Questo protocollo chirurgico è una guida passo passo per inserire un catetere intratecale nello spazio subdurale spinale di un roditore per fornire un trattamento mirato.
Articolo metodologico
Accesso allo spazio subdurale del midollo spinale del roditore per l'erogazione del trattamento
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il trattamento delle malattie o delle lesioni del midollo spinale è impegnativo, in parte, a causa delle difficoltà nello sviluppo di trattamenti efficaci che possono essere applicati direttamente al midollo spinale. Gli attuali trattamenti per la lesione del midollo spinale (SCI), ad esempio, sono principalmente epidurali. Tuttavia, le terapie epidurali non consentono l'interazione diretta con il midollo spinale, riducendo il potenziale effetto del trattamento. Qui, viene proposto un metodo per accedere allo spazio subdurale in un modello di roditore per un effetto più diretto di un determinato trattamento. Utilizzando il protocollo descritto, è stato eseguito con successo l'impianto subdurale di un dispositivo bioelettronico per la registrazione/stimolazione del midollo spinale, nonché l'inserimento sicuro di un idrogel caricato con neurotrofina-3. Gli animali esposti a questo protocollo in entrambe le applicazioni non hanno mostrato alcun cambiamento nella funzione degli arti posteriori o anteriori dopo la procedura e non si sono sviluppate disfunzioni fino a 12 settimane dopo la procedura. Sebbene gli esempi qui presentati siano altamente specifici, il protocollo proposto può essere utilizzato in una varietà di applicazioni per consentire un trattamento localizzato più efficace dei disturbi neurologici del midollo spinale.
Introduzione
Le malattie e le lesioni del midollo spinale possono avere effetti devastanti su milioni di persone in tutto il mondo, con conseguenti notevoli oneri sociali, economici e sanitari 1,2. Le lesioni del midollo spinale e le malattie neurodegenerative possono portare a disfunzioni motorie, sensoriali e autonomiche croniche che riducono la qualità della vita e l'indipendenza degli individui colpiti. I trattamenti attuali, come l'intervento chirurgico e la farmacoterapia, si concentrano sulla mitigazione del trauma iniziale e sulla gestione delle complicanze secondarie3. Tuttavia, questi approcci raramente raggiungono una sostanziale rigenerazione neurale o un recupero funzionale, lasciando un urgente bisogno di interventi più efficaci che mirino ai meccanismi sottostanti.
Una preoccupazione primaria per le attuali strategie di trattamento è l'ubicazione e l'erogazione di un trattamento desiderato. Trattamenti come la neuromodulazione o l'intervento farmaceutico hanno la capacità di influenzare l'attività neuronale, facilitare il recupero funzionale e potenzialmente ristabilire le connessioni nei circuiti spinali danneggiati4. La stimolazione del midollo spinale può portare a miglioramenti nel controllo motorio e a una riduzione del dolore5. Tuttavia, queste strategie sono attualmente limitate alla somministrazione indiretta al tessuto leso, focalizzata sullo spazio epidurale, senza considerare la barriera della dura madre del midollo spinale 6,7,8. Sebbene i trattamenti epidurali abbiano mostrato benefici clinici, sono limitati a causa dell'accesso indiretto alle popolazioni neuronali bersaglio, portando a effetti potenzialmente ridotti degli agenti terapeutici.
Il nostro gruppo ha lavorato per superare queste limitazioni associate alle strategie incentrate sull'epidurale ed esplorare il potenziale per la somministrazione diretta del trattamento subdurale nei modelli di lesione del midollo spinale (SCI). L'inserimento di cateteri nello spazio subdurale consente di applicare il trattamento direttamente al midollo spinale, fornendo una migliore interazione con il tessuto neurale interessato 9,10. La somministrazione subdurale riduce anche gli effetti di barriera della dura madre, migliorando l'efficacia della stimolazione elettrica e dei sistemi di somministrazione mirata dei farmaci11,12. Questo metodo potrebbe migliorare la precisione e l'efficacia del trattamento, portando potenzialmente a risultati migliori nel recupero funzionale.
Questo articolo descrive un protocollo passo-passo per l'accesso sicuro allo spazio subdurale del midollo spinale del roditore. Questa procedura è focalizzata sulla regione toracica della colonna vertebrale (T10-T12), tuttavia può essere implementata in diverse posizioni del cordone, se necessario. Vengono specificati i punti di riferimento anatomici, che consentono l'identificazione della regione, e vengono presentate istruzioni dettagliate sulla laminectomia, la durotomia e la penetrazione della dura madre. Vengono inoltre presentate due applicazioni di questo protocollo, tra cui l'impianto di un dispositivo di stimolazione elettrica e la somministrazione di un sistema di somministrazione di farmaci in idrogel (Figura 1). I passaggi delineati sono facilmente riproducibili da ricercatori con esperienza nella chirurgia dei roditori. Questo protocollo è scritto nel contesto di un modello di contusione della lesione midollare; Tuttavia, il modello specifico di lesione può essere modificato a seconda dei risultati sperimentali desiderati. La tecnica qui descritta non solo è promettente per il progresso del trattamento della lesione midollare, ma può anche fornire una piattaforma per la ricerca futura sulla riparazione e la rigenerazione del midollo spinale attraverso interventi precisi e localizzati.
Protocollo
Tutte le procedure sono state condotte in conformità con le linee guida etiche dell'Università di Auckland e sono state approvate dal Comitato Etico Animale (AEC) dell'istituzione e dai Responsabili del Benessere Animale (AWO) dell'università. Sono stati utilizzati ratti femmina di Sprague-Dawley del peso di 240-260 g e alloggiati in gruppo (21 °C; 12 h:12 h, ciclo luce: buio) e hanno avuto accesso ad libitum alla dieta standard dei roditori prima e dopo l'intervento chirurgico. Si consiglia di provare prima questo protocollo in assenza di un modello di lesione, poiché l'intenzione è quella di fornire un accesso sicuro allo spazio subdurale del midollo spinale del roditore. Questo è un primo passo importante per dimostrare che il protocollo può essere applicato senza causare lesioni, consentendo un esame più accurato di un modello di lesione desiderato. Il protocollo si presta ad essere combinato con i diversi modelli di lesione utilizzati dai gruppi di ricerca. Pertanto, il protocollo non descrive le fasi specifiche di erogazione delle lesioni, in quanto queste variano in base all'applicazione. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione pre-operatoria
- Sterilizzare tutti gli strumenti (Figura 1 supplementare) e i relativi materiali di consumo.
- Pesare i ratti da sottoporre a intervento chirurgico il giorno successivo.
- Calcolare le dosi appropriate di farmaci da somministrare; bupivacaina (analgesico) @ 2 mg/kg, dose - 0,08 ml/100 g; meloxicam (analgesico) @ 2 mg/kg, dose - 0,04 mL/100 g; buprenorfina (analgesico) @ 0,03 mg/kg, dose - 0,1 mL/100 g; enrofloxacina (antibiotico) @ 10 mg/kg, dose - 0,08 mL/100 g12,13.
NOTA: La bupivacaina è stata somministrata per via sottocutanea in 3-4 siti lungo il sito chirurgico prima dell'incisione iniziale.
2. Preparazione chirurgica
- Assicurarsi che il sistema di anestesia sia configurato correttamente (controllare che tutti i tubi associati al sistema di ossigeno e anestesia siano configurati correttamente).
- Preparare le iniezioni necessarie in base al peso dei ratti e un'iniezione di soluzione fisiologica da 3 ml da somministrare prima dell'inizio.
- Assicurarsi che il termoforo (temperatura di mantenimento 37 °C), la lampada, il microscopio e il rasoio siano tutti configurati e funzionanti.
NOTA: Non è richiesto alcun ingrandimento specifico per il microscopio da dissezione, poiché l'ingrandimento varia a seconda delle preferenze dell'utente e della visibilità durante la procedura.
ATTENZIONE: Assicurarsi che la temperatura dell'animale non scenda sotto i 35°C o superi i 40°C durante la procedura
3. Preparazione degli animali
- Assicurarsi che tutti i tubi associati al sistema di anestesia e al serbatoio dell'ossigeno siano collegati. Se si utilizza il sistema di anestesia utilizzato in questo studio (vedere la Tabella dei materiali), impostare l'induzione dell'isoflurano al 3% e inserire il peso dell'animale nel sistema di anestesia per impostare la portata di ossigeno per l'anestesia di mantenimento (Figura 1A supplementare).
NOTA: Mantenere l'anestesia a un livello di mantenimento adatto ad ogni singolo animale. Questo può variare tra l'1,3% e il 2% a seconda dell'animale. - Posiziona il ratto nella camera di induzione fino a quando non è in grado di raddrizzarsi, passa al livello di mantenimento dell'isoflurano desiderato e sposta il ratto sul cono del naso.
- Somministrare 3 ml di soluzione fisiologica e le iniezioni di farmaco necessarie, per via sottocutanea, prima della rasatura.
NOTA: Dopo le iniezioni di soluzione salina e la rasatura, iniettare la bupivacaina in diversi punti lungo il sito di incisione previsto - Durante il monitoraggio del livello di anestesia dell'animale, preparare tutti gli strumenti (microscopio, strumenti, teli sterili) nell'area chirurgica. Posizionare un telo sterile per gli strumenti nell'area desiderata e organizzare gli strumenti sul telo, mantenendo il campo sterile.
- Rasare il pelo lungo la schiena dell'animale, dalla base del collo alla sommità dei fianchi.
- Disinfettare l'area con scrub al cloresa, seguito da tintura di cloretrace, con un movimento circolare che si sposta dal centro dell'area rasata (3 volte) e applicare lubrificante sugli occhi per evitare che si secchi.
- Trasferisci il ratto sul termoforo al microscopio, posiziona un drappo a pressione e sigilla sull'area rasata e taglia un foro abbastanza grande da esporre il campo chirurgico ma non così grande da esporre il pelo non rasato.
- Posizionare una sonda di temperatura rettale per monitorare la temperatura dell'animale e mantenere ~37 °C con il termoforo. Somministrare controlli del benessere degli animali ogni 5-10 minuti.
- Somministrare il riflesso del pedale per confermare il piano chirurgico dell'anestesia e iniziare la procedura.
4. Dissezione tissutale della colonna vertebrale
- Utilizzando la lama di un bisturi, praticare un'incisione lineare (~6-8 cm) in direzione rostrale-caudale (Figura 2A), iniziando sotto la base del collo e estendendosi oltre la gobba toracica, esponendo le vertebre T9-T13.
- Accoppiare delicatamente il tessuto connettivo sotto il sito di incisione con una pinza Graefe o micro forbici a molla, per esporre direttamente il tessuto muscolare sulla colonna vertebrale.
- Identificare il processo T13 individuando i due tendini bianchi a forma di V vicino alla metà caudale dell'incisione. Il processo spinoso direttamente rostrale alla V sul lato della coda dell'animale è T13 (Figura 2B).
- Partendo da T13 e salendo fino a T9, praticare piccole incisioni nei tessuti connettivi tra ciascun processo per separarli prima di liberare il muscolo, per aiutare a mantenere la posizione man mano che la procedura procede (Figura 2C). Quindi, tagliare i canali nel muscolo che corrono paralleli a entrambi i lati dei processi spinosi utilizzando i microscriper. Fallo su entrambi i lati della colonna vertebrale per esporre la lamina di ciascun segmento spinale (Figura 2D).
- Attacca i morsetti serrefine su entrambi i lati delle pareti muscolari per mantenere un campo visivo aperto sulla colonna vertebrale. Attacca un paio ai lati di T13, un altro al bordo T11/T12 e un altro a T11/T10 (Figura 2E).
- Una volta formati i canali chiari, tagliare via il tessuto connettivo tra ogni processo utilizzando microforbici o rongeurs (Figura 2F).
- Liberare i canali fino a quando il tessuto connettivo e il muscolo non sono stati sezionati in modo pulito da ciascuna lamina, dalla parte rostrale di T13 alla parte caudale di T9, esponendo i segmenti T10-12 per la procedura di laminectomia. Il completamento con successo è indicato da una lamina chiaramente visibile su entrambi i lati dei processi.
NOTA: Per il passaggio 4 non è necessario un microscopio, ma è altamente raccomandato.
5. Laminectomia
- Individuare la porzione caudale della lamina T12 che si sovrappone alla porzione rostrale del T13, posizionare la punta dei rongeurs sotto e iniziare delicatamente a rimuovere pezzi di lamina, come raccomandato nei protocolli standard JoVE14,15 (Figura 2G).
NOTA: Utilizzare una pinza per afferrare il processo spinoso di ciascuna lamina per mantenere la stabilità e per "sollevare" delicatamente le piastre durante ogni taglio con i rongeurs (Figura 2G). Quando si fa scorrere la punta dei rongeur sotto la lamina, mantenere la pressione verso l'esterno lontano dal midollo spinale per ridurre al minimo i potenziali danni.
ATTENZIONE: Fare attenzione a non spingere troppo in basso i rongeur quando si eseguono i tagli, poiché potrebbe danneggiare la dura madre e/o il midollo spinale stesso. - Spostandoti da un lato all'altro, continua a tagliare pezzi di osso dalla lamina T12 fino a quando non c'è abbastanza spazio per estendere il taglio nella linea mediana del processo, esponendo il midollo spinale, con un foro di circa 5 mm di diametro (Figura 2H).
NOTA: La rimozione dell'osso dalla colonna vertebrale può provocare sanguinamento che può ridurre la visibilità durante la procedura. Utilizzare tamponi di cotone o salviette arrotolate prive di lanugine (Figura supplementare 1B) per gestire questo problema durante l'esecuzione della laminectomia. - Lavorare i rongeurs sotto la lamina su entrambi i lati e poi liberare un canale uniforme verso la porzione cranica di T12 (Figura 2I).
NOTA: Il midollo spinale diventerà visibile man mano che i pezzi della placca laminare vengono rimossi per ciascun segmento spinale. - Ripetere i passaggi da 5.1 a 5.3 per rimuovere sia T11 che T10.
- Continuare la laminectomia, mantenendo tagli uniformi su entrambi i lati, spostandosi rostralmente fino a T9 (Figura 2J).
NOTA: Per le procedure di lesione midollare per contusione (vedere la sezione Risultati rappresentativi), la lamina sopra il segmento/i del midollo spinale desiderato deve essere sufficientemente ampia da consentire l'uso di un dispositivo per lesioni da contusione (vedere l'area allargata al centro della Figura 2K). Per la somministrazione del farmaco, la laminectomia può essere abbastanza ampia da visualizzare l'applicazione del composto desiderato. - Sciacquare delicatamente il sacco tecale con soluzione fisiologica e preparare l'area desiderata per la durotomia una volta completata la laminectomia e rimossa un'area sufficiente di T10-T12 (Figura 2K).
NOTA: Questa procedura è specifica per l'accesso ai segmenti spinali (T10-T12), tuttavia, questi metodi possono essere utilizzati per eseguire laminectomie in vari segmenti lungo la colonna vertebrale.
6. Durotomia per l'applicazione del trattamento
- Eseguire la durotomia (incisione della dura madre) utilizzando l'endoscopio di dissezione per accedere allo spazio subdurale del midollo spinale (Figura 3A).
NOTA: Regolare l'ingrandimento dell'endoscopio in base alle preferenze del chirurgo per la visibilità della dura madre. - Piegare un ago da 27 G in un angolo di 90 gradi con lo smusso rivolto verso l'alto (Figura 3B).
NOTA: Utilizzare un paio di trascinatori dell'ago o emostatici per afferrare l'ago durante la piegatura. - Forare delicatamente la dura madre con la punta dell'ago nel punto di ingresso desiderato sul midollo spinale (Figura 3B).
ATTENZIONE: Fare attenzione a non danneggiare il midollo spinale sottostante o il suo vaso sanguigno mediano. - Una volta perforata la dura madre, sollevare delicatamente l'ago dorsalmente per praticare un foro circolare nella dura madre, non più di 2 mm, su entrambi i lati del vaso sanguigno della linea mediana. Una durotomia riuscita è indicata da una piccola quantità di perdita di liquido cerebrospinale (CSF) da entrambi i fori.
NOTA: Mantenere una distanza di almeno qualche mm dall'estremità della laminectomia per consentire un più facile accesso allo spazio subdurale. Se necessario, reinserire con cautela la punta dell'ago nel foro iniziale per aumentarne le dimensioni. - Assicurarsi che la posizione selezionata per l'incisione della durotomia e che la posizione immediatamente davanti sia libera da vasi sanguigni ramificati dal vaso sanguigno della linea mediana.
ATTENZIONE: NON danneggiare il vaso sanguigno della linea mediana, poiché ciò causerebbe un sanguinamento eccessivo, impedendo il completamento della procedura. - Utilizzando i fori praticati nella dura, somministrare il trattamento desiderato o impiantare un dispositivo nello spazio subdurale. Per questo protocollo, i cateteri intratecali vengono utilizzati per l'erogazione del trattamento per guidare il dispositivo di stimolazione in posizione o iniettare l'idrogel (Figura 3C).
NOTA: Mantenere un campo visivo libero eliminando continuamente il sangue e/o il liquido cerebrospinale dopo le durotomie. - Assicurarsi che le punte dei cateteri siano visibili sotto la dura madre prima di procedere nel midollo spinale. Un'applicazione di successo è indicata dai cateteri che si muovono dolcemente attraverso i piccoli vasi sanguigni spinali mentre si trovano sotto la membrana durale.
- Dopo aver somministrato il trattamento desiderato (Figura 3D, E), posizionare un pezzo di gel chirurgico sterile nello spazio creato dalla laminectomia per favorire l'emostasi, la guarigione delle ferite e il mantenimento della struttura della colonna vertebrale.
- Dopo il posizionamento della schiuma in gel, utilizzare una sutura assorbibile in polidiossanone 4-0 per chiudere lo strato muscolare e cutaneo sopra la colonna vertebrale.
7. Assistenza post-operatoria
- Controllare quotidianamente gli animali e somministrare i farmaci post-operatori necessari (buprenorfina per 2 giorni; enrofloxacina e meloxicam per un massimo di 5 giorni). Somministrare 1-3 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea secondo necessità (se si consuma <10% del peso corporeo dell'acqua nell'arco di 24 ore durante il periodo post-operatorio).
- A seconda della procedura, monitorare la funzione della vescica, la funzione motoria, la scala delle smorfie e qualsiasi altro segno di benessere animale.
- Rimuovere i punti di sutura cutanei circa 10-14 giorni dopo l'intervento.
Risultati
Il protocollo proposto è stato applicato in due diversi contesti sperimentali. I dati riportati sono rappresentativi dei gruppi non danneggiati perché l'intenzione era quella di dimostrare che le manipolazioni subdurali descritte nella procedura (in assenza di un modello di lesione) non compromettono la funzione. Un dispositivo bioelettronico è stato impiantato (Figura 1A) o un idrogel è stato somministrato (Figura 1B) in ratti Sprague-Dawley di 6-8 settimane. La funzione motoria di questi animali è stata confrontata con quella degli animali di controllo sottoposti a chirurgia fittizia senza una procedura subdurale utilizzando la scala della funzione motoria della BEE. Qui sono rappresentati diversi gruppi di animali, che mostrano la fattibilità di ogni procedura e la sua sicurezza. Dopo ogni procedura, tutti gli animali hanno mantenuto la normale funzione motoria senza differenze nel punteggio BBB tra i gruppi 7 giorni dopo la procedura, indicando l'attuazione sicura del protocollo descritto. Inoltre, un gruppo di animali (Figura 4C) che dimostrano una funzione motoria degli arti posteriori compromessa è rappresentato per il confronto con i gruppi di procedura subdurale, per dimostrare ulteriormente che non sono stati osservati effetti avversi nei gruppi sperimentali. Questo gruppo ha ricevuto una procedura di lesione midollare con una forza di 175 kdyn dispositivo di impatto, come descritto nella letteratura precedente12,13.
Impianto bioelettronico
Per l'impianto del dispositivo, il protocollo include la creazione di due siti di durotomia, uno per l'ingresso del catetere e l'altro per l'uscita, per facilitare il movimento dei cateteri guida sotto la dura madre e il posizionamento controllato del dispositivo. Il dispositivo bioelettronico consisteva in due bracci biforcati collegati a un'interfaccia PCB incapsulata da un alloggiamento biocompatibile. I bracci sono temporaneamente collegati a piccoli cateteri intratecali tramite sutura di seta 7-0 per facilitare il posizionamento dell'impianto. I cateteri vengono tirati lentamente attraverso i fori della durotomia rostrale, fatti scorrere sotto la dura madre e attraverso i fori della durotomia di uscita caudali fino alla posizione di trattamento. I bracci dell'impianto attaccati sono stati quindi tirati e posizionati su ciascuna emisezione del midollo spinale. L'estremità della coda dell'impianto è suturata al muscolo collegato al processo T13. L'alloggiamento è suturato al muscolo trapezio/latissimus rostrale alla laminectomia. La pelle viene quindi chiusa attorno alla base dell'unità abitativa per consentire l'accesso all'esterno.
Trattamento con idrogel
Per la somministrazione di idrogel è necessario solo un punto di ingresso. L'idrogel è stato erogato tramite cateteri intratecali simili posizionati nella stessa posizione del dispositivo di stimolazione. I cateteri sono stati caricati con 10 μL di idrogel di polossamero12 e sono stati inseriti nello spazio subdurale allo stesso modo delle fasi di impianto del dispositivo. Una volta in posizione, i cateteri sono stati lentamente retratti mentre l'idrogel è stato rilasciato continuamente sotto la dura madre (Figura1B) su ciascun emicordone. Dopo ogni procedura, gli animali sono stati monitorati per 7 giorni per garantire un adeguato recupero.
La scala Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) a 21 punti è stata utilizzata per la valutazione della funzione motoria16. Gli animali di entrambi i gruppi sono stati valutati prima della procedura (basale) e a 1, 3 giorni e 7 giorni dopo l'intervento. Il comportamento in campo aperto è stato valutato direttamente e tramite registrazioni video in cieco. I punteggi della funzione motoria per gli arti posteriori sinistro e destro per ciascun gruppo sono stati confrontati con animali di controllo non operati e un gruppo LM separato per determinare l'entità di eventuali effetti avversi dell'intervento chirurgico. Gli animali del gruppo impianto o idrogel non hanno mostrato alcun deficit nella funzione motoria dopo entrambe le procedure, rispetto ai controlli non operati o agli animali con lesione midollare. Da notare che l'analisi istologica che conferma l'assenza di danni al midollo spinale è già stata pubblicata nel nostro lavoro precedente. Questo studio ha dimostrato che l'uso di questo metodo per impiantare un dispositivo non produce ulteriori traumi del midollo spinale fino a 7 giorni dopo la procedura11. Cambiamenti minimi nell'attività degli astrociti (GFAP) e delle microglia/macrofagi (Iba1) sono stati osservati dopo l'impianto di un dispositivo rispetto agli animali di controllo. Sono state esaminate anche l'area superficiale e la rotondità delle sezioni del midollo spinale coronale direttamente sotto l'impianto, senza mostrare alcun cambiamento nella morfologia.
Figura 1: Strategie di trattamento subdurale. (A) Esempio del dispositivo impiantabile e (B) del catetere/siringa utilizzato per iniettare l'idrogel. (C) Modelli rappresentativi sia dell'impianto che dell'inserimento di idrogel nel midollo spinale di un ratto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini della laminectomia, che rappresentano il campo chirurgico. (A) Orientamento dell'animale per le immagini chirurgiche nella Figura 2 e nella Figura 3. (B) Punti di riferimento del tendine muscolare per la posizione del processo T13 per guidare l'inizio della dissezione muscolare. (C) Tagli perpendicolari per identificare ogni processo da rimuovere tramite laminectomia. (D) Canali muscolari tagliati parallelamente ai processi spinali per consentire l'accesso alle placche ossee per la rimozione. (E) Clip di bulldog serrefine utilizzate per trattenere il muscolo/pelle su entrambi i lati della colonna vertebrale per fornire uno spazio chirurgico adeguato. (F) Rimozione dei tendini bianchi che interconnettono ogni processo prima dell'inizio della laminectomia. (G) Campo chirurgico all'inizio della laminectomia quando i rongeurs vengono fatti scivolare sotto la placca T12 per iniziare a tagliare via l'osso. (H) La prima metà del processo T12 è stata rimossa per esporre il midollo spinale e lasciare uno spazio adeguato al chirurgo per muoversi rostralmente e iniziare a rimuovere i processi rimanenti (T11/T10). (I) Rimozione della porzione cranica di T12, con rimozione completa del segmento. (J) Laminectomia completata a metà a T11 utilizzando tagli più larghi per l'applicazione di un esempio di contusione SCI. (K) Laminectomia completa dopo la rimozione dei segmenti T10-T12, esponendo completamente la superficie dorsale del midollo spinale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Passaggi per l'esecuzione della durotomia e l'applicazione del trattamento mirato. (A) Schema della posizione dei fori nella dura madre del midollo spinale. (B) Campo chirurgico che mostra un ago da 27 G che penetra la dura madre per creare la durotomia; questo viene fatto su entrambi i lati del vaso sanguigno centrale come si vede in (A). (C) Inserimento iniziale di un catetere utilizzato per l'applicazione del trattamento. (D) Dispositivo di stimolazione elettrica in posizione sul midollo spinale. (E) Cateteri caricati con idrogel per iniezione sulla superficie del midollo spinale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Condizione post-operatoria e funzione motoria. (A) Immagini rappresentative di animali dopo l'impianto del dispositivo e la somministrazione di idrogel. (B) Punteggi BBB rappresentativi di animali con una lesione da contusione spinale rispetto agli animali sottoposti a una procedura subdurale (impianto o idrogel) o agli animali di controllo che non hanno subito manipolazioni. Le dimensioni del campione del gruppo di controllo (non operato), SCI e del gruppo di impianto erano n = 5 e la dimensione del campione del gruppo Hydrogel era n = 3. Le barre di errore rappresentano l'errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Strumenti chirurgici. Fotografia degli strumenti chirurgici utilizzati. (1) bisturi a lama #10. (2) Micro forbici Vannas. (3) Pinze Graefe. (4) Clip per bulldog Serrefine. (5) Rongeurs. (6) Ago da 27 G per durotomia. (7) Pinze fini. (8) Siringa da 1 ml per l'applicazione salina secondo necessità. (9) Forbici da dissezione. (10) Emostatici per sutura. (11) Cotton fioc appuntiti. (12) Batuffoli di cotone sterilizzati. (13) Salviette arrotolate prive di lanugine. Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura 2 supplementare: Spazio subdurale ed epidurale. Rappresentazione schematica della colonna vertebrale e del midollo spinale, che dimostra l'epidurale vs. spazio subdurale. Clicca qui per scaricare questa figura.
Discussione
La metodologia qui presentata fornisce istruzioni dettagliate per l'accesso allo spazio subdurale spinale e ne dimostra la sicurezza e la fattibilità attraverso due esempi di somministrazione del trattamento nella regione toracica del midollo spinale11,12. Numerosi gruppi di ricerca hanno sviluppato approcci nel tentativo di trattare la lesione del midollo spinale (SCI) attraverso interventi elettrici o chimici. Le attuali strategie, compresi i dispositivi impiantabili per l'optogenetica17 o la stimolazione elettrica18, nonché le terapie farmaceutiche che utilizzano idrogel19,20, hanno dimostrato vari gradi di successo nel facilitare il recupero e la riabilitazione. Tuttavia, il targeting preciso rimane una sfida critica, poiché la maggior parte dei trattamenti attuali viene somministrata al di fuori dello spazio subdurale. La tecnica qui descritta offre un approccio promettente per la somministrazione di interventi direttamente al midollo spinale, compreso un mezzo di accesso a lungo termine allo spazio subdurale (Figura 2 supplementare), supportando la somministrazione prolungata e mirata di agenti terapeutici per la lesione midollare e le condizioni neurodegenerative. Ciò ha importanti implicazioni per il bypass della barriera emato-spinale, una sfida importante nello sviluppo di trattamenti efficaci per i disturbi del midollo spinale.
Laminectomia
Sebbene le procedure di laminectomia nei roditori siano ampiamente utilizzate 17,21,22, ci sono diversi aspetti critici del protocollo che devono essere notati. I punti di riferimento anatomici utilizzati nel protocollo di cui sopra (passaggio 4.3; Figura 2A) consentono l'accesso alla regione toracica inferiore del midollo spinale e sono specifici per il lavoro del nostro gruppo. Se la procedura deve essere applicata a una diversa regione spinale, è possibile contare i segmenti rostrali o caudali fino alle vertebre iniziali per determinare la posizione. Un'altra considerazione cruciale è l'entità della rimozione della lamina. Per ridurre al minimo il rischio di lesioni indesiderate al midollo spinale durante la procedura, è necessario rimuovere almeno due livelli contigui. In questo modo si ottiene spazio sufficiente per la durotomia e si garantisce una corretta visualizzazione. Questa precauzione riduce il rischio di lesioni ai piccoli vasi sanguigni durante l'inserimento del catetere. Anche l'eccessiva rimozione ossea dalla parete laterale della colonna vertebrale dovrebbe essere evitata per prevenire sanguinamenti non necessari o instabilità della colonna vertebrale dopo l'intervento chirurgico. Mantenendo un equilibrio tra un accesso adeguato e un'interruzione minima, la procedura garantisce un'erogazione del trattamento più sicura e precisa.
Durotomia e inserimento del catetere
L'esecuzione della durotomia richiede precisione per evitare di penetrare nel midollo spinale. Un inserimento improprio può provocare lividi o lacerazioni al midollo spinale o ai vasi sanguigni subdurali. Le aperture create nella dura madre devono essere abbastanza grandi da ospitare la strategia di trattamento desiderata, in questo caso il diametro dei cateteri intratecali, senza compromettere l'integrità della membrana. Durante l'esecuzione della durotomia, il liquido cerebrospinale può fuoriuscire quando la dura madre viene perforata; Tuttavia, la quantità è minima. Mentre grandi lacerazioni nella dura madre possono causare complicanze, la letteratura precedente suggerisce che piccole punture come quelle utilizzate nel protocollo descritto (passaggio 6.4) sono in grado di auto-guarire attraverso la deposizione/vascolarizzazione del collagene23, senza alcun effetto avverso misurabile dopo la procedura. Quando si posizionano i cateteri, questi devono essere inseriti il più parallelamente possibile al midollo spinale per ridurre al minimo il rischio di lesioni dovute alla forza diretta. È necessaria un'attenta manipolazione per evitare piegature o crimpature, garantendo un inserimento regolare e un posizionamento corretto.
Assistenza post-operatoria
L'assistenza post-operatoria dopo la procedura è una considerazione importante dato che i roditori sono tipicamente alloggiati in gruppo in condizioni standard. Il comportamento aggressivo o le interazioni sociali dopo questa procedura possono influenzare i risultati sperimentali, a seconda del tipo di trattamento applicato. Questo protocollo si traduce in una linea di 6-8 cm di suture cutanee lungo il dorso dell'animale. Si consiglia di tenere gli animali di casa singola per 7-10 giorni dopo l'intervento per consentire la guarigione delle ferite e prevenire la potenziale rimozione dei punti di sutura da parte di un compagno di gabbia. Nel caso di un'applicazione di somministrazione di farmaci, una volta che l'incisione guarisce, possono essere ricollocati in gruppi precedenti senza comportamenti apertamente aggressivi o complicazioni correlate alla procedura. Nel caso di dispositivi impiantabili, gli animali dovrebbero essere alloggiati solo in gruppi di 2. Abbiamo scoperto che alloggiare gli animali in gruppi di 3 o più può causare complicazioni legate all'aggressività con i risultati del trattamento.
Applicazioni di trattamento
Sebbene la procedura qui descritta si concentri sul midollo spinale toracico e su due strategie di trattamento specifiche, è adattabile ad altre regioni della colonna vertebrale e ad altre applicazioni terapeutiche. Procedure simili di laminectomia sono state eseguite con successo a vari livelli spinali in modelli di roditori. Tuttavia, il piccolo spazio subdurale nei roditori rappresenta una sfida, lasciando un margine minimo di errore durante l'erogazione del trattamento. Mentre le fasi di laminectomia e durotomia possono essere facilmente eseguite da coloro che hanno esperienza in interventi chirurgici sui roditori, il posizionamento preciso di un dispositivo o di un farmaco sotto la dura madre senza causare lesioni può richiedere ulteriore tempo di formazione. Oltre alla formazione chirurgica, ci sono diversi fattori che possono aiutare nell'applicazione del trattamento. Mantenere un campo visivo libero durante l'applicazione del trattamento è fondamentale. Assicurarsi, quando si utilizzano cateteri intratecali come descritto in questo studio, che non vi siano punti frastagliati o ruvidi sui cateteri prima di inserirli sotto la dura. Come accennato in precedenza, la posizione della durotomia è estremamente importante. Più il punto di ingresso del catetere è lontano dalla lamina rostrale rimanente, più facile è per i cateteri essere allineati e rimanere paralleli al midollo spinale durante l'inserimento. Dovrebbero essere prese in considerazione anche le tempistiche delle strategie di trattamento in relazione a una lesione. Il lavoro futuro comporterà l'istituzione di queste procedure negli animali in vari momenti dopo l'infortunio per consentire successivamente la valutazione dei trattamenti destinati ad affrontare le lesioni croniche. Questo protocollo rappresenta un progresso significativo nell'applicazione del trattamento per le malattie neurologiche del midollo spinale e fornisce un approccio versatile e preciso alla somministrazione di terapie direttamente al tessuto del midollo spinale.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è finanziato da CatWalk Spinal Cord Injury Trust e da una HRC Sir Charles Hercus Research Fellowship (BH). Questo lavoro è stato sostenuto anche dall'Assistente del Segretario alla Difesa per gli Affari Sanitari, approvato dal Dipartimento della Difesa, per un importo di 534.258 dollari, attraverso il Programma di Ricerca sulle Lesioni del Midollo Spinale nell'ambito del Premio n. HT9425-23-1-0492. Gli schemi nella Figura 2A e nella Figura 3A sono stati generati utilizzando Biorender.com.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringhe da 1 mL e 3 mL | Amtech | ||
| Siringhe di tubercolina da 1ml | BD | 302100 | |
| 2 pinze Graefe | FST | 11051-10 | |
| Aghi da 25G per l'amministrazione dei farmaci | Nipro | SH811 | |
| Aghi da 27G per incisione durale | Nipro | SH816 | |
| 6 pinze bulldog per tessuto | FST | 18051-28 | |
| 70 % etanolo | |||
| Baytril 5 mg/kg | Elanco | KV04UHU | |
| Guanti in lattice Biogel Surgeons | Molnlycke | 822775-01 | |
| Bupivicaina 2 mg/kg | Aspen Nuova Zelanda | 2023-02 | |
| Buprenorfina 0,05 mg/kg | Ceva (Vetergesic) | 9000320 | |
| Cloresaxino e tintura di ehtanolo | Perrigo | K076A | |
| Sfregaggio Chlorhex | Schulke | LBL11258 | |
| Rongeurs curvi | FST | 16021-14 | |
| Pinza Dumont #4 | FST | 11294-00 | |
| Gelfoam, spugna sterile di gelatina assorbibile | GELFOAM | 09-0342-04-015 | |
| Siringa Hamilton | Hamilton | 80314 | |
| Impasto riscaldante (37 oC) | Scientifico del Kent | SF-01 | |
| Hemostat | FST | 13004-14 | |
| Impattatore e software Infinite Horizon | Sistemi di precisione e strumentazione (PSI) | IH-0400 | |
| Isoflurano | Medsource | Sconosciuto | |
| Metacam 2 mg/kg | Boehringer Ingelheim | D02818 | |
| Suture non assorbibili (Ethilon 4-0, P-3) | Ethicon | 1603G | |
| O2 | |||
| Microscopio chirurgico Omax | Jacobs Digital | W43DPT | |
| Premere e sigillare pellicola trasparente per il drappeggio | Felice | N/A | |
| Manico a bisturi | Strumenti scientifici di qualità (FST) | 10004-13 | |
| Lame di bisturi taglia 10 | Amtech Medical | SH070 | |
| Suite di induzione Somnoflow | Kent Scientific | SF-01 | Sistema anestesico a basso flusso |
| Assorbenti sterili e cotone | Swisspers | N/A | |
| Cotton Mics sterili (standard + appuntito) | help@hand | N/A | |
| Soluzione salina sterile 0,9% | Realizzato e autoclavato in laboratorio | N/A | |
| Sezioni sterili di Kim Wipe arrotolata | Scienza Kimtech | 34155 | |
| Sonda di temperatura | Scientifico del Kent | SF-01 | |
| Forbici a Primavera Vannas | FST | 15903-08 | |
| Lubrificante a base d'acqua | |||
| Bilancia | Qualsiasi | N/A |
Riferimenti
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