Risoluzione subnanometrica Determinazione strutturale dell'emoagglutinina dalla tomografia crioelettronica dei virus influenzali

La crio-tomografia elettronica (cryoET) è stata applicata negli ultimi decenni per catturare istantanee di complessi proteici, virus, cellule e organismi. Una modalità di microscopia crioelettronica (cryoEM), la crioET è un metodo di biologia strutturale in cui un campione biologico viene congelato all'istante, quindi ripreso attraverso una varietà di orientamenti attraverso l'inclinazione^{di 1,2,3}. Le immagini scattate ad ogni orientamento vengono quindi allineate computazionalmente al loro asse di inclinazione comune e ricostruite in un tomogramma per fornire una visione tridimensionale⁴.

Mentre la cristallografia a raggi X e la crioEM a singola particella richiedono molecole purificate e strutturalmente omogenee, la crioET può visualizzare una molecola direttamente nel suo contesto nativo⁴. Pertanto, uno dei principali vantaggi della crioET è la sua capacità di visualizzare campioni pleomorfi, come i virus membranosi, inclusa l'influenza ^5,6,7. Un'altra promessa della crioET è la sua capacità di visualizzare su tutte le scale. Mentre i tomogrammi non sono tipicamente risolti oltre i 5-10 nm⁸, l'integrazione della media del sottotomogramma, in cui le copie della stessa particella sono identificate, allineate e mediate, può portare a una risoluzione quasi atomica in alcune molecole biologiche come i ribosomi ^9,10. Tuttavia, solo tipi limitati di molecole possono raggiungere questa risoluzione; le medie del sottotomogramma in genere non superano la risoluzione di 10-15 Å. Al contrario, la crioEM a singola particella raggiunge abitualmente risoluzioni di 3-4 Å dopo la rivoluzione della risoluzione¹¹. I recenti progressi sia nella maggiore produttività del software di acquisizione dati e analisi cryoET hanno permesso la determinazione della struttura con risoluzione subnanometrica di molecole biologiche aggiuntive nel loro contesto nativo 12,13,14,15,16,17,18.

Un uso comune della crioET è quello di visualizzare la morfologia, l'organizzazione e la struttura del virus. Nonostante la risoluzione inferiore offerta da questa tecnica rispetto alla crioEM a singola particella o alla cristallografia a raggi X, la crioET combinata con la media del sottotomogramma può fornire informazioni su come si comportano le proteine virali nel loro ambiente nativo e fornire dettagli cruciali sulla loro organizzazione nel contesto del virione. Un bersaglio comune per la crioET dei virus sono le glicoproteine di superficie che sono comunemente usate per l'attaccamento e la fusione delle cellule ospiti, poiché sono spesso i principali antigeni e bersagli per terapie o vaccini. Con i recenti progressi nei pacchetti di elaborazione crioET, è diventato sempre più possibile raggiungere medie di risoluzione subnanometriche di queste glicoproteine 19,20,21,22. Uno di questi esempi è l'emoagglutinina (HA), la principale proteina sulla superficie dei virioni dell'influenza. Questa proteina non solo conduce sia il legame con il recettore che la fusione della membrana, ma copre anche il virione in modo incredibilmente denso, con centinaia di migliaia di HA su un singolo virione⁵. Il protocollo qui presentato (Figura 1) integra diversi pacchetti di uso comune con script interni per delineare le fasi dalla pre-elaborazione al perfezionamento del modello per una media del sottotomogramma dell'influenza HA.

NOTA: È possibile accedere ai set di dati di esempio utilizzati per questo protocollo all'indirizzo EMPIAR-12864, che include i due set di serie di inclinazione utilizzati per questo protocollo. Le serie di inclinazione sono raccolte da griglie immerse manualmente di virus dell'influenza A purificato con una dimensione fisica di pixel di 2,09 Å/pixel per garantire un campo visivo sufficientemente ampio in modo che ogni serie di inclinazione contenga diversi virioni e anche per rendere le ricostruzioni alla massima risoluzione possibile. Per i set di dati degli utenti, si consiglia di avviare il flusso di lavoro con filmati di inclinazione non elaborati. Questi set di dati sono stati elaborati e visualizzati utilizzando workstation ad alte prestazioni. La tabella dei materiali elenca l'hardware e il software utilizzati per questo protocollo. Tutti i pacchetti software utilizzati in questo protocollo sono open source e disponibili per il download; i link e le istruzioni per l'installazione sono elencati nella Tabella dei Materiali. La workstation consigliata per l'elaborazione dei set di dati cryoET dovrebbe essere dotata di almeno un processore a 8 core, una scheda GPU dedicata con 6 GB di VRAM, 64 GB di RAM e 2 TB di memoria locale.

1. Pre-elaborazione dei dati dei film di inclinazione e ricostruzione dei tomogrammi crioelettronici in Warp ²³ e IMOD ²⁴

1. In un terminale, attivare un ambiente conda in cui è installato Warp utilizzando il seguente comando:
   conda activate warp_environment
2. Creare un file di impostazioni della serie di fotogrammi per l'elaborazione delle serie di fotogrammi. Si tratta di un file di configurazione che contiene i metadati relativi al microscopio, la posizione dei dati da elaborare e la posizione in cui archiviare i file di output.
   WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
   NOTA: Questi dati sono stati raccolti in modalità super-risoluzione.
3. Esegui la stima della funzione di trasferimento del contrasto (CTF) e la correzione del movimento.
   WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
   NOTA: m_grid parametro dovrebbe corrispondere al numero di sottofotogrammi all'interno di un filmato tilt - i nostri set di dati consistevano in 5 sottofotogrammi per filmato tilt.
4. Importa i metadati delle serie tilt in modo che WarpTools possa identificare quali filmati appartengono a quali serie tilt.
   WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
5. Dopo aver compilato la cartella tomostar, creare un file di impostazioni della serie di inclinazione per l'elaborazione della serie di inclinazione
   WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
6. Scrivi stack di inclinazione ed esegui l'allineamento automatico della serie di inclinazione basato su fiduciale utilizzando il programma batchruntomo di IPOD utilizzando l'interfaccia grafica^{Etomo 24}.
   1. Esegui il seguente comando nel terminale:
      Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
      NOTA: Le tiltseries sono state esportate a 4 volte la dimensione fisica dei pixel per ridurre il tempo di allineamento e le risorse computazionali.
   2. Scegliere un set di dati di esempio per impostare i parametri di allineamento prima di applicarli come modello per batchruntomo.
   3. Importa i parametri di allineamento da IMOD se si utilizza batchruntomo.
      WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
      NOTA: Per questo set di dati, l'utilizzo della GUI di Etomo ha prodotto risultati migliori rispetto ai wrapper all'interno di WarpTools.
   4. In alternativa, esegui l'allineamento automatico delle serie inclinabili senza fiducial utilizzando il wrapper AreTomo²⁵ all'interno di WarpTools.
      WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
      NOTA: L'involucro AreTomo è stato testato con AreTomo1.3.4.
7. Esegui il seguente comando nel terminale per stimare i parametri CTF per le serie di inclinazione:
   WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
8. Ricostruisci i tomogrammi utilizzando WarpTools.
   1. Imposta la variabile di ambiente:
      export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
      NOTA: Questo passaggio garantisce che i tomogrammi siano compatibili con le fasi successive di elaborazione e visualizzazione delle immagini in altri software utilizzati in questo protocollo.
   2. Per ricostruire i tomogrammi, eseguire in un terminale: WarpTools ts_reconstruct --settings  warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
9. Ripetere i passaggi da 1.2 a 1.8.2 per tutti i set di dati.

2. Pre-elaborazione del tomogramma e prelievo delle particelle

1. In un terminale, attivare un ambiente conda con IsoNet²⁶ installato.
   conda activate isonet_env
2. Prepararsi per l'elaborazione dei tomogrammi creando prima una sottocartella e spostando tutti i tomogrammi in tale cartella.
   mkdir tomo_folder
mv tomograms*.mrc tomo_folder/
3. Generare un file asterisco nella cartella del progetto.
   isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
4. Utilizzando un editor di testo, aprire il file asterisco generato e immettere il valore approssimativo di sfocatura per le immagini con inclinazione di 0 gradi nella quarta colonna (_rlnDefocus) per ciascun tomogramma, che può essere posizionato nel file processed_items.json nella cartella warp_tiltseries.
   NOTA: Il valore di sfocatura dovrebbe essere in angstrom per IsoNet. Warp scrive i valori di sfocatura in μm, il che richiede un fattore di moltiplicazione di 10.000.
5. Esegui il comando CTF deconvolve nel terminale.
   isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
6. Dopo la deconvoluzione, avviare l'INTERFACCIA EMAN2²⁷ per iniziare la pre-elaborazione dei tomogrammi per il prelievo delle particelle.
   conda activate eman_env
e2projectmanager.py
7. In Tomografia, fai clic con il pulsante sinistro del mouse sulla freccia accanto a Dati grezzi e seleziona Importa tomogrammi dal menu a discesa.
8. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla freccia adiacente a Segmentazione e selezionare Pre-elabora tomogrammi.
   NOTA: i parametri predefiniti sono probabilmente adatti per molti set di dati. Per questi tomogrammi è stato applicato un filtro passa-basso a 4 Å e le immagini di inclinazione sono state normalizzate. Dopo la pre-elaborazione, EMAN2 genererà automaticamente una directory di informazioni con file .json vuoti (con nomi di base simili ai file pre-elaborati). L'angpix deve essere aggiunto ai file json prima del prelievo delle particelle.
9. Addestrare la rete neurale convoluzionale (CNN) a riconoscere la glicoproteina HA.
   1. Modificare la directory di lavoro con la posizione dei tomogrammi da utilizzare per l'addestramento CNN e il prelievo di particelle:
      cd path/to/tomograms
   2. Utilizzare il terminale per aprire la finestra di formazione della CNN.
      e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
   3. Verificare che siano aperte quattro finestre: una contenente le informazioni sui parametri e i tomogrammi della CNN nella directory e le altre tre finestre contenenti immagini di riferimenti validi (positivi), riferimenti errati (negativi) e particelle selezionate dalla CNN (particelle).
   4. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul pulsante Nuovo sulla GUI della CNN per inizializzare una nuova CNN. Imposta la velocità di apprendimento predefinita su 0,0001 e la dimensione della casella su 8.
   5. Nella colonna Nome file , fare clic con il pulsante sinistro del mouse su un tomogramma rappresentativo per aprirlo in una nuova finestra.
      NOTA: È possibile aprire un solo tomogramma alla volta.
      1. Per spostarsi lungo l'asse z di un tomogramma, posizionare il cursore sul tomogramma aperto e premere la rotellina di scorrimento del mouse del computer per aprire una nuova finestra. Il dispositivo di scorrimento con l'etichetta N# cambierà l'asse z.
   6. Sul tomogramma aperto, selezionare 10-20 feature corrispondenti all'HA utilizzando il pulsante sinistro del mouse nel pannello Positivo.
      NOTA: selezionare entrambe le viste superiore e laterale dell'HA, che appaiono come cilindri o triangoli sopra la membrana, come buoni riferimenti per una rete più robusta.
      1. Le immagini dei riferimenti positivi appariranno nella finestra Positivo . Per rimuovere un riferimento, tieni premuto il tasto Maiusc e fai clic con il pulsante sinistro del mouse su un'immagine di riferimento.
   7. Passa al pannello Negativo e seleziona 10-20 riferimenti corrispondenti a caratteristiche quali patch di membrana vuote, densità di vRNP, marcatori fiduciali e detriti.
      NOTA: I riferimenti appariranno nella finestra Negativo .
   8. Avvia l'addestramento CNN facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sul pulsante Train nella finestra principale.
      NOTA: Il numero di iterazioni (Niter) nella finestra principale cambia il numero di iterazioni di addestramento a cui viene sottoposta la CNN. Si consiglia di impostare il parametro su 50.
   9. Una volta che la CNN è stata addestrata sui riferimenti selezionati, fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Applica per utilizzare la CNN per prelevare le particelle nel tomogramma aperto.
      NOTA: Le immagini delle particelle selezionate possono essere visualizzate nella finestra Particolazioni. Le particelle selezionate verranno visualizzate anche sul tomogramma in cerchi blu.
   10. Continuare a selezionare i riferimenti positivi e negativi in base alla rete applicata, salvando periodicamente lo stato di avanzamento tramite il pulsante Salva .
   11. Una volta soddisfatto, selezionare Applica tutto per fare in modo che la CNN selezioni le particelle in tutti i tomogrammi nella directory e valuti i risultati su diversi tomogrammi; Eseguire ulteriore formazione secondo necessità.
10. Salva le coordinate in un file di testo per ogni tomogramma.
    1. Aprire la GUI di EMAN2 utilizzando il e2projectmanager.py comando.
    2. Fare clic sulla freccia accanto a Media sottotomogramma e fare clic su Boxing manuale.
    3. Inserisci il nome di un tomogramma e fai clic su Avvia.
    4. Salvare le coordinate nel file di testo selezionando File > Salva casella > tomogram_ha.txt Coord.
    5. Passare alla sottocartella neuralnets e alla sottocartella info per eseguire il backup di nnet_save.hdf, trainouts.hdf, segouts.hdf e boxes3dref.hdf.
11. Per garantire che l'analisi venga eseguita solo su virioni completamente assemblati in cui è evidente la presenza dello strato proteico della matrice (M1) e del complesso ribonucleoproteico virale (vRNP), addestrare una seconda rete neurale convoluzionale a riconoscere la proteina M1.
    1. Segui lo stesso protocollo descritto nel passaggio 2.9, modificando le dimensioni della scatola di allenamento da 8 a 14.

3. Cura delle particelle

1. Scarica i blocchi appunti da https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis.
2. Aprire il notebook CNN_Particle_Cleaning.ipynb e caricare i moduli necessari.
   NOTA: lo script utilizza Open3D²⁸ come pacchetto per visualizzare le coordinate delle particelle come nuvole di punti 3D.
3. Carica i file di testo corrispondenti alle coordinate HA e M1 e visualizzali come nuvole di punti 3D utilizzando il pacchetto Open3D.
4. Filtra gli outlier delle coordinate HA utilizzando la rimozione statistica degli outlier implementata in Open3D.
   NOTA: I valori iniziali suggeriti per HA sono nb_neighbors = 50 (numero di coordinate vicine attorno a una coordinata) e std_ratio = 0,5.
5. Calcola la distanza tra le nuvole di punti HA e M1. Tutte le coordinate HA a più di 20 pixel di distanza dalla nuvola di punti M1 verranno quindi identificate come valori anomali. Tutte le coordinate delle particelle non identificate come valori anomali verranno salvate in un file di .txt di output.
   NOTA: 20 pixel corrispondono a una distanza approssimativa di 16 nm con una dimensione dei pixel di 8,35 Å/pixel. Il centro di un trimero HA rispetto allo strato M1 è di circa 15 nm nei nostri tomogrammi.
6. Concatena tutte le particelle e salvale come file stellari usando pts2starfile.ipynb.

4. Media e classificazione iterativa del sottotomogramma

1. Utilizzando WarpTools, estrarre le particelle con un fattore di binning di 4 ed eseguire cicli iniziali di subtomogramma con una media di RELION4²⁹.
   WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
   NOTA: La dimensione della scatola suggerita è di 48 x 48 x 48 pixel, corrispondente a una scatola di ~360 ųche sarebbe abbastanza grande da contenere un array di 7-8 HA.
   1. Converti warp starfile in file compatibili con RELION 4
      relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
   2. Generare un riferimento iniziale utilizzando relion_refine_mpi su un sottoinsieme di particelle.
      head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star
mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
   3. Utilizzare relion_refine_mpi per eseguire l'autoraffinazione 3D sui sottotomogrammi.
      1. Comando di esempio: mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
         NOTA: Il campionamento iniziale globale e locale è stato impostato a 7,5 e 1,8 gradi, corrispondenti a un ordine di healpix di 4 e un healpix locale di 2. I perfezionamenti iniziali sfruttano principalmente la forte densità della membrana, la proteina M1 e l'array HA. L'intervallo di offset di traslazione può essere più ampio per comprendere eventuali spostamenti che possono verificarsi durante l'allineamento dell'array.
   4. Ripetere l'affinamento dopo la convergenza del primo ciclo di perfezionamento, modificando la traslazione in 8 e il passo in 2.
2. Sfrutta la classificazione 2D per scartare le particelle spazzatura utilizzando relion_refine.
   1. Comando di esempio: relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002.
      NOTA: La classificazione 2D è stata utilizzata al posto della classificazione 3D in quanto è più efficiente dal punto di vista computazionale. I sottotomogrammi possono essere utilizzati direttamente come input per il lavoro di classificazione 2D senza ulteriore elaborazione delle immagini.
   2. Combina le classi contenenti un array HA identificabile contenente HA cilindrico, membrana e densità M1 utilizzando relion_star_handler.
   3. Innanzitutto, crea file speciali contenenti classi valide.
      relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
   4. Quindi, utilizzare il seguente comando relion_star_handler per combinare i singoli file speciali.
      relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
3. Estrarre nuovamente le particelle bin2 e non binnate per un raffinamento locale iterativo.
   1. Per l'affinamento di bin2, estrarre le particelle utilizzando una scatola di dimensioni inferiori a 80 e condurre la ricerca locale sia con healpix che con healpix locale impostati su 4 (campionamento angolare locale di 1,8 gradi).
   2. In questa fase, combina set di particelle da diversi set di dati utilizzando relion_star_handler.
      relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
   3. Dopo il primo ciclo di raffinamento, creare una maschera cilindrica utilizzando e2filtertool.py all'interno dell'ambiente EMAN2 che comprende l'HA centrale più la membrana e la densità M1.
      NOTA: Parametri utilizzati per la maschera cilindrica: cx=24, cy=24, outer_radius=8, zmax=40, zmin=12; Tutti gli altri parametri sono deselezionati.
   4. Esegui un ulteriore ciclo di rifinitura con la maschera applicata.
   5. Conduci un altro ciclo di classificazione 2D per eliminare i valori anomali che non si allineano con l'HA centrale e i detriti aggiuntivi.
   6. Ripeti il processo con particelle non raggruppate con una dimensione della scatola di 120 e crea una maschera morbida che copre l'HA centrale, allinea il riferimento alla simmetria C3 e applica la simmetria in questa fase di raffinamento.
      relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
      NOTA: La risoluzione finale ottenuta con RELION è stata di 6,1 Å.
4. Perfezionamento finale in MTools⁹
   1. Crea una popolazione di raffinamento (dopo l'attivazione dell'ambiente Warp conda).
      MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
   2. Aggiungere origini dati per ogni set di dati.
      MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
      1. Ripetere il passaggio precedente con set di dati aggiuntivi.
   3. Crea la specie di raffinamento.
      MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
   4. Raffinazione multiparticellare.
      1. Per prima cosa perfeziona le pose delle particelle con il comando: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
      2. Successivamente, affina sia le pose delle particelle che l'aberrazione sferica con il comando: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
         NOTA: Il perfezionamento è stato interrotto qui poiché ulteriori iterazioni non hanno migliorato la risoluzione. Diverse combinazioni di parametri che non sono state testate in modo esaustivo, tuttavia, possono continuare a migliorare i risultati.

5. Perfezionamento del modello

1. Utilizzando ChimeraX³⁰, caricare la mappa finale e un modello atomico di HA.
2. Mappa e combina i segmenti che corrispondono all'ectodominio HA e utilizza lo strumento Adatta ai segmenti per ancorare il modello HA.
   1. Salva le coordinate trasformate del modello.
3. Apri la GUI di Phenix³¹ e usa lo strumento Real Space Refinement .
   1. Quando viene richiesto di aggiungere file, aggiungere il modello HA trasformato e la mappa e inserire la risoluzione della ricostruzione finale.
   2. Conduci cinque cicli di minimizzazione globale, adattamento del rotamer locale, perfezionamento dell'occupazione e perfezionamento dell'ADP di gruppo.
4. Visualizza la ricostruzione finale e modella utilizzando ChimeraX.

Per dimostrare l'utilizzo di questo protocollo di elaborazione (Figura 1), il flusso di lavoro precedentemente descritto è stato applicato a due set di dati di 25 tomogrammi combinati, ottenuti da un ceppo virale dell'influenza A H1N1 (A/Puerto Rico/8/1934). I parametri di raccolta dei dati sono descritti nella Tabella 1. La Figura 2 illustra un tomogramma rappresentativo e le viste ingrandite dei virioni dell'influenza pleomorfa. In questo tomogramma vengono catturate varie morfologie, poiché i virioni variano da sferici a ovali/allungati nella forma. Mentre la maggior parte delle particelle influenzali contiene assemblaggi M1 e vRNP ben organizzati, alcuni virioni sembrano essere più disorganizzati e mancano di componenti strutturali cruciali.

Da questo set di dati, è stato utilizzato un set iniziale di 40.995 sottotomogrammi per la ricostruzione del bin4 (8,35 Å/pix) dopo il prelievo e la cura delle particelle. I due set di dati sono stati inizialmente elaborati in modo indipendente in RELION4 con simmetria C1 e un'ampia maschera sferica che comprendeva l'array HA complessivo. Per questi sottotomogrammi sono stati eseguiti tre cicli di raffinamento, seguiti dalla classificazione 2D. Dopo la classificazione, i sottotomogrammi mal risolti e le particelle spazzatura sono stati scartati; i sottotomogrammi rimanenti sono stati estratti a bin2 (4,17 Å/pix) e i due set di dati sono stati combinati. I sottotomogrammi Bin2 sono stati prima allineati insieme in un ciclo di media del sottotomogramma, quindi è stata applicata una maschera cilindrica attorno all'HA centrale per l'allineamento della messa a fuoco. In questa fase, la simmetria trimerica può essere chiaramente visualizzata per la ricostruzione dell'HA. Ulteriori cicli di affinamento sono stati effettuati a bin2 e a 2,8 Å/pix. Un ultimo round di classificazione 2D è stato condotto con una piccola maschera che copriva solo il trimero HA centrale con sottotomogrammi allineati. La classe principale, costituita da ~94% dei sottotomogrammi rimanenti, è stata estratta in particelle non binnate e sottoposta a raffinamento 3D con simmetria C3 applicata. Infine, questi sottotomogrammi sono stati esportati in M, dove sono state eseguite le pose delle particelle e i cicli di affinamento dell'aberrazione sferica (Figura 1 supplementare).

La media finale del sottotomogramma (Figura 3A), composta da 15.970 particelle di HA, ha raggiunto una risoluzione globale di 6,0 Å e un intervallo di risoluzione locale di 5-7 Å (Figura 4). Un modello di PR8 HA è stato raffinato in modo flessibile nella densità; a FSC=0,5 e FSC=0,143, la risoluzione mappa-modello era rispettivamente di 8,1 Å e 6,6 Å. L'architettura della ricostruzione dell'HA assomigliava molto alle precedenti mappe cryoEM e cryoET. A questa risoluzione si possono distinguere alfa-eliche e fogli beta (Figura 3B); inoltre, i glicani possono iniziare ad essere identificati in quattro siti di glicosilazione sulla testa e sullo stelo dell'HA (Figura 3C).

I nostri risultati mostrano l'idoneità della crioET nella ricostruzione di HA da virioni influenzali nativi. Attraverso il protocollo, è stata osservata una chiara densità per la glicoproteina cilindrica perpendicolare alla membrana virale e la risoluzione è migliorata ad ogni passaggio. Per i propri dati, si suggerisce che la media del sottotomogramma dovrebbe iniziare da una pila di particelle in binned e i risultati dovrebbero essere attentamente monitorati ad ogni ciclo di raffinazione. Se la densità delle glicoproteine non è evidente fin dalle fasi iniziali, si consiglia di mappare nuovamente le posizioni del sottotomogramma sul tomogramma per verificare il posizionamento accurato. In caso contrario, è possibile modificare i parametri di allineamento o implementare ulteriori fasi di classificazione per ottenere risultati ottimali.

Figura 1: Pipeline complessiva per la media del sottotomogramma dell'HA da crioET del virus dell'influenza. Il pannello superiore rappresenta un flusso di lavoro di riepilogo per i due set di dati utilizzati per dimostrare il protocollo. Il secondo pannello corrisponde alla Sezione 1 del protocollo, il terzo pannello corrisponde alle Sezioni 2-3 e il quarto pannello corrisponde alle Sezioni 4-5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Tomogramma rappresentativo del virus dell'influenza PR8. (A) Tagliare il tomogramma ricostruito. La barra della scala è di 100 nm. (B-D) Ingrandito in vista del virione PR8 (B) sferico, (C) cilindrico, (D) PR8 senza M1. Tutte le barre della scala in B-D corrispondono a 50 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Media del sottotomogramma di PR8 HA. (A) Vista dall'alto e laterale della ricostruzione HA a due livelli di contorno dotata in modo flessibile di una struttura crioEM a singola particella PR8 HA. (B) Viste ritagliate attraverso la ricostruzione HA. Le frecce colorate corrispondono a caselle colorate. (C) Ricostruzione dell'HA mostrata al contorno inferiore per svelare la densità dei glicani. Vengono mostrate anche viste ravvicinate dei glicani nella rappresentazione a bastoncino nella mappa cryoET. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Stima della risoluzione della media del sottotomogramma HA. (A) Stima della risoluzione locale della media del sottotomogramma HA mappata sulla ricostruzione. La barra dei colori raffigura 5-7 Å sulla tavolozza blu-bianco-rosso. (B) Curve FSC di semimappe e di risoluzione mappa-modello. La curva blu è della ricostruzione smascherata, e il rosso è della mascherata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Parametri di raccolta dati per i set di dati cryoET del virus dell'influenza PR8.

Figura 1 supplementare: Flusso di lavoro della media del sottotomogramma per l'HA. L'allineamento iterativo, la media e la classificazione sono condotti per i sottotomogrammi HA attraverso l'unbinning graduale. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.