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Effetti dell'unguento umido esposto per ustioni sulla neovascolarizzazione della ferita e sul mir-31-5p esosomiale plasmatico nei topi diabetici

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DOI:

10.3791/68649

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26 agosto 2025

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1Department of Endocrinology, The Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Cardiology, General Hospital of Central Theater Command, 3Key Laboratory for the Prevention and Treatment of Diabetic Chronic Wounds in Baise City, 4Key Laboratory of Metabolic Diseases in Baise City

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive come l'unguento per ustioni esposto all'umidità promuova la riparazione delle ferite diabetiche regolando dinamicamente la neovascolarizzazione delle ferite diabetiche e l'espressione del mir-31-5p esosomiale plasmatico.

Abstract

L'unguento per ustioni esposto all'umidità (MEBO) è una medicina tradizionale cinese usata per trattare le ferite diabetiche croniche; Tuttavia, il meccanismo sottostante non è chiaro. Recenti evidenze suggeriscono il ruolo degli esosomi e dei miRNA funzionali nella neovascolarizzazione delle ferite. Qui, abbiamo mirato a studiare gli effetti di MEBO sulla neovascolarizzazione della ferita e sull'espressione plasmatica di mir-31-5p esosomiale (pExo-mir-31-5p) nei topi diabetici. Un totale di 120 topi C57BL/6 sono stati divisi in modo casuale in un gruppo di controllo non diabetico (n = 24) e un gruppo diabetico indotto da streptozotocina (n = 96), che è stato ulteriormente randomizzato in gruppi di controllo diabetico, MEBO, beifuxin e MHY1485 (n = 24 ciascuno). Sono stati stabiliti cinque gruppi con modelli di resezione cutanea a tutto spessore, che sono stati trattati rispettivamente con soluzione fisiologica, soluzione fisiologica, MEBO, beifuxin e MHY1485. Nei giorni 1, 7, 13 e 18, il tasso di chiusura della ferita, la densità dei microvasi e i livelli di espressione di pExo-mir-31-5p, insieme ai livelli di mRNA e proteine di VPS4a e Rab27a nei tessuti della ferita, sono stati analizzati utilizzando rispettivamente ImageJ, colorazione con ematossilina-eosina (HE), reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) e western blot (WB). Inoltre, sono state analizzate le correlazioni tra l'espressione di VPS4a, la proteina Rab27a, pExo-mir-31-5p, e la densità dei microvasi. Abbiamo scoperto che MEBO promuove la riparazione delle ferite nei topi diabetici (p < 0,050). Ha migliorato la neovascolarizzazione della ferita durante le fasi iniziali e intermedie della guarigione della ferita, ma l'ha inibita durante la fase successiva (p < 0,050). MEBO ha sovraregolato l'espressione dell'mRNA e della proteina Vps4a e Rab27a nei tessuti delle ferite, così come pExo-mir-31-5p durante le fasi iniziali e intermedie della guarigione, mentre li ha sottoregolati nella fase successiva (p < 0,050). Inoltre, VPS4a, la proteina Rab27a, l'espressione di pExo-mir-31-5p e la densità dei microvasi sono risultati positivamente correlati nei topi trattati con MEBO (p < 0,050). In conclusione, MEBO regola dinamicamente la neovascolarizzazione della ferita e l'espressione di pExo-mir-31-5p nei topi diabetici, fornendo un nuovo supporto teorico per la sua applicazione clinica.

Introduzione

La prevalenza del diabete mellito nei pazienti anziani è elevata e aumenta ogni anno. La malattia è associata a ferite diabetiche croniche (CDW), che hanno un effetto dannoso sulla salute, sulla funzione e sulla qualità della vita complessiva del paziente1. In genere, la chiusura della ferita prevede quattro fasi distinte: emostasi, infiammazione, proliferazione e riepitelizzazione2. Di queste, la fase proliferativa è la più importante. Durante la prima fase proliferativa, le cellule endoteliali capillari proliferano e migrano verso la ferita, facendo germogliare nuovi vasi e formando una rete intricata3. Tuttavia, nelle fasi successive della riparazione della ferita, la maggior parte della lumina capillare subisce un'occlusione, con una minoranza che passa in piccole arterie e vene. Nei pazienti con CDW, la perdita di tessuto, la necrosi e la cancrena, e diversi livelli di infiammazione e iperglicemia, interrompono l'equilibrio dinamico tra angiogenesi e antiangiogenesi, ritardando la guarigione delle ferite, specialmente quando l'angiogenesi è compromessa 4,5,6. L'unguento per ustioni esposto all'umidità (MEBO) è una medicina tradizionale cinese usata per trattare i CDW, ma il suo meccanismo rimane poco chiaro. Recentemente, diversi studi hanno dimostrato che i miRNA carichi di esosomi potrebbero promuovere l'angiogenesi e quindi promuovere la guarigione delle ferite diabetiche 7,8. Tuttavia, pochi studi hanno studiato l'associazione tra MEBO e miRNA trasportati da esosomi. Pertanto, è necessario rivelare il meccanismo con cui MEBO stimola l'angiogenesi nelle CDW dal punto di vista dell'esosoma e del miRNA funzionale.

Gli esosomi sono vescicole membranose sferiche rilasciate da cellule viventi, che misurano 30-200 nm di dimensione, 1,1-1,2 g/mL di densità e contengono proteine marcatrici come CD81 e suscettibilità tumorale 101 (TSG101)9. La produzione e la secrezione di esosomi sono classificate in complessi di smistamento endosomiale necessari per il trasporto (ESCRT) e percorsi non ESCRT-dipendenti. I regolatori più critici all'interno di queste vie sono la proteina vacuolare di smistamento 4 omologo a (VPS4a) e la proteina Rab-27a correlata a Ras (Rab27a)10,11,12. Vps4a agisce come ATPasi, catalizzando il processo di rimodellamento della membrana ESCRT-dipendente, che regola la dimensione dell'esosoma e il tasso di formazione dell'esosoma13,14. Rab27a è una piccola GTPasi essenziale che regola l'aggancio dei corpi multivescicolari alla membrana plasmatica15. La secrezione di esosoma è regolata negativamente dal bersaglio dei mammiferi del complesso 1 della rapamicina (mTORC1)16, che è attivato da MHY1485 legame competitivo al dominio strutturale dell'ATP della rapamicina17. Nel complesso, MHY1485 potrebbe inibire indirettamente la sintesi e la secrezione degli esosomi. Gli esosomi possono essere rilevati in quasi tutti i fluidi corporei. Gli esosomi plasmatici sono più produttivi degli esosomi derivati da altri fluidi corporei18. Inoltre, gli esosomi proteggono gli acidi nucleici che trasportano dalla degradazione19.

I miRNA sono piccole molecole di RNA non codificanti che regolano l'attività cellulare20. Gli esosomi sono stati scoperti in abbondanza in numerosi miRNA cruciali per migliorare l'angiogenesi delle ferite, in particolare mir-126, mir-125a e mir-31-5p. Uno studio precedente ha dimostrato che gli esosomi derivati da cellule staminali mesenchimali del midollo osseo che sovraesprimono mir-126 promuovono la proliferazione, la migrazione e la formazione di tubi delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana in vitro trasferendo mir-12621. Un altro studio ha indicato che gli esosomi secreti dalle cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa umana trasferiscono il mir-125a alle cellule endoteliali e promuovono l'angiogenesi reprimendo l'inibitore angiogenico delta-like 4 nelle ferite9. Yan et al. hanno riferito che il mir-31-5p caricato negli esosomi del latte ha migliorato le funzioni delle cellule endoteliali in vitro, promosso l'angiogenesi e migliorato la guarigione delle ferite diabetiche in vivo22. Tra questi miRNA, il mir-31-5p era l'unico miRNA che era significativamente sottoregolato nelle ferite dei topi diabetici rispetto a quello nelle ferite dei topi normali22.

MEBO è un unguento oleoso che può essere utilizzato per trattare ferite refrattarie come i CDW23,24. Tuttavia, il meccanismo della MEBO che promuove la guarigione delle ferite non è stato chiarito. Studi precedenti hanno dimostrato che la MEBO promuove la neovascolarizzazione della ferita sovraregolando l'espressione del fattore di crescita dell'endotelio vascolare nei ratti diabetici25. Tuttavia, solo pochi studi hanno affrontato questo problema dal punto di vista dei miRNA trasportati da esosomi. In questo studio, per studiare gli effetti della MEBO sulle CDW, abbiamo indotto un modello di ferita a tutto spessore in topi diabetici utilizzando streptozotocina (STZ) e una dieta ricca di grassi. Abbiamo dimostrato che la MEBO ha accelerato significativamente la guarigione delle ferite nei topi diabetici. Inoltre, abbiamo studiato gli effetti di MEBO sulla densità dei microvasi, sui livelli di espressione di pExo-mir-31-5p, insieme all'mRNA e alla proteina VPS4a e Rab27a nei tessuti delle ferite. Pertanto, abbiamo ipotizzato che MEBO promuovesse la guarigione delle ferite regolando pExo-mir-31-5p per regolare l'angiogenesi delle ferite nei topi diabetici. Una panoramica schematica del disegno dello studio è presentata nella Figura 1.

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Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Youjiang Medical University for Nationalities, Baise, Cina (2018051501). I topi maschi C57BL/6 privi di patogeni specifici (SPF) (7 settimane di età) sono stati ospitati nel Centro per animali da laboratorio SPF dello Youjiang Medical College for Nationalities e alimentati con una dieta normale o ricca di grassi e acqua pulita. Durante lo studio, la temperatura della stanza di alimentazione degli animali è stata mantenuta tra 23 °C e 25 °C, l'umidità è stata compresa tra il 40% e il 60% e il ciclo luce/buio è stato di 12 ore. La cura degli animali è stata fornita in conformità con le linee guida del National Institutes of Health degli Stati Uniti e del Chinese National Institute of Health (Pechino, Cina). Tutti gli interventi chirurgici sono stati eseguiti in anestesia con pentobarbital sodico (0,3%, 50 mg/kg) utilizzando un protocollo standardizzato stabilito nel nostro laboratorio. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre il numero di animali utilizzati e per ridurre al minimo il disagio degli animali. Tutte le sezioni di questo rapporto aderiscono alle linee guida ARRIVE per la segnalazione della ricerca sugli animali.

Modello e trattamento della ferita nel topo
Un totale di 120 topi sono stati assegnati in modo casuale a un gruppo di controllo non diabetico (NDB-CTR; n = 24) o diabetico (n = 96). Per simulare il diabete umano di tipo 2, i topi del gruppo diabetico sono stati alimentati con una dieta ricca di grassi e zuccheri raffinati per 4 settimane e poi iniettati per via intraperitoneale (ip) con STZ (100 mg / kg), una volta al giorno, per 2 giorni consecutivi dopo il digiuno per 16 ore. I livelli di glucosio nel sangue a digiuno sono stati misurati il 5° e il 6° giorno dopo l'iniezione di STZ. I topi con valori di glucosio nel sangue a digiuno superiori a 16,7 mmol/L in due occasioni e con sintomi come polifagia, polidipsia, poliuria e perdita di peso sono stati considerati modelli di diabete di successo26. Dopo 1 settimana, i peli dorsali sono stati rasati e sul dorso di ciascun topo è stata generata una ferita cutanea rotonda a tutto spessore (diametro = 15 mm) dopo somministrazione intraperitoneale di pentobarbital sodico (0,3%, 50 mg/kg). I topi del gruppo diabetico sono stati assegnati in modo casuale ai gruppi MEBO, BFX (beifuxin), DB-CTR (controllo diabetico) o MHY1485 (MHY). I topi dei gruppi MEBO e BFX sono stati trattati con MEBO (0,2 g/cm2) e BFX gel (0,2 g/cm2) applicati sulla ferita una volta al giorno, rispettivamente. Il gel BFX, il cui nome generico è bovine basic fibroblast growth factor gel, è un farmaco topico usato per trattare le ferite croniche27. I topi dei gruppi NDB-CTR, DB-CTR e MHY sono stati trattati con soluzione fisiologica. Il gruppo MHY è stato anche trattato con MHY1485 (10 mg/kg, ip) per 2 giorni consecutivi. Ai topi diabetici è stata iniettata per via sottocutanea insulina alla dose di 2-4 UI/kg una volta al giorno per controllare il livello di glucosio nel sangue.

Raccolta dei campioni
Nei giorni 1, 7, 13 e 18, sei topi di ciascun gruppo sono stati selezionati casualmente per l'eutanasia mediante lussazione cervicale e campioni di tessuti epidermici a forma di anello, compresa la ferita, sono stati prelevati a 0,5 cm dal bordo della ferita con forbici per tessuti sterili. Quindi i tessuti della ferita sono stati raccolti per la colorazione HE, l'analisi qPCR e i saggi WB. I campioni di sangue sono stati raccolti da topi nei gruppi DB-CTR e MEBO utilizzando il metodo retro-orbitale in anestesia con pentobarbital di sodio. I campioni di sangue sono stati mescolati con eparina in provette anticoagulanti e centrifugati a 3.000 x g per 15 minuti per recuperare il surnatante plasmatico. Tutti i campioni sono stati conservati a -80 °C. Per calcolare il tasso di chiusura della ferita, è stata utilizzata una fotocamera digitale per acquisire immagini della guarigione della ferita in un punto temporale fisso e a una distanza uguale con una scala graduata sul lato. L'area della ferita è stata misurata utilizzando il software ImageJ. Il tasso di chiusura della ferita è stato calcolato come segue:

tasso di chiusura della ferita (%) = [W1-Wn] / W1 x 100%

dove W1 e Wn si riferiscono alle aree della ferita rispettivamente nei giorni 1 e n.

Test istopatologico
La colorazione HE è stata eseguita per osservare dinamicamente la guarigione patologica delle ferite. Dopo la fissazione con una soluzione di paraformaldeide al 4% per 16 ore, i tessuti della ferita sono stati disidratati, immersi in paraffina e quindi tagliati in sezioni di 3 μm. La colorazione HE è stata eseguita su vetrini di tessuto. Per esplorare la densità dei microvasi dei tessuti della ferita, i vetrini di tessuto sono stati ripresi utilizzando un microscopio ottico. Per quantificare la densità dei microvasi di ciascun campione, abbiamo selezionato l'area con la più alta densità capillare al microscopio 10x, quindi abbiamo selezionato e fotografato tre aree non sovrapposte al microscopio 20x. Le densità dei microvasi sono state calcolate e mediate utilizzando ImageJ.

Isolamento e caratterizzazione di esosomi plasmatici
L'ultracentrifugazione è stata eseguita per isolare gli esosomi plasmatici secondo un protocollo pubblicato con modifiche minori28. In breve, 2 mL di plasma sono stati centrifugati a 2.000 x g a 4 °C per 30 minuti. Il surnatante è stato centrifugato nuovamente a 10.000 x g a 4 °C per 45 minuti per rimuovere le vescicole più grandi. Il surnatante è stato filtrato attraverso una membrana filtrante da 0,45 μm e il filtrato è stato raccolto. Il filtrato è stato quindi centrifugato a 100.000 x g a 4 °C per 70 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, il pellet è stato risospeso con 10 mL di 1x PBS pre-raffreddato e centrifugato a 4 °C, 100.000 x g, per 70 minuti. Il surnatante è stato rimosso e il pellet è stato risospeso con 150 μL di 1x PBS pre-raffreddato e conservato a -80 °C. Per confermare gli esosomi plasmatici raccolti sopra, abbiamo utilizzato la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per determinare la morfologia degli esosomi, un sistema di citometria a nano-flusso per analizzare le dimensioni e la concentrazione degli esosomi e WB per rilevare i livelli di espressione dei marcatori esosomici CD81 e TSG101.

Estrazione dell'RNA, trascrizione inversa (RT) e qPCR
La qPCR è stata eseguita per quantificare i livelli di espressione dell'mRNA di Vps4a, Rab27a e pExo-mir-31-5p. I tessuti della ferita sono stati raccolti per estrarre l'RNA totale utilizzando il reagente di estrazione dell'RNA. Una concentrazione totale di RNA compresa tra 400 e 700 ng/μL è stata considerata accettabile. I campioni di RNA sono stati trascritti inversamente in cDNA utilizzando la trascrittasi inversa con dsDNasi secondo le istruzioni del produttore. La qPCR è stata eseguita utilizzando la miscela qPCR verde SYBR (senza ROX). Per quanto riguarda il mir-31-5p, l'RNA dagli esosomi plasmatici è stato estratto utilizzando il mini kit, trascritto inversamente utilizzando il kit di sintesi del cDNA del primo filamento e amplificato utilizzando SYBR Green qPCR Master Mix. Le espressioni di mRNA e miRNA sono state analizzate utilizzando il metodo 2-ΔΔCt relativo rispettivamente a β-actina e cel-mir-39. I primer utilizzati sono presentati nella Tabella 1.

Western blot
Il test WB è stato utilizzato per rilevare i livelli di espressione delle proteine Vps4a e Rab27a, nonché i livelli dei marcatori esosomici CD81 e TSG101. I livelli proteici totali dei tessuti della ferita e gli esosomi plasmatici sono stati estratti mediante tampone di lisi RIPA e la concentrazione proteica è stata determinata dal kit per il saggio delle proteine dell'acido bicinchoninico. Un totale di 50 μg di proteine è stato separato da sodio dodecil solfato-poliacrilammide. Dopo il tamponamento sulle membrane di fluoruro di polivinilidene, le membrane sono state bloccate con albumina sierica bovina, quindi incubate a 4 °C per una notte con anticorpi contro Vps4a (1:3000), Rab27a (1:1000), gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) (1:5000), CD81 (1:3000), TSG101 (1:3000), quindi incubate con anticorpi secondari, coniugata perossidasi IgG anti-coniglio (1:3000), a 37 °C per 1 ora. Le membrane sono state visualizzate utilizzando un kit di chemiluminescenza potenziato.

Analisi statistica
Tutti i dati presentati in questo studio sono stati analizzati per la significatività statistica utilizzando il software SPSS. Tutti i risultati ottenuti in queste analisi sono stati visualizzati utilizzando il software GraphPad Prism. Le differenze tra i due gruppi sono state esaminate utilizzando un t-test campione indipendente. Per i confronti di più gruppi, l'analisi unidirezionale della varianza è stata utilizzata per i dati di varianza omogenei, mentre il test di Welch è stato applicato ai dati di varianza eterogenei. Inoltre, abbiamo utilizzato il test della differenza meno significativa per il confronto a coppie di dati di varianza uguale e il test T2 di Tamhane per i dati di varianza disuguale. I dati quantitativi sono presentati come media ± deviazione standard. Le correlazioni sono state analizzate utilizzando l'analisi di correlazione di Spearman per variabili non normalmente distribuite e sono state descritte come coefficienti di correlazione e intervalli di confidenza al 95%. P < 0,050 è stato considerato statisticamente significativo. Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti almeno tre volte.

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Risultati

MEBO accelera la guarigione delle ferite nei topi diabetici
Per convalidare l'efficacia di MEBO nelle ferite diabetiche, abbiamo stabilito un modello di ferita diabetica e abbiamo scattato fotografie nei giorni 1, 7, 13 e 18. Le ferite in ciascun gruppo sono guarite gradualmente nel tempo (Figura 2A). Le ferite nel gruppo NDB-CTR sono guarite completamente entro il giorno 18. Le ferite nel gruppo MEBO sono guarite più rapidamente tra le ferite diabetiche, formando alcune ...

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Discussione

Le CDW, una complicanza del diabete, possono portare a una significativa mortalità e disabilità e sono spesso associate a disturbi vascolari29. MEBO è efficace nel trattamento delle CDW; tuttavia, il suo meccanismo sottostante non è chiaro30. Pertanto, abbiamo mirato a esaminarlo dal punto di vista degli esosomi e dei miRNA funzionali. In questo studio, abbiamo scoperto che il tasso di chiusura della ferita e la densità dei microvasi del gr...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China nell'ambito di una sovvenzione [numero 81960875], dalla Guangxi Natural Science Foundation nell'ambito di una sovvenzione [numero 2023GXNSFDA026008], dal Guangxi Medical and Health Appropriate Technology Development and Application Project nell'ambito di una sovvenzione [numero S2022134], dalla Guangxi Zhuang Autonomous Region Health Commission of western medicine autofinanziato da una sovvenzione [numero 20210234] e dal Guangxi Bureau of Traditional Chinese Medicine autofinanziato progetto di ricerca nell'ambito di Grant [numero GZZC2020255].

Contributo dell'autore:
Yuanyuan Xu: Scrittura - bozza originale, Software, Metodologia, Indagine, Analisi formale, Concettualizzazione. Jianchang Xu: Risorse, Metodologia, Indagine. Anbang Zhou: indagine, analisi formale. Nimiao Cen: Visualizzazione, Lina Huang: Supervisione. Biaoliang Wu: Scrittura-revisione e editing, Risorse, Amministrazione del progetto, Metodologia, Acquisizione di finanziamenti, Cura dei dati, Concettualizzazione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1&volte; PBS Solarbio (Pechino, Cina)#P1020Soluzione tamponata
Soluzione di paraformaldeide al 4%Solarbio (Pechino, Cina)#P1110Fissare il tessuto
anti-coniglio IgG perossidasi coniugata Affinità#S0001Anticorpo secondario
Gel di BeifuxinEssexbio (Zhuhai, Cina)#042404A06Un unguento per curare le ferite croniche
Anticorpo CD81Anticorpo delle vie di segnale#41779Anticorpi primari
Kit di chemiluminescenza potenziata Epizyme(Cina)#SQ101Kit di chemiluminescenza per banda proteica
Anticorpo contro la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH)Affinità#AF7021Anticorpi primari
Prisma GraphPadhttps://www.graphpad.com/prism/Visualizzazione
ImmagineJ https://imagej.net/ij/Misura l'area della ferita 
Kit per il dosaggio istantaneo delle proteine dell'acido bicinconninico (BCA) Epizyme(Cina)#ZJ102Determinare la concentrazione proteica
Sistema LightCycler96RocheApparecchiature qPCR
MHY1485MedChemExpress (Stati Uniti)#326914-06-1Un attivatore del bersaglio dei mammiferi del complesso 1 della rapamicina (mTORC1) 
Kit miRNeasy Mini Tiangen (Cina)#217004Estrazione dell'RNA (miRNA)
Unguento per ustioni esposto all'umiditàMebo (Shantou, Cina)#2403103BUn unguento per curare le ferite croniche
Miscela qPCR verde MonAmp SYBR (senza ROX) Monad (Cina)#MQ10101SKit qPCR (mRNA)
MonScript RTIII All-in-One Mix con dsDNase Monad (Cina)#MR05101SKit di trascrizione inversa (mRNA)
sistema di citometria a flusso nanoN30E (Cina)Un'apparecchiatura per analizzare le dimensioni e la concentrazione degli esosomi
microscopio otticoOlympus (Tokyo, Giappone)Osservare la patomorfologia dei tessuti
soluzione fisiologica salinaKelun (Sichuan, Cina)#L24041709Soluzione fisiologica salina
membrane in fluoruro di polivinilideneMillipore(USA)#IPVH00010Membrana di Western blotting
PrimerGeneray Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Cina)
Anticorpo Rab27aTecnologia di segnalazione cellulare#69295Anticorpi primari
Kit di sintesi del cDNA del primo filamento RevertAidThermo Fisher (Stati Uniti)#K1622Kit di trascrizione inversa (miRNA)
tampone di lisi RIPASolarbio (Pechino, Cina)#R0010Estrazione totale delle proteine
sodio dodecil solfato– poliacrilammide Epizyme(Cina)#PG222Tampone per elettroforesi
pentobarbital di sodioMerck (Shanghai, Cina)#P3761Anestetico
Topi maschi C57BL/6 specifici privi di patogeniGuangdong Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd (Guangdong, Cina)Animali da esperimento
SPSShttps://www.ibm.com/spssAnalisi statistica
streptozotocinaSolarbio (Pechino, Cina)#S8050Indurre un modello murino diabetico 
SYBR Miscela Master qPCR verde Roche (Svizzera)#4943914001-SRkit qPCR (miRNA)
Microscopia elettronica a trasmissioneHitachi (Giappone)HT-7700Un'apparecchiatura per determinare la morfologia degli esosomi
TRIZOL Invitrogen (Stati Uniti)#15596026CNEstrazione dell'RNA (mRNA)
Anticorpo TSG101Abcam# ab125011Anticorpi primari
Anticorpo Vps4aAbcam# ab197896Anticorpi primari

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