Un cerotto strutturale intelligente in idrogel colorato che integra diagnosi e trattamento per la gestione dell'osteomielite cronica

Sommario

Questo studio presenta un cerotto strutturale intelligente in idrogel colorato (CPG) per la diagnosi e il trattamento dell'osteomielite cronica (COM). Il cerotto integra un idrogel GelMA sensibile alla temperatura, un'impalcatura CSMA-PBA sensibile al pH e acido salicilico per il rilascio controllato del farmaco, il monitoraggio delle infezioni e la promozione della rigenerazione tissutale.

Abstract

L'osteomielite cronica (COM) è un'infezione ossea persistente difficile da trattare con gli antibiotici convenzionali a causa di problemi come la resistenza ai farmaci e gli effetti collaterali avversi. Per affrontare questa sfida, abbiamo sviluppato un nuovo cerotto strutturale intelligente in idrogel colorato (CPG) sia per la diagnosi che per il trattamento della COM. Il cerotto combina chitosano metilacrilato modificato con acido fenilboronico (CSMA-PBA) come scaffold, idrogel GelMA sensibile alla temperatura come riempitivo e acido salicilico (SA) per la somministrazione di farmaci. La caratterizzazione ha mostrato eccellenti proprietà meccaniche e forza adesiva. Gli esperimenti di rilascio di farmaci hanno confermato che il CPG risponde efficacemente alle variazioni di pH, consentendo un rilascio controllato del farmaco. La CPG funge anche da strumento diagnostico rilevando le variazioni di pH e temperatura nel sito di infezione, aiutando nel recupero postoperatorio. I test antimicrobici hanno mostrato una significativa inibizione della crescita batterica e gli esperimenti in vitro hanno dimostrato la capacità del CPG di promuovere l'espressione del fattore di crescita dell'endotelio vascolare riducendo i marcatori infiammatori. Lo studio evidenzia le capacità multifunzionali del cerotto in idrogel, compresi gli effetti antimicrobici, antinfiammatori e provascolari, posizionandolo come un'opzione terapeutica promettente per l'osteomielite cronica.

Introduzione

L'osteomielite cronica è diventata una delle principali preoccupazioni per i pazienti a causa del suo processo di trattamento impegnativo e prolungato, dell'alto rischio di fallimento del trattamento e della recidiva¹. Le attuali strategie di trattamento per l'osteomielite prevedono lo sbrigliamento chirurgico del tessuto necrotico e antibiotici parenterali. Tuttavia, la necessità di alte dosi di antibiotici per fornire livelli terapeutici nel sito d'azione rimane inefficace nel trattamento della malattia. Inoltre, l'uso di antibiotici ad alte dosi è associato a complicanze avverse come nefrotossicità, ototossicità, resistenza agli antibiotici ed effetti collaterali gastrointestinali. La somministrazione locale di antibiotici può essere una strategia più appropriata per superare questi inconvenienti. Mentre la somministrazione locale di antibiotici può trattare le infezioni ossee con effetti collaterali minimi, indurre la rigenerazione ossea è fondamentale per il successo^{del trattamento 2}. Pertanto, la somministrazione simultanea di antibiotici e fattori di crescita ossea sembra essere una strategia terapeutica promettente. Negli ultimi decenni, il polimetilmetacrilato (PMMA) non biodegradabile è stato il pilastro della terapia antibiotica locale nell'osteomielite. Tuttavia, l'uso del PMMA come sistema di somministrazione locale di antibiotici incontra limitazioni come la necessità di un secondo intervento chirurgico per la rimozione delle microsfere, la formazione di biofilm batterici che favoriscono la colonizzazione superficiale, il rilascio di antibiotici a lungo termine a livelli subterapeutici che portano alla resistenza agli antibiotici, la tossicità sistemica dei monomeri residui e la mancanza di proprietà induttive ossee³. Pertanto, lo sviluppo di sistemi di somministrazione locale biodegradabili utilizzando polimeri biocompatibili può superare questi inconvenienti. La letteratura suggerisce che le nanoparticelle di fibroina di seta (SFNP) incorporate in un'impalcatura di seta per la somministrazione locale di vancomicina possono essere utilizzate per trattare l'osteomielite grave. Tuttavia, l'assenza di molecole bioattive induttive ossee nel materiale nanocomposito ha fatto sì che i costrutti preparati non inducessero in modo significativo la rigenerazione ossea. Pertanto, la progettazione di materiali per scaffold nanocompositi adatti al trattamento dell'osteomielite cronica è stata una questione impegnativa di preoccupazione. Gli idrogel a base di polimeri naturali hanno ricevuto un'attenzione diffusa grazie alla loro somiglianza strutturale con la matrice extracellulare (ECM) e alla loro capacità di controllare il rilascio di farmaci⁴.

Una caratteristica importante degli idrogel è la loro reattività a diversi fattori come la temperatura e il pH. Le infezioni croniche possono aumentare il pH a causa della carica microbica, della disregolazione dell'equilibrio rigenerazione-degradazione e dell'aumento delle reazioni metaboliche. Inoltre, l'escissione chirurgica di materiale sbrigliato, come il tessuto necrotico e il pus, può accelerare la transizione del pH a valori più elevati⁵. Pertanto, l'uso di idrogel sensibili al pH in grado di rilevare il pH delle infezioni croniche è fondamentale per la prognosi dell'osteomielite cronica.

In questo studio, proponiamo un approccio integrato alla diagnosi e al trattamento utilizzando un cerotto strutturale intelligente in idrogel colorato, che possiede le caratteristiche necessarie per il trattamento dell'osteomielite cronica, come illustrato nella Figura 1. Gli idrogel supramolecolari derivati dall'assemblaggio di reti polimeriche supramolecolari sono materiali attraenti simili alla matrice extracellulare naturale (ECM). Grazie alle loro eccellenti proprietà, tra cui un'adeguata resistenza meccanica, proprietà autorigeneranti, antibatteriche e antinfiammatorie, gli idrogel supramolecolari hanno trovato molte applicazioni in campo biomedico⁶. Al contrario, il colore strutturale, come tipo di colore prodotto da interazioni uniche di luce con nanostrutture periodiche intrinseche, ha raccolto grande attenzione in campi come i display ottici, le etichette anticontraffazione e i dispositivi elettronici indossabili. In particolare, quando i materiali strutturali colorati sono costruiti con polimeri reattivi, il loro colore può essere regolato da diversi stimoli attraverso l'espansione o la contrazione di questi polimeri, suggerendo il potenziale di questi materiali come sensori. Pertanto, si può prevedere che la combinazione di idrogel supramolecolari con colori strutturali fornirà una strategia unica per la costruzione di nuovi cerotti in idrogel per il trattamento dell'osteomielite cronica ^7,8,9.

In questo articolo, abbiamo sviluppato un approccio integrato alla diagnosi e al trattamento utilizzando un cerotto intelligente di idrogel strutturale colorato (CPG) composto da chitosano metilacrilato modificato misto con acido fenilboronico (CSMA-PBA) come scaffold di calcoli antiproteici, idrogel GelMA sensibile alla temperatura come riempitivo e caricato con acido salicilico (SA)¹⁰. A causa della reversibilità del legame idrogeno e delle interazioni non covalenti all'interno della rete, il cerotto in idrogel risultante non solo ha mostrato eccellenti proprietà meccaniche, ma possedeva anche capacità di autoguarigione. Inoltre, grazie alla presenza di CSMA, questo cerotto in idrogel ha anche mostrato una potente bioattività antibatterica. Inoltre, utilizzando la reattività termica del polimero GelMA, il cerotto in idrogel potrebbe rilasciare sostanze attive se posizionato al sito di infiammazione a temperatura relativamente più elevata. Contemporaneamente, a causa della presenza di legami estere boronato in CSMA-PBA, l'idrogel ha risposto alle variazioni del pH^{ambientale 11}. Sulla base di questi vantaggi, abbiamo dimostrato che il cerotto strutturale in idrogel supramolecolare a colori proposto potrebbe trattare l'osteomielite cronica sottoregolando l'espressione dei fattori infiammatori, l'attività antibatterica e promuovendo l'angiogenesi. In particolare, beneficiando delle proprietà ottiche uniche dell'impalcatura di calcoli antiproteici, il cerotto in idrogel potrebbe persino mostrare la capacità di cambiare colore in risposta agli stimoli termici, dimostrando un potenziale significativo nel monitoraggio e nella gestione dell'osteomielite cronica e guidando il trattamento clinico.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico Medico ed eseguite seguendo le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (pubblicazione NIH n. 80-23, rivista nel 1978). Negli esperimenti sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague-Dawley (8 settimane di età).

Preparazione di modelli di cristalli colloidali di silice (SCC)
Gli SCC sono stati preparati come precedentemente descritto 12,13,14. I vetrini puliti e trattati al plasma sono stati immersi in una soluzione al 5% di nanoparticelle di silice monodisperse (12 nm di diametro) disperse in acqua deionizzata. La soluzione è stata continuamente agitata a temperatura ambiente (25 °C) per 1 ora per garantire la dispersione uniforme delle nanoparticelle di silice. I vetrini sono stati rimossi dalla soluzione e asciugati all'aria per 1 ora a temperatura ambiente. Il processo di essiccazione è stato fondamentale per garantire la corretta aderenza delle nanoparticelle sulla superficie dei vetrini. Dopo l'essiccazione all'aria, i vetrini sono stati posti in un forno ventilato a 60 °C per 2 giorni per far evaporare l'eventuale residuo di solvente e facilitare la formazione di cristalli colloidali. Durante questa evaporazione, i vetrini sono stati posizionati con un angolo di 45° per promuovere la formazione di matrici di cristalli colloidali ordinati. Le schiere di cristalli colloidali ordinate erano caratterizzate da autoassemblaggio e mostravano colori strutturali diversi a seconda della spaziatura tra le particelle. Questi array sono stati poi utilizzati come modelli per la successiva fabbricazione di cerotti in idrogel.

Preparazione di cerotti in idrogel colorati strutturali intelligenti per diagnosi e trattamento integrati (CPG)
Gli scaffold di pietra anti-proteina sono stati replicati dai vuoti dei modelli di cristalli colloidali di silice (SCC). I vetrini puliti sono stati prima immersi in una soluzione al 5% di nanoparticelle di silice monodisperse (12 nm di diametro) in acqua deionizzata e la soluzione è stata agitata a temperatura ambiente (25 °C) per 1 ora per garantire una dispersione uniforme delle nanoparticelle sulla superficie. Il processo di agitazione è stato fondamentale per prevenire la formazione di aggregati e garantire una distribuzione omogenea delle nanoparticelle. Dopo l'immersione, i vetrini sono stati essiccati all'aria per 1 ora a temperatura ambiente (RT), seguiti da essiccazione in forno a 60 °C per 2 giorni per facilitare l'evaporazione del solvente e promuovere l'autoassemblaggio delle nanoparticelle di silice in matrici di cristalli colloidali ben ordinate. Durante l'evaporazione, i vetrini sono stati posizionati con un angolo di 45° per facilitare l'allineamento delle nanoparticelle, favorendo la formazione di un array periodico con distanze interparticellari controllate. Questa matrice ordinata mostrava un colore strutturale, una caratteristica dei cristalli colloidali, e serviva come modello per la successiva struttura dell'idrogel.

Gli SCC preparati sono stati quindi immersi nella soluzione pre-gel CPG, che consisteva in GelMA a una concentrazione del 10% p/v disciolto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). I campioni sono stati lasciati per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) per garantire un'infiltrazione completa del GelMA nei vuoti tra le nanoparticelle di silice, garantendo una distribuzione uniforme all'interno della struttura del modello. Questo passaggio è stato fondamentale per garantire che la matrice di idrogel fosse incorporata uniformemente nel modello e che la struttura finale dell'idrogel replicasse la disposizione ordinata delle nanoparticelle degli SCC. Dopo l'immersione, la soluzione pre-gel è stata polimerizzata sotto luce UV (365 nm) ad un'intensità di 3 mW/cm² per 5 minuti. Questa esposizione ai raggi UV ha avviato la reticolazione di GelMA, solidificando la matrice di idrogel. Il tempo e l'intensità di esposizione sono stati accuratamente ottimizzati per ottenere una reticolazione sufficiente senza sovraesporre l'idrogel, che potrebbe portare a un'eccessiva gelificazione o alla perdita della struttura del modello.

Caratterizzazione dei beni di largo consumo
La morfologia della sezione trasversale dell'idrogel è stata osservata utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) con una tensione di accelerazione di 5 kV dopo aver rivestito i campioni (1 mm x 1 mm) con oro¹⁵. Questo ci ha permesso di visualizzare la struttura nanoporosa e confermare l'uniformità della rete di idrogel. Il comportamento di rigonfiamento è stato valutato immergendo campioni di idrogel da 10 mg in 10 ml di PBS a diversi intervalli di tempo (0, 30, 60, 120 e 180 min). La percentuale di rigonfiamento è stata calcolata misurando l'aumento del volume dell'idrogel nel tempo, che ha fornito informazioni sulla capacità dell'idrogel di assorbire acqua in diverse condizioni. L'analisi reologica è stata eseguita utilizzando un reometro con deformazione dell'1%, applicando frequenze angolari comprese tra 1 rad/s e 100 rad/s per misurare il modulo di stoccaggio (G') e il modulo di perdita (G''). Questo passaggio è stato essenziale per comprendere le proprietà meccaniche dell'idrogel, compreso il suo comportamento viscoelastico sotto stress. Le proprietà dell'adesivo di taglio sono state valutate con una macchina universale per prove di trazione (Instron) secondo ASTM F2255-05 (2015) a una velocità di 10 mm/min e un precarico di 0,01 N per valutare la capacità dell'idrogel di aderire ai tessuti biologici. Il rilascio del farmaco è stato valutato utilizzando uno spettrofotometro UV monitorando l'assorbanza a λ = 280 nm dopo aver immerso l'idrogel in 5 mL di PBS (pH 7,4). Il rilascio è stato quantificato utilizzando una curva standard delle concentrazioni di acido salicilico per confermare le capacità di rilascio controllato dell'idrogel CPG. Infine, gli idrogel sono stati immersi in soluzioni tampone a pH 4,5 e 7,2 per 30 minuti per valutare la risposta al pH, osservando i cambiamenti di volume e aspetto in diverse condizioni di pH¹⁶.

Reattività alla temperatura e al pH dei cerotti CPG
I cerotti CPG (circa 2 mm di diametro) sono stati posti in una soluzione tampone da 5 mL con pH 7,2 e mantenuti a 37 °C utilizzando un bagno d'acqua a temperatura controllata per 30 minuti per imitare le condizioni fisiologiche. Gli spettri di riflettanza sono stati misurati utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a lunghezze d'onda comprese tra 400 nm e 800 nm. Dopo le misurazioni iniziali, i cerotti sono stati trasferiti in soluzioni tampone con diversi valori di pH (ad es. pH 4,5, 7,2 e 9,0) e mantenuti a 37 °C per 30 minuti. La risposta al microambiente, compreso qualsiasi cambiamento di colore, è stata osservata visivamente e gli spettri di riflettanza sono stati registrati nuovamente per analizzare il cambiamento di colore. Questa reattività alla temperatura e al pH fornisce informazioni preziose su come l'idrogel reagisce ai cambiamenti nell'ambiente della ferita.

Test antibatterici in vitro
I test antibatterici sono stati eseguiti utilizzando procedure standard. I ceppi di Staphylococcus aureus (S. aureus, ATCC 25923) ed Escherichia coli (E. coli, ATCC 53868) sono stati utilizzati per valutare l'attività antibatterica dei cerotti CPG. Questi ceppi di riferimento standard sono stati acquistati dall'American Type Culture Collection (ATCC) e sono stati utilizzati come ceppi di controllo qualità (QC) per convalidare le procedure di test antimicrobici. Il test di sensibilità antimicrobica è stato eseguito utilizzando il metodo di microdiluizione in brodo secondo le linee guida CLSI M100. Le sospensioni batteriche sono state preparate nel brodo Mueller-Hinton, un mezzo standard per i test antimicrobici. La torbidità è stata regolata a uno standard di McFarland di 0,5, equivalente a circa 1,5 × 10⁸ CFU/mL. Le sospensioni sono state quindi inoculate con cerotti CPG (2 mm di diametro), preparati con acqua deionizzata o tampone di acido 2-(N-morfolino)etansolfonico (MES) a pH 6,0 (10 mM). I cerotti sono stati aggiunti alle sospensioni batteriche con un rapporto di un cerotto per 1 mL di coltura. Le sospensioni sono state incubate a 37 °C per 24 ore. Dopo l'incubazione, la crescita batterica è stata valutata mediante diluizioni seriali delle colture su agar nutriente e le unità formanti colonie (CFU) sono state contate dopo un'incubazione di 24 ore a 37 °C. Questa procedura ha fornito una misura quantitativa dell'efficacia antibatterica.

Valutazione della biocompatibilità
Gli esperimenti sono stati condotti come descritto in precedenza. I cerotti CPG sono stati trattati mediante dialisi in PBS (pH 7,4) per 4 ore, seguita da sterilizzazione con etanolo (70%) per 10 minuti e disinfezione UV (365 nm) per 30 minuti per garantire la rimozione di tutti i contaminanti biologici. Le cellule L929 (ATCC CCL-1) sono state coltivate in terreno DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina a 37 °C con il 5% di CO² per mantenere la vitalità cellulare. Le cellule sono state seminate in piastre da 24 pozzetti a 2 × 10⁵ cellule/mL, con o senza cerotti CPG (2 mm di diametro), in triplicato. Le cellule sono state divise in tre gruppi sperimentali: controllo in bianco, gruppo CPG e gruppo CPG (MES). Dopo 24 ore, la vitalità cellulare è stata valutata utilizzando il test MTT, un metodo ampiamente accettato per valutare l'attività metabolica cellulare. Per il test MTT, sono stati aggiunti 20 μL di MTT (5 mg/mL) a ciascun pozzetto, seguiti da incubazione a 37 °C per 4 ore. Dopo l'incubazione, il terreno è stato rimosso e sono stati aggiunti 150 μL di DMSO per sciogliere i cristalli di formazan formati dalle cellule viventi. L'assorbanza è stata misurata a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre per quantificare il numero di cellule vitali. Questo approccio ha garantito una valutazione affidabile della citotossicità e della biocompatibilità dei cerotti in idrogel.

Attività antinfiammatoria
L'attività antiossidante del CPG è stata valutata utilizzando un kit di dosaggio dei ROS. Le cellule L929 (ATCC CCL-1) sono state coltivate in terreno DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e incubate a 37 °C con CO₂ al 5% per 24 ore per consentire l'adesione cellulare e la proliferazione iniziale. Per indurre lo stress ossidativo, le cellule sono state trattate con 3 μg/mL di perossido di idrogeno (H2O2) per 12 ore. Dopo l'induzione dello stress ossidativo, è stato aggiunto alle cellule l'estratto di idrogel (preparato sciogliendo 1 mg di idrogel CPG in 1 ml di terreno DMEM). Le cellule sono state incubate per altre 12 ore per consentire i potenziali effetti antiossidanti dell'idrogel CPG. Successivamente, le cellule sono state colorate con una soluzione di DCFH-DA da 10 μM (diluita in terreno DMEM) e incubate a 37 °C per 20 minuti. DCFH-DA è una sonda fluorescente utilizzata per rilevare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) all'interno delle cellule. Dopo la colorazione, le cellule sono state lavate con PBS e le immagini a fluorescenza sono state catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza a una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm. L'intensità della fluorescenza verde era inversamente correlata all'attività antiossidante dell'idrogel, fornendo una valutazione visiva della capacità dell'idrogel di mitigare lo stress ossidativo nelle cellule.

Modello animale di osteomielite di ratto
È stato stabilito un modello di osteomielite cronica: i ratti maschi di Sprague-Dawley (8 settimane di età) sono stati anestetizzati utilizzando isoflurano (2-3% in ossigeno) per garantire che rimanessero immobili e indolori durante l'intervento chirurgico. È stata praticata un'incisione di 2 cm sulla faccia laterale del femore sinistro ed è stato utilizzato un ago sterile da 27 G per iniettare 1 10⁷ CFU di S. aureus direttamente nella regione trabecolare del femore. L'iniezione è stata eseguita nella cavità del midollo osseo del femore per indurre l'infezione nello spazio del midollo, il sito primario per l'osteomielite. I batteri sono stati consegnati lentamente per garantire una corretta deposizione all'interno del midollo osseo. Dopo 10 giorni, i ratti sono stati soppressi utilizzando l'inalazione di CO₂ e i femori infetti sono stati accuratamente sezionati. Il tessuto di granulazione è stato asportato dal sito di infezione e immediatamente immerso in paraformaldeide al 4% per 24 ore per preservare l'integrità del tessuto. Dopo la fissazione, il tessuto osseo è stato decalcificato utilizzando un agente decalcificante (ad es. EDTA) per 48-72 ore, a seconda delle dimensioni dell'osso, per consentire un corretto sezionamento per l'analisi istologica e immunoistochimica. I campioni di osso decalcificato sono stati quindi elaborati per l'esame istologico, l'immunoistochimica (IHC) e la colorazione in immunofluorescenza. Per l'analisi quantitativa della PCR in tempo reale (qPCR), il tessuto di granulazione è stato conservato a -80 °C per la successiva estrazione dell'RNA, consentendo l'analisi dei profili di espressione genica correlati all'infiammazione, alla rigenerazione ossea e alle risposte immunitarie

Valutazione del trattamento dell'osteomielite in vivo
Il tessuto di granulazione è stato incorporato in paraffina e sezionato a 5 μm utilizzando un microtomo. Le sezioni sono state colorate con la colorazione tricromica di Masson (15 minuti con ematossilina, 1 ora con blu anilina) per valutare la deposizione di collagene e il rimodellamento dei tessuti. La colorazione con ematossilina ed eosina (HE) (5 minuti con ematossilina, 2 minuti con eosina) è stata utilizzata per osservare la morfologia generale dei tessuti e l'infiammazione. L'immunoistochimica (IHC) con anti-CD31 (1:100) e anti-EGF (1:200) è stata eseguita per 1 ora a 37 °C, seguita da incubazione secondaria di anticorpi a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti utilizzando IgG anti-topo o IgG anti-coniglio (diluito 1:200), a seconda dell'anticorpo primario utilizzato, per valutare l'angiogenesi e l'espressione del fattore di crescita. La colorazione in immunofluorescenza è stata eseguita con anti-VEGF (1:100) e anti-bFGF (1:200) per 1 ora a 37 °C, seguita da incubazione secondaria di anticorpi per 30 minuti a RT. Sono state osservate sezioni per l'espressione di CD31, EGF, VEGF e bFGF utilizzando un microscopio a fluorescenza. Per l'analisi quantitativa della PCR in tempo reale (qPCR), l'espressione dell'mRNA delle citochine pro-infiammatorie (TNF-α, IL-1β e IL-6) è stata analizzata dopo l'estrazione dell'RNA con RNAiso Plus e la sintesi del cDNA utilizzando il kit di reagenti PrimeScript RT. La PCR è stata eseguita utilizzando SYBR Green PCR Master Mix per valutare quantitativamente la risposta infiammatoria a livello molecolare.

Misure di controllo della qualità
Per garantire l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati sperimentali, tutte le procedure sono state eseguite secondo protocolli standardizzati. Ogni esperimento includeva gruppi di controllo appropriati, come controlli in bianco (ratti infettati da S. aureus ma non riceventi alcun trattamento), gruppi di controllo (ratti sottoposti a procedure chirurgiche senza infezione batterica e nessun trattamento) e gruppi di trattamento comparativo (ratti che ricevevano trattamenti diversi per l'osteomielite, come antibiotici o un farmaco sperimentale), per ridurre al minimo la variabilità. Tutti i saggi sono stati eseguiti in triplice copia per garantire la coerenza e ridurre le distorsioni sperimentali. Ogni gruppo conteneva 6 ratti per garantire la significatività statistica. Gli strumenti, tra cui uno spettrofotometro UV-Vis, un reometro e un tester di trazione, sono stati regolarmente calibrati prima dell'uso secondo le specifiche del produttore. Le colture batteriche e cellulari sono state preparate in condizioni ambientali controllate in una cappa di biosicurezza e le procedure di colorazione sono state seguite utilizzando protocolli coerenti per garantire la riproducibilità. L'acquisizione dei dati è stata condotta con impostazioni unificate del microscopio per ridurre al minimo la variabilità tra i campioni e garantire una misurazione accurata.

Analisi statistica
L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando GraphPad Prism (versione 8.0). I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). Per il confronto tra più gruppi, è stata utilizzata un'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) seguita dal test post-hoc di Tukey per valutare le differenze nelle proprietà meccaniche, nel comportamento termoreattivo, nell'attività antibatterica e nella vitalità cellulare. Il t-test di Student è stato utilizzato per confronti a coppie quando sono stati confrontati solo due gruppi, come nel caso del confronto dei picchi di riflessione dei cerotti CPG a diversi valori di pH o variazioni di temperatura. P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo per tutte le analisi. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia per garantire la coerenza e la riproducibilità dei risultati.

Risultati

Fabbricazione e caratterizzazione di cerotti CPG (Figura 1)
In un tipico esperimento, le nanoparticelle di silice monodisperse sono state auto-assemblate attraverso l'evaporazione del solvente per formare array strettamente impacchettati, dando luogo a rivestimenti colorati strutturali (SCC)17,18,19, che sono stati successivamente utilizzati per creare patch di idrogel colorate strutturali multifunzionali, come mostrato nella Figura 1. Il processo ha comportato l'infiltrazione di una soluzione pre-gel nelle fessure su scala nanometrica degli SCC tramite l'azione capillare. La polimerizzazione UV è stata quindi impiegata per formare il film ibrido di SCC e idrogel. Una volta che le SCC sono state incise, è stata ottenuta un'impalcatura inversa di calcoli anti-proteici con una struttura porosa periodica. Infine, l'idrogel termoreattivo di GelMA è stato riempito nelle lacune su scala nanometrica dell'impalcatura di pietra antiproteica, seguito dall'indurimento, per creare i cerotti CPG indipendenti.

La forte rete reticolante dell'idrogel ha conferito eccellenti proprietà meccaniche ai cerotti CPG. È stato osservato che i cerotti erano abbastanza resistenti da resistere allo stiramento senza causare alcun danno e potevano essere allungati fino a 2,5 volte la loro lunghezza originale. È importante sottolineare che i cerotti CPG hanno mostrato colori strutturali vivaci e hanno subito cambiamenti di colore dinamici durante l'allungamento, una caratteristica unica derivante dalla disposizione periodica di nanostrutture di alto ordine all'interno dei cerotti. Queste nanostrutture creano bande proibite fotoniche (PBG), in cui la luce a determinate lunghezze d'onda all'interno del PBG viene riflessa selettivamente piuttosto che trasmessa, dotando i patch CPG dei loro caratteristici colori strutturali e picchi di riflessione.

La posizione di riflessione del picco del cerotto CPG può essere stimata dall'equazione²⁰:

λ =_media 1,633dn

dove d è la distanza tra i piani di diffrazione e n_media è l'indice di rifrazione medio del materiale, che è calcolato come media degli indici di rifrazione dei componenti, incluso l'idrogel GelMA e altri materiali utilizzati nel cerotto. Questa equazione suggerisce che, man mano che la macchia viene allungata e d diminuisce, la lunghezza d'onda di riflessione diminuisce, portando a uno spostamento del blu nel colore strutturale della patch. È stata testata anche la resistenza alla trazione dei cerotti e si è scoperto che la capacità di deformazione dei cerotti è diminuita a causa del riempimento dell'idrogel GelMA nelle fessure su scala nanometrica dell'impalcatura di pietra antiproteica. La deformazione dei cerotti CPG durante l'allungamento offre un mezzo altamente sensibile per il rilevamento della deformazione, rendendoli adatti per applicazioni che richiedono il monitoraggio meccanico.

Comportamento termoreattivo e sensibile al pH dei cerotti CPG (Figura 2)
I cerotti CPG hanno mostrato notevoli proprietà termoreattive grazie all'idrogel GelMA. Dopo aver aumentato la temperatura ambientale a 37 °C, l'idrogel ha subito un restringimento, rilasciando molecole d'acqua e carico carico. Questo restringimento ha comportato una riduzione delle dimensioni dei nanopori all'interno dei cerotti CPG, alterando il loro PBG e di conseguenza spostando lo spettro di riflessione. La Figura 2 illustra questo comportamento, mostrando come il colore strutturale delle chiazze cambia in risposta alle variazioni di temperatura e pH.

Per confermare queste osservazioni, i cerotti CPG sono stati posizionati in un ambiente simulato di ferita con infezione cronica a 37 °C e pH 7,2. All'aumentare del pH della soluzione, è stato osservato uno spostamento verso il blu nel picco di riflessione dei cerotti CPG, indicando che la dimensione dei nanopori è diminuita. Al contrario, quando il pH diminuiva, le chiazze mostravano uno spostamento verso il rosso, corrispondente a un'espansione dei nanopori. Questo comportamento sensibile al pH è stato attribuito all'idrolisi dei legami estere boronato nel CSMA-PBA in condizioni acide, che ha rotto i legami e ha provocato uno spostamento verso il rosso del colore strutturale. Tuttavia, quando il pH era alcalino, non è stato osservato alcun cambiamento di colore significativo, indicando la stabilità delle chiazze in condizioni basiche. Questi risultati suggeriscono che i cerotti CPG possono essere utilizzati per monitorare sia le variazioni di temperatura che di pH negli ambienti delle ferite, il che è fondamentale per una gestione efficace delle ferite.

Attività antibatterica dei cerotti CPG (Figura 3)
Le proprietà antibatteriche dei cerotti CPG sono state valutate co-coltivandoli con S. aureus ed E. coli. La Figura 3A, B mostra che i cerotti CPG hanno ridotto significativamente la crescita batterica, dimostrando le loro efficaci proprietà antibatteriche. Questa efficacia antibatterica è stata attribuita all'interazione elettrostatica tra la superficie CMCSMA caricata positivamente dei cerotti e le pareti cellulari batteriche caricate negativamente²¹. Questa interazione ha interrotto la struttura della membrana batterica, portando alla morte batterica. I gruppi cationici del CMCSMA possono legarsi ai componenti anionici della membrana batterica, portando alla depolarizzazione della membrana e all'aumento della permeabilitಲ. Inoltre, grazie alle sue dimensioni molecolari relativamente piccole e alle catene polimeriche flessibili, il CMCSMA può penetrare il doppio strato lipidico in modo più efficace, causando la fuoriuscita di sostanze intracellulari e interferendo con l'attività metabolica. Le piccole dimensioni delle molecole di CMCSMA hanno ulteriormente facilitato la loro penetrazione nella membrana cellulare batterica, dove hanno interagito con le biomolecole essenziali, interrompendo il metabolismo batterico e i sistemi enzimatici²³. Inoltre, considerando la robusta capacità di formare biofilm di S. aureus, vale la pena notare che è stato riportato che è stato riportato che i materiali a base di chitosano come il CMCSMA distruggono i biofilm batterici penetrando nella matrice della sostanza polimerica extracellulare (EPS) e interferendo con la sua integrità. Ciò consente agli agenti antibatterici di accedere e uccidere i batteri incorporati nei biofilm, che sono tipicamente resistenti agli antibiotici convenzionali^24,25. Come mostrato nella Figura 3A, il confronto visivo delle colonie batteriche dimostra chiaramente una riduzione sostanziale dopo il trattamento con cerotti CPG, evidenziando la loro efficace attività battericida e il loro promettente potenziale per l'uso in ambienti di ferite soggette a infezioni.

Funzionalità biologica dei cerotti CPG (Figura 4)
I cerotti CPG hanno dimostrato una significativa funzionalità biologica oltre alle loro proprietà antibatteriche. Le figure 4C, D mostrano che i cerotti hanno efficacemente eliminato le specie reattive dell'ossigeno (ROS) all'interno delle cellule, come indicato dalla diminuzione del segnale di fluorescenza verde nel gruppo CPG. L'eliminazione dei ROS è essenziale per la guarigione delle ferite, poiché un'eccessiva produzione di ROS può compromettere la rigenerazione dei tessuti. La vitalità delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) co-coltivate con i cerotti CPG è stata valutata utilizzando la colorazione di vitalità, come mostrato nella Figura 4A. I risultati hanno indicato che la maggior parte delle cellule era viva, con solo una piccola percentuale di cellule morte, suggerendo che i cerotti CPG promuovono la vitalità cellulare e supportano la proliferazione cellulare.

La Figura 4B mostra i risultati di un test MTT, che ha dimostrato che i cerotti CPG promuovono significativamente la proliferazione cellulare. Inoltre, la Figura 4F,G ha mostrato che i cerotti CPG hanno migliorato l'angiogenesi promuovendo l'espressione del fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF) e del fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF), che sono fondamentali per la proliferazione delle cellule endoteliali e la formazione di nuovi vasi sanguigni. Questi risultati evidenziano il potenziale dei cerotti CPG non solo per prevenire l'infezione, ma anche per migliorare la rigenerazione dei tessuti e accelerare la guarigione delle ferite.

Valutazione in vivo dei cerotti CPG (Figura 5)
Gli esperimenti in vivo condotti utilizzando un modello di osteomielite cronica hanno dimostrato che i cerotti CPG hanno ridotto significativamente l'infezione e l'infiammazione. La Figura 5A mostra l'analisi istologica (colorazione H&E), in cui il gruppo di controllo ha mostrato infiammazione caratteristica, distruzione ossea, tessuto necrotico ed elevata infiltrazione di cellule di difesa, mentre il gruppo di trattamento ha mostrato una significativa riduzione dell'infezione, dell'infiammazione e dell'infiltrazione di cellule di difesa. Nel gruppo CPG sono stati osservati un aumento della migrazione degli osteoblasti, la trasformazione degli osteoblasti in cellule ossee, la formazione vascolare, la formazione di nuovo osso e la riduzione dell'infezione, confermando ulteriormente l'efficacia dei cerotti CPG nel promuovere la rigenerazione tissutale.

Inoltre, la Figura 5B mostra la colorazione dell'angiogenesi, confermando che i cerotti CPG hanno promosso la formazione di nuovi vasi sanguigni, che è fondamentale per la riparazione dei tessuti. Questi risultati suggeriscono che i cerotti CPG svolgono un duplice ruolo sia nel controllo dell'infezione che nella promozione della rigenerazione dei tessuti, rendendoli altamente adatti per la guarigione cronica delle ferite e le applicazioni di rigenerazione ossea.

Figura 1: Preparazione e caratterizzazione del patch strutturale di idrogel colorato (CPG). (A): Reazione tra CSMA e PBA; (B): Fotografia del CPG, che dimostra il cambiamento di colore durante lo stretching; (C): Caratterizzazione SEM dei CPG; (D): Comportamento di rigonfiamento del CPG; (E): Profilo di degradazione dei prodotti di largo consumo; (F): Cinetica di rilascio di farmaci da CPG. Barra della scala: 100 nm. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). Nel gruppo sperimentale sono stati utilizzati sei ratti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rilevamento intelligente del cerotto CPG. (A): Variazione del colore strutturale del cerotto CPG con variazioni della temperatura ambientale e del pH; (B): Analisi spettrale di patch CPG a diverse temperature; (C): Analisi spettrale di cerotti CPG a diversi livelli di pH. Barra della scala: 1 mm. I dati rappresentano la media ± SD, analizzati utilizzando l'ANOVA unidirezionale con il test post-hoc di Tukey. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Attività antibatterica del cerotto CPG. (A): Immagini rappresentative della co-coltura di S. aureus ed E. coli con patch CPG; (B): Analisi dei valori di densità ottica (OD). Barra della scala: 5 mm. Le barre di errore rappresentano SD. La significatività statistica è stata determinata mediante ANOVA a una via con il test post-hoc di Tukey. Sono state utilizzate sei repliche per gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Valutazione funzionale biologica del cerotto CPG. (A): Colorazione di vitalità di cellule HUVEC co-coltivate con patch CPG per 48 ore, mostrando cellule vive (verde) e cellule morte (rosso); (B): Proliferazione cellulare misurata mediante saggio MTT; (C): colorazione ROS del cerotto CPG; (D): tasso di scavenging del DPPH nel gruppo VEGF; (E): analisi q-PCR di fattori infiammatori; (F): Promozione dell'angiogenesi mediante patch CPG; (G): Risultati del Western blot dell'espressione di VEGF e bFGF; (H): Analisi statistica dei valori della scala di grigi di VEGF e bFGF. Barra di scala: 100 μm. Le barre di errore rappresentano SD. I dati sono stati analizzati utilizzando l'ANOVA unidirezionale con il test post-hoc di Tukey. In ogni gruppo sono stati utilizzati sei ratti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Esperimenti in vivo del cerotto CPG. (A): colorazione HE; (B): Colorazione dell'angiogenesi. Barra di scala: 100 μm. I dati rappresentano la media ± SD, analizzati mediante ANOVA unidirezionale con il test post-hoc di Tukey. Ogni gruppo conteneva 6 animali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

I risultati di questo studio dimostrano la multifunzionalità dei cerotti in idrogel CPG, in particolare in termini di cambiamenti strutturali di colore, sensibilità alla temperatura, reattività al pH e proprietà antimicrobiche. Questi cerotti in idrogel possono subire cambiamenti di colore strutturali visibili se sottoposti a deformazione meccanica, offrendo un meccanismo altamente sensibile per il monitoraggio della deformazione. Questa caratteristica è in linea con studi precedenti che hanno esplorato il colore strutturale nei materiali per applicazioni di sensori, in cui tali variazioni di colore sono impiegate come indicatori di deformazione o pressione^26,27. Il nostro studio estende questi risultati utilizzando questi cambiamenti di colore come mezzo non invasivo per monitorare lo stress della ferita, che è essenziale per valutare la guarigione della ferita in tempo reale. La capacità di monitorare tali deformazioni meccaniche fornisce informazioni critiche per i medici, aiutando potenzialmente a identificare i primi segni di complicanze, come la deiscenza della sutura, supportando così interventi più mirati e tempestivi. È importante sottolineare che la lettura ottica fornisce un meccanismo di rilevamento diretto e intuitivo senza la necessità di alimentazione o dispositivi di imaging aggiuntivi, offrendo una soluzione di monitoraggio decentralizzata ideale per l'assistenza postoperatoria point-of-care o a domicilio.

I comportamenti termoreattivi e sensibili al pH dei cerotti idrogel CPG ne aumentano il potenziale per l'uso clinico. Man mano che le ferite guariscono, le fluttuazioni di temperatura e pH sono comuni, in particolare in presenza di infezione o infiammazione²⁸. È noto che temperature elevate e valori di pH alterati nel sito della ferita sono associati a queste condizioni. In questo studio, i cerotti CPG hanno mostrato sensibilità a tali cambiamenti, consentendo il monitoraggio in tempo reale delle condizioni locali della ferita. Questa caratteristica è di particolare valore in ambito clinico, dove la diagnosi precoce di infezioni o infiammazioni è essenziale per ottimizzare le strategie terapeutiche. Il monitoraggio delle variazioni di temperatura e pH è particolarmente importante nella gestione delle ferite perché fungono da biomarcatori precoci e non invasivi dello stato della ferita²⁹. Una temperatura elevata può segnalare l'insorgenza dell'infezione prima che si manifestino i sintomi clinici, mentre gli spostamenti verso il pH alcalino spesso indicano cronicità, colonizzazione microbica e guarigione compromessa. Al contrario, gli ambienti acidi sono associati a ferite acute e a un migliore potenziale di guarigione²⁴. Pertanto, l'integrazione di elementi sensibili alla temperatura e al pH nelle medicazioni per ferite consente interventi tempestivi e una valutazione continua dei progressi di guarigione, che possono prevenire il deterioramento della ferita o la progressione verso l'infezione sistemica. La capacità dell'idrogel di adattarsi dinamicamente a questi cambiamenti fornisce anche un nuovo strumento per i medici per monitorare continuamente lo stato della ferita, offrendo una maggiore precisione nel monitoraggio del processo di guarigione. Inoltre, tale reattività dinamica consente il controllo spazio-temporale sul rilascio terapeutico, assicurando che la somministrazione del farmaco sia sincronizzata con i segnali patologici, che è un obiettivo fondamentale dei moderni biomateriali intelligenti.

Inoltre, le proprietà antimicrobiche dei cerotti in idrogel CPG sono fondamentali per ridurre la carica batterica nel sito della ferita. Il chitosano, che è stato incorporato nella struttura dell'idrogel, è stato a lungo riconosciuto per le sue proprietà antimicrobiche, grazie alla sua natura cationica, che facilita le interazioni elettrostatiche con le pareti cellulari batteriche caricate negativamente²⁹. Tuttavia, il meccanismo antibatterico dei materiali a base di chitosano non si limita alla semplice attrazione della carica. A contatto con le membrane batteriche, il chitosano può aumentare la permeabilità della membrana, portando alla fuoriuscita di contenuti intracellulari come ioni potassio, proteine e acidi nucleici. Inoltre, il chitosano può chelare ioni metallici bivalenti (ad esempio, Ca²⁺ e Mg²⁺), interrompendo l'attività enzimatica e le funzioni metaboliche. Il chitosano a basso peso molecolare può anche penetrare la parete cellulare batterica e legarsi al DNA, inibendo la trascrizione dell'mRNA e la sintesi proteica. Questi meccanismi multiformi sono stati ampiamente documentati. La struttura porosa dell'impalcatura in idrogel amplifica ulteriormente questi effetti migliorando la superficie e il contatto batterico, con conseguente efficacia antibatterica sinergica. Questa proprietà è particolarmente rilevante nel trattamento delle infezioni croniche, come l'osteomielite, dove la formazione di biofilm complica il processo di guarigione^25,30. I risultati di questo studio dimostrano che i cerotti idrogel CPG erano efficaci nell'inibire la crescita batterica, riducendo la carica batterica nel sito della ferita e potenzialmente creando un ambiente più favorevole per la rigenerazione dei tessuti. Questa attività antimicrobica, combinata con le altre proprietà dell'idrogel, posiziona i cerotti come un candidato promettente per la gestione delle ferite croniche, che sono spesso afflitte da contaminazione batterica e guarigione ritardata. Inoltre, inibendo la colonizzazione batterica locale, l'idrogel previene indirettamente la sovraregolazione delle citochine pro-infiammatorie che sono spesso sostenute nelle ferite croniche infette, promuovendo così un microambiente pro-rigenerativo.

Sebbene i ROS siano tipicamente associati allo stress ossidativo e al danno tissutale, è ampiamente riconosciuto che la generazione controllata di ROS svolge un ruolo cruciale nell'eradicazione batterica. I ROS, come i radicali ossidrilici e gli anioni superossido, possono ossidare le proteine batteriche, i lipidi e il DNA, portando infine alla rottura della membrana e alla morte cellulare. Pertanto, la presenza di ROS a livelli moderati funge da componente critico dei meccanismi di difesa antimicrobica innata. Nel contesto dell'osteomielite cronica, in cui persistono la colonizzazione batterica e la formazione di biofilm, l'eliminazione degli agenti patogeni è un prerequisito per una significativa rigenerazione dei tessuti. L'idrogel CPG, sopprimendo l'eccesso di ROS e mantenendo un'efficace attività antibatterica attraverso la distruzione della membrana mediata da CMCSMA e la penetrazione del biofilm, offre un approccio equilibrato. Questa doppia funzione assicura che l'infiammazione non sia prolungata dalla presenza batterica persistente, consentendo una transizione dall'attivazione immunitaria a un microambiente rigenerativo. Pertanto, piuttosto che eliminare indiscriminatamente i ROS, questo sistema modula il microambiente ossidativo per supportare sia la clearance batterica che la guarigione dei tessuti.

Oltre all'attività antimicrobica, i cerotti idrogel CPG hanno mostrato una funzionalità biologica cruciale per la riparazione e la rigenerazione dei tessuti³¹. I saggi in vitro hanno dimostrato che l'idrogel supporta la vitalità e la proliferazione cellulare, nonché l'angiogenesi. Questi risultati sono coerenti con studi precedenti che hanno evidenziato l'importanza dell'angiogenesi nella guarigione delle ferite³². L'angiogenesi è fondamentale per fornire un adeguato apporto di ossigeno e nutrienti al tessuto ferito, facilitando la rigenerazione dei tessuti. Inoltre, gli effetti pro-angiogenici dell'idrogel sono particolarmente importanti per il trattamento delle ferite croniche, poiché queste ferite spesso soffrono di una scarsa vascolarizzazione, che ostacola il processo di guarigione^33,34. Promuovendo la formazione dei vasi sanguigni, l'idrogel CPG non solo contribuisce alla rigenerazione dei tessuti, ma crea anche un ambiente più favorevole per la sopravvivenza a lungo termine dei tessuti di nuova formazione. Inoltre, la capacità dell'idrogel di promuovere la migrazione e la differenziazione degli osteoblasti aggiunge un valore significativo nel contesto della guarigione ossea, in particolare per i pazienti con infezioni ossee croniche o difetti ossei³⁵. Il miglioramento dell'osteogenesi è una strada promettente per migliorare i risultati nell'osteomielite e nelle condizioni ossee correlate, dove la guarigione è spesso compromessa. Tale funzionalità osteoinduttiva, integrata con il controllo localizzato delle infezioni, affronta una sfida centrale nell'ingegneria del tessuto muscoloscheletrico: la necessità di soluzioni convergenti che promuovano sia la difesa antimicrobica che la rigenerazione dei tessuti in un'unica piattaforma.

I risultati in vivo corroborano ulteriormente il potenziale terapeutico dei cerotti idrogel CPG, mostrando la loro capacità di supportare la riparazione dei tessuti, ridurre le infezioni e promuovere l'osteogenesi. Nei modelli di ferite croniche, questi idrogel hanno facilitato efficacemente la chiusura della ferita e la rigenerazione dei tessuti. Nei modelli di rigenerazione ossea, l'idrogel CPG ha promosso la migrazione e la differenziazione degli osteoblasti, migliorando la guarigione ossea. Questi risultati sono in linea con quelli di altri studi che hanno esplorato la guarigione delle ferite a base di idrogel e le strategie di rigenerazione ossea³⁶. La capacità dei cerotti in idrogel CPG di affrontare contemporaneamente l'infezione, promuovere l'angiogenesi e supportare l'osteogenesi fornisce una potente piattaforma per la cura completa delle ferite, rendendoli un candidato promettente per l'uso clinico.

Nonostante questi risultati promettenti, ci sono diverse limitazioni allo studio attuale. In primo luogo, mentre i modelli in vitro e in vivo hanno dimostrato risultati positivi, gli studi preclinici sono stati condotti principalmente su modelli murini. Sebbene i topi siano ampiamente utilizzati per gli studi sulla guarigione delle ferite, potrebbero non replicare completamente la complessità della guarigione delle ferite umane. Pertanto, è necessaria un'ulteriore convalida in modelli animali più grandi, nonché in studi clinici sull'uomo, per confermare la sicurezza e l'efficacia di questi cerotti in idrogel in contesti clinici reali. In secondo luogo, sebbene gli idrogel CPG abbiano mostrato buone proprietà meccaniche e funzionalità biologica a breve termine, la loro stabilità a lungo termine e il comportamento di degradazione in vivo rimangono poco chiari. Gli idrogel possono degradarsi nel tempo e i loro prodotti di degradazione possono influenzare il processo di guarigione o addirittura indurre reazioni avverse. Gli studi futuri dovrebbero concentrarsi sull'ottimizzazione del tasso di degradazione di questi idrogel per garantire che si degradino in modo controllato, senza rilasciare sottoprodotti nocivi. Inoltre, il rilascio controllato di agenti bioattivi incorporati all'interno dell'idrogel deve essere ulteriormente perfezionato per garantire effetti terapeutici duraturi nel tempo, soprattutto per il trattamento delle ferite croniche.

Sebbene questo studio si concentri su un'impalcatura supramolecolare a base di idrogel, approcci alternativi per affrontare la stessa ipotesi terapeutica includono biosensori elettrochimici, sistemi microfluidici wound-on-chip e bende intelligenti che incorporano componenti elettronici per il rilevamento ambientale. Tuttavia, a differenza di quelle tecnologie che spesso richiedono fonti di alimentazione e interfacce complesse, il cerotto in idrogel sviluppato qui fornisce una piattaforma autonoma e visivamente interpretabile senza strumentazione esterna, il che lo rende particolarmente attraente per ambienti con risorse limitate.

L'importanza di questo lavoro risiede nel suo potenziale traslazionale. Oltre all'osteomielite, la piattaforma CPG può essere personalizzata per altre condizioni correlate all'infiammazione, come le ulcere del piede diabetico, le infezioni del sito chirurgico e il monitoraggio post-resezione del tumore. L'integrazione delle funzionalità diagnostiche e terapeutiche in un'unica matrice di idrogel offre un'opportunità unica per lo sviluppo di medicazioni intelligenti per ferite di nuova generazione. Inoltre, il sistema di colori strutturali basato su cristalli fotonici offre opportunità per il biorilevamento colorimetrico in tempo reale applicabile nella medicina personalizzata. Inoltre, la modularità del design CPG consente l'adattamento per la futura integrazione con cellule staminali, esosomi o vettori di consegna genica per estendere ulteriormente le sue capacità rigenerative, allineandosi con le attuali traiettorie della medicina rigenerativa di precisione.

Guardando al futuro, la ricerca futura dovrebbe concentrarsi su diversi settori chiave. Innanzitutto, l'ottimizzazione della composizione e della struttura dei cerotti idrogel CPG sarà fondamentale per migliorarne la stabilità e le prestazioni a lungo termine. La modifica della densità di reticolazione e l'incorporazione di altri agenti bioattivi, come fattori di crescita o citochine, potrebbero migliorare il potenziale terapeutico dell'idrogel per specifiche applicazioni cliniche. In secondo luogo, l'espansione della gamma di applicazioni di questi idrogel, oltre le ferite croniche, ad altri tipi di rigenerazione dei tessuti, come la riparazione dei nervi o della cartilagine, potrebbe dimostrare ulteriormente la loro versatilità. La ricerca su come gli idrogel CPG possano essere adattati a specifici tipi di ferite, come ulcere diabetiche o piaghe da decubito, è necessaria per espandere la loro applicabilità clinica. In terzo luogo, l'integrazione di terapie avanzate, come la terapia con cellule staminali o la terapia genica, con cerotti in idrogel può migliorare le loro proprietà rigenerative, consentendo trattamenti più completi ed efficaci. Infine, saranno necessari studi clinici multicentrici su larga scala e studi applicativi nel mondo reale per valutare la sicurezza, la producibilità, la conformità degli utenti e la prontezza normativa della piattaforma CPG, supportando così la sua eventuale traduzione clinica.

In conclusione, i cerotti in idrogel CPG rappresentano una piattaforma promettente per la cura avanzata delle ferite e la rigenerazione dei tessuti. La loro capacità di monitorare lo stress della ferita, rispondere alle variazioni di temperatura e pH, esibire proprietà antimicrobiche e promuovere la rigenerazione dei tessuti offre un approccio multiforme al trattamento delle ferite croniche. Sebbene i risultati degli studi preclinici siano incoraggianti, sono necessarie ulteriori ottimizzazioni e validazioni cliniche per realizzare appieno il potenziale di questi cerotti in idrogel in ambito clinico. Le direzioni future della ricerca dovrebbero includere miglioramenti nella composizione del materiale, applicazioni più ampie, integrazione con strategie terapeutiche avanzate e studi clinici per stabilirne l'efficacia e la sicurezza nell'uomo.

In questo esperimento, abbiamo utilizzato una combinazione di metilCSMA-PBA come scaffold opale inverso, idrogel GelMA sensibile alla temperatura come riempitivo e lo abbiamo caricato con SA per creare un cerotto di idrogel colorato strutturale intelligente diagnostico e terapeutico integrato CPG. I risultati sperimentali dimostrano che questo cerotto in idrogel presenta eccellenti proprietà meccaniche e forza adesiva. Può inibire la crescita batterica, sovraregolare significativamente l'espressione del fattore di crescita dell'endotelio vascolare e sottoregolare i livelli di fattori infiammatori, fornendo così prospettive cliniche significative per il trattamento della COM. Inoltre, è importante sottolineare che, in base alla capacità del CPG di rilevare i cambiamenti di temperatura e pH nel sito dell'infezione, svolge un ruolo di monitoraggio nel recupero postoperatorio dell'osteomielite cronica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acrilammide (AM, 99%)	Sigma-Aldrich	A8887	Monomero per polimerizzazione idrogel
Cloruro di acriloil (AC, 99%)	Prodotti chimici TCI	Codice A0376	Utilizzato nelle reazioni di modifica chimica
Allumina alcalina (200-300 mesh)	Aladdin	A112336	Utilizzato per purificare il metacrilato di metile
Anticorpo anti-bFGF	Santa Cruz	SC-9084	Colorazione in immunofluorescenza per la rilevazione del fattore di crescita
Anticorpo anti-CD31	Abcam	ab28364	Immunoistochimica per la rilevazione di marcatori vascolari
Anticorpo anti-EGF	Sigma-Aldrich	E9644	Colorazione immunoistochimica
Anticorpo anti-VEGF	Santa Cruz	SC-7269	Colorazione in immunofluorescenza per l'angiogenesi
Bis-acrilammide (BIS, 97%)	Sigma-Aldrich	Codice: M7279	Agente reticolante nella rete di idrogel
Kit di conteggio delle cellule-8 (CCK-8)	Dojindo	CK04	Valutazione della vitalità cellulare
Chitosano, metilacrilato (CSMA-PBA)	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C3641	Formazione di scaffold in patch di idrogel
Sonda DCFH-DA	Beyotime	Episodio 0033	Rilevamento di specie reattive dell'ossigeno (ROS)
Dimetilsolfossido (DMSO)	Società del gruppo farmaceutico nazionale cinese	DMSO-AR	Solvente per formulazione di idrogel
Escherichia coli (E. coli)	ATCC	-	Utilizzato nei test antibatterici
Microscopio a fluorescenza	Olimpo	BX53	Immunofluorescenza e imaging cellulare
Metacrilato di gelatina (GelMA)	Sigma-Aldrich	G1894	Componente in idrogel sensibile alla temperatura
Acido cloridrico (HCl)	Chongqing Tianyun	HCl-AR	Regolazione del pH nella sintesi
Perossido di idrogeno (H2O2)	Sigma-Aldrich	H1009	Induce lo stress ossidativo nelle cellule
Acido fluoridrico (HF, 4%)	Sinopharm	H814912	Mordenzatura di cristalli colloidali di silice
Macchina per prove di trazione universale Instron	Instron	3345	Prove di resistenza meccanica e adesiva
Celle L929	ATCC	CCL-1	Utilizzato per saggi di citotossicità e biocompatibilità
Microtomo Leica	Leica	Codice: RM2235	Utilizzato per il sezionamento di tessuti con paraffina
Ratti maschi di Sprague-Dawley (8 settimane)	Biotecnologia Reagan	-	Modello di osteomielite cronica in vivo
Masson' s Kit per macchie tricromiche	Distretto di Solarbio	G1340	Colorazione istologica per la fibrosi
Metacrilato di metile (MMA, 99%)	Sigma-Aldrich	Codice: M27805	Monomero per la formazione di scaffold
Kit di test MTT	Beyotime	Codice: M5655	Valutazione della proliferazione cellulare e della citotossicità
Paraformaldeide (4%)	Servicebio	G1101	Fissazione tissutale
Paraffina	Sigma-Aldrich	P1003	Terreno di inclusione per istologia
Tampone PBS	Gibco	10010023	Utilizzato nella lavorazione di cellule e idrogel
Fenilalanina (99%)	Sigma-Aldrich	P5482	Utilizzato nella modifica chimica
Acido fenilboronico (PBA)	Prodotti chimici TCI	P0157	componente sensibile al pH nell'idrogel
Persolfato di potassio (KPS)	Pechino Baolingwei	KPS-AR	Iniziatore radicalico nella polimerizzazione
Kit di reagenti PrimeScript RT	Takara	RR047A	Utilizzato per la sintesi di cDNA
Kit per il dosaggio delle specie reattive dell'ossigeno (ROS)	KeyGen Biotech	KGAF019	Valutazione dell'attività antiossidante
Sistema di PCR in tempo reale	Biosistemi Applicati	Passo OnePlus	Quantificazione dell'espressione genica
RNAiso Plus	Takara	9108	Reagente per estrazione di RNA
Reometro (HR-1)	Strumenti TA	HR-1	Caratterizzazione reologica dell'idrogel
Acido salicilico (SA)	Sigma-Aldrich	Episodio 3254	Molecola di farmaco in idrogel
Microscopio elettronico a scansione (SEM)	JEOL	JSM-7500F	Analisi morfologica della struttura dell'idrogel
Nanoparticelle di silice (12 nm)	Sigma-Aldrich	637246	Formazione di modelli di cristalli colloidali di silice
Idrossido di sodio (NaOH)	Società del gruppo farmaceutico nazionale cinese	NaOH-AR	Regolazione del pH
Staphylococcus aureus (S. aureus)	ATCC	-	Utilizzato nei test antibatterici
SYBR Green PCR Master Mix	Biosistemi Applicati	4367659	reagente di rilevamento qPCR
Sorgente di luce UV (365 nm, 3 mW/cm²)	Herolab	UVT-28	Utilizzato per la polimerizzazione UV
Spettrofotometro UV	Shimadzu	UV-2600	Misurazione del rilascio di farmaci