Profilazione spaziale completa di trascrittomi indipendenti dalla specie tramite Stereo-seq

Summary

Questo articolo presenta un protocollo per eseguire una profilazione trascrittomica spaziale completa dell'RNA dell'ospite, virale, fungino e del microbioma da sezioni di tessuto incluse in paraffina fissate in formalina utilizzando Stereo-seq, che consente la mappatura ad alta risoluzione di diversi trascrittomi preservando l'architettura dei tessuti.

Abstract

La composizione spaziale delle cellule all'interno dell'ospite, così come i batteri o le cariche virali all'interno del tessuto, possono influenzare l'interazione dei tipi di cellule e degli analiti che guidano la cellula attraverso processi specifici del tipo di cellula. Lo stereo-seq per i tessuti FFPE utilizza il priming casuale su codici a barre spaziali, che è diverso dai metodi standard di trascrittomica spaziale, che utilizzano l'A'tailing per catturare l'RNA messaggero (mRNA) o basato su sonda per catturare i trascritti specie-specifici. Questi metodi non abbracciano le conoscenze più attuali sull'impatto e l'importanza di altri tipi di RNA da RNA lungo non codificante, RNA mitocondriale, microRNA o altre specie, RNA, come microbico, virale e fungino. Di seguito viene descritta una procedura passo-passo dal sezionamento dei tessuti alla preparazione della libreria per l'applicazione stereo-seq spaziale indipendente dalla specie con rilevamento dell'RNA utilizzando una metodologia di sonda casuale, compatibile con i tessuti inclusi in formalina fissata in paraffina (FFPE). Questo metodo Stereo-seq ha una perlina di cattura casuale di 0,22 μm di dimensione che si ripresenta in un array ogni 0,5 μm, consentendo la risoluzione subcellulare da una tecnologia basata sul sequenziamento. Poiché questo metodo rileva sia l'RNA ospite che quello non ospite, il protocollo richiede considerazioni specifiche per consentire la determinazione di ciò che si trova all'interno del tessuto rispetto a ciò che è stato depositato sul tessuto durante il processo di raccolta, conservazione, taglio e rilevamento (ad esempio, contaminanti ambientali e di manipolazione). Infine, questo protocollo consente di avere un'alta risoluzione (a singola cellula) di specie multi-RNA in un contesto spaziale, fornendo informazioni sull'intra e inter-attoma di tipi cellulari e specie patologiche.

Introduction

Le tecnologie spazio-omiche hanno rivoluzionato lo studio dell'eterogeneità cellulare dei tessuti, consentendo la quantificazione simultanea di più bersagli, DNA (genomica), RNA (trascrittomica), metaboliti (metabolomica) o proteine (proteomica)¹. La risoluzione di questi diversi saggi varia spesso, fornendo diverse limitazioni nella misurazione degli analiti, sia con una maggiore sparsità nella misurazione di una singola cellula ^2,3 che nel contesto spaziale nativo⁴. Al contrario, i metodi di massa come il sequenziamento dell'RN....

Protocol

In questo documento sui metodi non vengono forniti dati clinici per il campione di paziente con carcinoma ovarico sieroso di alto grado naïve al trattamento. Tuttavia, i dati clinici associati sono stati raccolti seguendo protocolli approvati dall'Institutional Review Board (IRB) presso l'MD Anderson Cancer Center dell'Università del Texas, Dipartimento di Oncologia Ginecologica e Medicina Riproduttiva, dai partecipanti che hanno fornito il consenso informato scritto.

NOTA: Si raccomanda di indossare una maschera chirurgica e guanti durante l'intero protocollo per prevenire la contaminazione da RNasi. Si co....

Results

I dati seguenti dimostrano la capacità di eseguire la segmentazione di singole cellule utilizzando la pipeline SAW e la mappatura su RNA non poliadenilati come il tRNA (TRDMT1) da una sezione FFPE. I dati imparziali di Stereo-seq consentono di esaminare l'importanza non solo degli mRNA, ma anche dei tRNA, degli rRNA e degli RNA non ospiti (se pertinenti). Utilizzando l'output diretto della pipeline SAW¹⁶ e lo stereopy per la valuta.......

Discussion

Il protocollo Stereo-seq è altamente dettagliato e prevede diversi passaggi critici che richiedono precisione, tempismo e un ambiente pulito per garantire il successo, soprattutto con la profilazione del microbioma o non dell'ospite che può richiedere precauzioni specifiche.

È richiesto l'uso di acqua priva di nucleasi durante tutte le fasi e il chip di cattura non deve essere toccato con nient'altro che il campione e i reagenti. Prestare la massima attenzione.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubi centrifughe da 1,5 mL DNAsi/RNAsi regolari	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	3456	Per mescolare i reagenti (le altre bande vanno bene) e nbsp;
100% etanolo	Sigma-Aldrich	E7023	Grado molecolare
Tubi centrifughe sterili conici in polipropilene da 15 mL	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	339650	Utilizzato per aliquote
20x Concentrate  Tampone di citrato di sodio salino (SSC)	Sigma-Aldrich	S6639-1L	Usato per fare 5 SSC per le macchie e 1 SSC per i passaggi di lavaggio e la rimozione del sottovesto.
Strumento bioanalizzatore 2100	Agilent	Scontati	Strumento: Bioanalizzatore
Camera a 3 pozzi, rimovibile	Ibidi	80381	Camera in silicone per ridurre i volumi durante la reidratazione e la fissazione del metanolo.
Sorgente di luce UV da 405nm	Vari	N/A	Per la polimerizzazione della resina UV
Tubi centrifughe sterili conici in polipropilene da 50 mL	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	339652	Utilizzato per aliquote e per la deparaffinizzazione
Alcol isopropanolo sterile al 70%	Texwipe	TX3270	Per la decontaminazione superficiale
Kit di DNA ad alta sensibilità Agilent	Agilent	5067-4626	Per la caratterizzazione da bioanalizzatore di cDNA e librerie
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent	5067-1513	Per la caratterizzazione dell'RNA da bioanalizzatore
Lamina di alluminio	Vari	N/A	Per coprire il vetrino durante la colorazione con ssDNA.
Beckman Coulter SPRIselect	Beckman Coulter Scienze della Vita	B23317/B23318/B23319	SPRI Beads cDNA e pulizia della biblioteca
Candeggina	Vari	N/A	Pulizia della postazione di lavoro per rimuovere la contaminazione da microbioma
Tamponi in schiuma sigillati CONSTIX	Contec	19161023	Per una pulizia precisa con resina
Copertura	Sigma-Aldrich	BR470045-2000EA
Pacchetti Desiccanti	Vari	N/A	Impacchi essiccanti senza RNasi, senza polvere.
Mascherina usa e getta	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	12-888-001	Protezione, contaminazione da RNAse e sterilità
Salviette per la cancellazione del DNA	Sigma-Aldrich	L9060-250EA	Decontaminazione pulendo le superfici (salviette umide)
Tubi di legame con DNA 1,5 mL	Eppendorf	22431021	Utilizzato per la raccolta di cDNA e amplificazioni post-biblioteca.
Tubi di legame con DNA 2mL	Eppendorf	22431048	Utilizzato per la raccolta del cDNA prima dell'amplificazione.
DNBSEQ OneStep Kit di Reagenti DNB Make	Genomica completa	940-001891-00	Reagenti per la preparazione e amplificazione delle nanosfere di DNA (DNB)
Kit per reagenti detergenti DNBSEQ-T7RS	Genomica completa	940-001903-00	Cartuccia per lavare dopo il completamento della sequenziazione
Kit di reagenti di carico DNBSEQ-T7RS DNB	Genomica completa	940-001894-00	Reagenti e piastre per caricare i DNB verso la cella di flusso
Cella di Flusso a Sequenziamento DNBSEQ-T7RS	Genomica completa	940-001902-00	1 corsia/cella di flusso
DNBSEQ-T7RS Kit di visualizzazione stereo-seq per la visualizzazione	Genomica completa	940-001893-00	La cartuccia e i reagenti per il sequenziamento.
Sistema DNBSEQ-T7RS	Genomica completa		Questo set di visualizzazione stereo-seq utilizza la tecnologia DNBSEQ. Una corsa di sequenziamento inizia con l'ibridazione di un ancoraggio di DNA, poi una sonda fluorescente viene collegata al DNA Nanoball (DNB) utilizzando la chimica combinatoria del sequenziamento dell'ancora della sonda (cPAS). Infine, il sistema di imaging ad alta risoluzione cattura il segnale fluorescente. Dopo l'elaborazione digitale del segnale ottico, il sequencer genera informazioni di sequenziamento di alta qualità e accurate.
Aria compressa con polvere	Matin	M-6318	È importante usare questo marchio o uno con propellente simile e nbsp;
Lame Microtome Edge-Rite	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	4280L	Istologia - Utilizzata durante la sezionazione dei campioni
Congelatore a prova di esplosioni	Vari	N/A	Raffreddare il metanolo prima e durante la fase di fissazione del metanolo.
Pennelli istologici	Vari	N/A	Istologia - Utilizzata durante la sezionazione dei campioni
Acido cloridrico	Sigma-Aldrich	2104-50ML	Per diluire l'enzima di premuliablizzazione in 0,01 N HCl (pH 2). La concentrazione standard di stock per la soluzione di HCl è 0,1 N.
Sistema di imaging	vari	N/A	GC Stomics Imager, Lecia, Evo Revolution
Soluzione di decontaminazione RNaseZap RNase Invitrogen	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	AM9780	Pulizia della postazione di lavoro rimuovendo la contaminazione da RNAse
Kimtech Delicate Task Tergicristalli	Kimtech	34155	Per asciugare banche, attrezzature, pipette, ecc.
Camice da laboratorio	Vari	N/A	Dispositivi di Protezione Personale (DPI)
Carta per obiettivi	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	11-997	Vari lavori per asciugare i vetri senza sheading
Salviette per la cancellazione del DNA Lookout	Sigma-Aldrich	L9060	Pulizia della postazione di lavoro per rimuovere la contaminazione da PCR
Rack di separazione Magentic 5uL - 0.2	Permagen Labware	MSRLV08	Per la separazione delle perle nei tubi PCR
Rack Magjet 12x1,5 mL	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	MR02	Per la separazione delle perline in tubi da 1,5 mL
Microtomo rotatorio manuale	Leica	RM2235	Istologia - Utilizzata durante la sezionazione dei campioni
Methonal ≥ 99,9%, adatto all'immunofluorescenza, HPLC	Sigma-Aldrich	34860	Per fissare (deve essere di grado HPLC)
Pinze microdissecanti	Sigma-Aldrich	F4142-1EA	Istologia - Utilizzata durante la sezionazione dei campioni
Micropipetta	Vari	N/A
Acqua di grado molecolare senza nucleasi non trattata con DPEC	Vari	N/A	Diluizioni ed eluzione delle perle
Guanti in nitrilo	Vari	N/A	PPE
Forno	Vari	N/A	Per cuocere le patatine
Tubi PCR 0,2 mL con tappi attaccati	Vari	N/A	Per applicazioni PCR
Coperture PCR	Vari	N/A	Sostituzione se l'adesivo sulla copertura fornita è debole
Cappuccia PCR e Postazione di lavoro	Mystaire	MY-PCR24-010	Per i passaggi pre-PCR (RNA a cDNA)
Misuratore di pH	Vari	N/A	Misuratore di pH per confermare il pH HCl.
Soluzione di poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	A005-C	Opzionale per aumentare l'adesione dei tessuti alla scheggiatura
Fluorometro Qubit 4	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	D33226	Inuterment; Misurazione delle quante del DNA
Kit di quantificazione del dsDNA per qubit	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	Q32851	Per la misurazione del cDNA e delle quantificazioni delle librerie
Kit per il test di qubit ssDNA	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	D10212	Colorazione ssDNA (Solo colorante utilizzato)
Blocco di ghiaccio senza RNAsi	Vari	N/A	Istologia - Utilizzata per sezionare i campioni per idratare i blocchi prima di sezionare
Soluzione di decontaminazione RNase RNaseZap	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	AM9782	Una soluzione di decontaminazione superficiale che distrugge gli RNA
RNeasy FFPE Kit	Qiagen	73504 & 19093	Per l'estrazione di RNA e l'estrazione di RNA Misurazione DV200
Sculpt Ultra White Resin	Siraya Tech	N/A	Resina polimerabile ai raggi UV resistente ad alte temperature
Kit di preparazione della libreria di codici a barre Stereo-seq 16	STOmics / Genomica Completa	111KL160	Per la costruzione della libreria OMNI FFPE a sequenze stereo
Kit accessorio FFPE Stereo-seq	STOmics / Genomica Completa	310AK002	Parti accessorie spaziali OMNI del kit 211SN114
Slide stereo-seq N-chip (1cm x 1cm)	STOmics / Genomica Completa	210CN114	Chip OMNI spaziale parte del kit 211SN114
Adattatore PCR stereo-seq	STOmics / Genomica Completa	301AUX001	Per i passaggi di ibridazione PCR modificati per adattarne tre, simili all'adattatore di ibridazione Situ PCRmax
Stereo-seq Transcriptomics N Kit	STOmics / Genomica Completa	211KN114	Parte del kit 211SN114 Spatial OMNI regent
Progettazione chirurgica Lama di Rasoio Industriale Generale	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	13-812-236	Istologia - Utilizzata durante la sezionazione dei campioni
pH della soluzione tampone TE 8.0	Sigma-Aldrich	8890	Per eluzione di cDNA e librerie
Ciclatori termici	BioRad / vari	1861096 /12015392 / vari	Macchina PCR con coperchio manuale o opzioni di pozzo profondo (T100 Thermal Cycler / PTC Tempo Deepwell Thermal Cycler, ecc.)
Kit tampone di pH All-in-One Thermo Scientific Orion	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	13-624-500
Bagno di galleggiamento tessuti - Digital XH-1003	Prima	NC0779538	Istologia - Utilizzata durante la sezionazione dei campioni
Occhiali protettivi UV	Vari	N/A	Per sicurezza durante l'indurimento UV
Xileni	Sigma-Aldrich	247642	Per la deparaffinizzazione