simile e nbsp;
Lame Microtome Edge-RiteThermo Fisher Scientific / Invitrogen4280LIstologia - Utilizzata durante la sezionazione dei campioni
Congelatore a prova di esplosioniVariN/ARaffreddare il metanolo prima e durante la fase di fissazione del metanolo.
Pennelli istologiciVariN/AIstologia - Utilizzata durante la sezionazione dei campioni
Acido cloridricoSigma-Aldrich2104-50MLPer diluire l'enzima di premuliablizzazione in 0,01 N HCl (pH 2). La concentrazione standard di stock per la soluzione di HCl è 0,1 N.
Sistema di imagingvariN/AGC Stomics Imager, Lecia, Evo Revolution
Soluzione di decontaminazione RNaseZap RNase InvitrogenThermo Fisher Scientific / InvitrogenAM9780Pulizia della postazione di lavoro rimuovendo la contaminazione da RNAse
Kimtech Delicate Task Tergicristalli  Kimtech34155Per asciugare banche, attrezzature, pipette, ecc.
Camice da laboratorioVariN/ADispositivi di Protezione Personale (DPI)
Carta per obiettiviThermo Fisher Scientific / Invitrogen11-997Vari lavori per asciugare i vetri senza sheading
Salviette per la cancellazione del DNA LookoutSigma-AldrichL9060Pulizia della postazione di lavoro per rimuovere la contaminazione da PCR
Rack di separazione Magentic 5uL - 0.2 Permagen LabwareMSRLV08Per la separazione delle perle nei tubi PCR
Rack Magjet 12x1,5 mLThermo Fisher Scientific / InvitrogenMR02Per la separazione delle perline in tubi da 1,5 mL
Microtomo rotatorio manualeLeicaRM2235Istologia - Utilizzata durante la sezionazione dei campioni
Methonal ≥ 99,9%, adatto all'immunofluorescenza, HPLCSigma-Aldrich34860Per fissare (deve essere di grado HPLC)
Pinze microdissecantiSigma-AldrichF4142-1EAIstologia - Utilizzata durante la sezionazione dei campioni
MicropipettaVariN/A
Acqua di grado molecolare senza nucleasi non trattata con DPECVariN/ADiluizioni ed eluzione delle perle
Guanti in nitriloVariN/APPE
FornoVariN/APer cuocere le patatine
Tubi PCR 0,2 mL con tappi attaccatiVariN/APer applicazioni PCR
Coperture PCR  VariN/ASostituzione se l'adesivo sulla copertura fornita è debole
Cappuccia PCR e Postazione di lavoroMystaireMY-PCR24-010Per i passaggi pre-PCR (RNA a cDNA)
Misuratore di pHVariN/AMisuratore di pH per confermare il pH HCl.
Soluzione di poli-L-lisinaSigma-AldrichA005-COpzionale per aumentare l'adesione dei tessuti alla scheggiatura
Fluorometro Qubit 4Thermo Fisher Scientific / InvitrogenD33226Inuterment; Misurazione delle quante del DNA
Kit di quantificazione del dsDNA per qubitThermo Fisher Scientific / InvitrogenQ32851Per la misurazione del cDNA e delle quantificazioni delle librerie
Kit per il test di qubit ssDNAThermo Fisher Scientific / InvitrogenD10212Colorazione ssDNA (Solo colorante utilizzato)
Blocco di ghiaccio senza RNAsiVariN/AIstologia - Utilizzata per sezionare i campioni per idratare i blocchi prima di sezionare
Soluzione di decontaminazione RNase RNaseZapThermo Fisher Scientific / InvitrogenAM9782Una soluzione di decontaminazione superficiale che distrugge gli RNA
RNeasy FFPE KitQiagen73504 & 19093Per l'estrazione di RNA e l'estrazione di RNA Misurazione DV200  
Sculpt Ultra White ResinSiraya TechN/AResina polimerabile ai raggi UV resistente ad alte temperature
Kit di preparazione della libreria di codici a barre Stereo-seq 16STOmics / Genomica Completa111KL160Per la costruzione della libreria OMNI FFPE a sequenze stereo
Kit accessorio FFPE Stereo-seqSTOmics / Genomica Completa310AK002Parti accessorie spaziali OMNI del kit 211SN114
Slide stereo-seq N-chip (1cm x 1cm)STOmics / Genomica Completa210CN114Chip OMNI spaziale parte del kit 211SN114
Adattatore PCR stereo-seq STOmics / Genomica Completa301AUX001Per i passaggi di ibridazione PCR modificati per adattarne tre, simili all'adattatore di ibridazione Situ PCRmax
Stereo-seq Transcriptomics N KitSTOmics / Genomica Completa211KN114Parte del kit 211SN114 Spatial OMNI regent
Progettazione chirurgica Lama di Rasoio Industriale GeneraleThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-812-236Istologia - Utilizzata durante la sezionazione dei campioni
pH della soluzione tampone TE 8.0Sigma-Aldrich8890Per eluzione di cDNA e librerie
Ciclatori termiciBioRad / vari1861096 /12015392 / variMacchina PCR con coperchio manuale o opzioni di pozzo profondo (T100 Thermal Cycler / PTC Tempo Deepwell Thermal Cycler, ecc.)
Kit tampone di pH All-in-One Thermo Scientific OrionThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-624-500
Bagno di galleggiamento tessuti - Digital XH-1003PrimaNC0779538Istologia - Utilizzata durante la sezionazione dei campioni
Occhiali protettivi UVVariN/APer sicurezza durante l'indurimento UV
XileniSigma-Aldrich247642Per la deparaffinizzazione

Riferimenti

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