Articolo metodologico

Un metodo minimamente invasivo per la generazione di un modello murino ortotopico singenico di carcinoma polmonare

DOI:

10.3791/68676

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19 agosto 2025

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1Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa Health Care, 2Department of Neuroscience and Pharmacology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Department of Radiation Oncology, Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 4Free Radical Radiation Biology Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Geminii, Inc., 6Interdisciplinary Graduate Program in Molecular Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 7Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa Health Care

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una delle principali sfide nello sviluppo di nuove terapie per il cancro del polmone include la modellazione del microambiente tumorale man mano che la malattia regionale progredisce verso la malattia metastatica. Qui, descriviamo un metodo semplice per stabilire un modello singenico ortotopico del cancro del polmone che consente il monitoraggio in vivo della malattia nel tempo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) continua ad essere la prima causa di morte correlata al cancro sia per le donne che per gli uomini in tutto il mondo. È necessario raccogliere ulteriori informazioni per comprendere le interazioni tra le cellule tumorali, il sistema immunitario, il microambiente all'interno di ciascun tumore e il tessuto ospite per sviluppare modalità di trattamento più efficaci. Qui riportato è un metodo semplice e ripetibile per indurre il cancro all'interno del polmone di topo, che consente il monitoraggio della crescita del tumore dalla malattia allo stadio iniziale a quello avanzato. La procedura chirurgica prevede una piccola incisione superficiale nella pelle e un'iniezione di cellule tumorali attraverso i muscoli intercostali nel polmone. I sistemi di imaging in vivo (IVIS) in combinazione con cellule ingegnerizzate per esprimere la luciferasi forniscono un modo conveniente per valutare la crescita del tumore e la progressione della malattia nel corso di uno studio. Questa tecnica è facilmente trasferibile in vari modelli di cancro del polmone e può essere utilizzata per testare la fattibilità e l'efficacia di nuove terapie in un modello preclinico di cancro del polmone che imita il microambiente tumorale naturale. Ciò amplia la rilevanza degli studi di efficacia e sicurezza/tossicità che utilizzano trattamenti standard di cura, tra cui resezione chirurgica, radioterapia e immunoterapie in combinazione con terapie sperimentali.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il cancro del polmone continua ad essere uno dei tumori più diagnosticati e la prima causa di morte correlata al cancro tra uomini e donne a livello globale 1,2,3. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) rappresenta quasi il 90% di tutti i casi di cancro del polmone negli Stati Uniti e, sebbene il panorama dei trattamenti sia notevolmente migliorato negli ultimi anni, continua ad esserci molto interesse nello sviluppo di nuove terapie che migliorano i risultati4. Sebbene ci siano stati molti progressi nello sviluppo di terapie mirate per specifiche mutazioni driver e immunoterapie per sottotipi di NSCLC responsivi, il tasso di sopravvivenza globale a cinque anni continua ad essere basso, attestandosi intorno al 20% per tutti gli stadi del cancro del polmone 2,5,6,7. Inoltre, sebbene l'immunoterapia abbia fatto passi da gigante nel migliorare la sopravvivenza nella malattia avanzata, questi miglioramenti hanno solo spostato l'ago della bilancia da una sopravvivenza globale a cinque anni del 6,8% al 10,7% e aumentato il tempo di sopravvivenza da 7 mesi a8 mesi. C'è ancora un grande bisogno di comprendere i meccanismi d'azione della malattia e di sviluppare nuove terapie che si sinergizzino con le attuali terapie standard di cura. La comprensione dei meccanismi in gioco della progressione naturale del NSCLC e della risposta a nuove terapie richiede modelli preclinici che siano riproducibili in modo affidabile, facili da indurre e che incapsulano il microambiente tumorale all'interno del quale si sviluppa il cancro.

Negli ultimi decenni, sono state sviluppate molte procedure diverse per valutare i modelli ortotopici di cancro del polmone nei roditori. Le procedure vanno da molto invasive, che richiedono un alto livello di competenza, come l'impianto intrapolmonare o le procedure di trapianto che aprono la cavità toracica 9,10,11,12,13; moderatamente invasivi come le procedure intratracheali e orotracheali 14,15,16,17; a procedure minimamente invasive, come iniezioni percutanee, vena caudale o induzione intranasale 18,19,20,21. Tutte le procedure offrono rischi e benefici diversi, con tecniche più invasive che consentono una maggiore precisione ma tassi di attrito potenzialmente più elevati, e tecniche meno invasive che garantiscono una migliore sopravvivenza ma una maggiore variabilità dei siti di impianto del tumore. Di questi vari protocolli, alcuni scelgono di non tracciare la crescita tumorale in vivo e di completare solo le valutazioni dei tumori ex vivo 9,11,12,16. Tra i protocolli che tracciano la crescita tumorale nel tempo, i protocolli precedenti si basano maggiormente su sistemi come la tomografia computerizzata (CT)14,19, la tomografia a emissione di posizione (PET)18 e la risonanza magnetica (MRI)17, mentre i protocolli successivi, dopo che i sistemi di imaging a bioluminescenza (BLI) e le cellule geneticamente modificate sono diventati più facilmente disponibili, optano per il monitoraggio della crescita tumorale nel tempo con BLI20. 21.

Lo scopo dello sviluppo di questo protocollo è stato quello di trarre insegnamenti da queste altre procedure e creare un metodo semplice ma affidabile per indurre un tumore polmonare solitario per studiare la progressione del NSCLC a partire dalle prime fasi della malattia, in cui il tumore è confinato al polmone. L'obiettivo generale di questo articolo è quello di descrivere i metodi per generare un modello murino ortotopico singenico affidabile e minimamente invasivo di cancro del polmone che può essere monitorato utilizzando l'imaging in vivo e può consentire ai ricercatori di studiare il cancro del polmone nell'organo da cui deriva la malattia. Questo metodo è efficace per generare sia modelli murini ortotopici di xenotrapianto utilizzando linee cellulari di cancro al polmone umano sia modelli murini ortotopici singenici utilizzando linee cellulari di cancro al polmone di topo in topi con sistema immunitario intatto, conferendo versatilità al metodo per studiare sia i tipi di cancro umano che la complessa interazione del sistema immunitario e del NSCLC.

Ci siamo concentrati sull'ottimizzazione di questo protocollo nel modello murino di NSCLC immuno-competente, Lewis Lung Carcinoma (LLC), poiché questo modello consente ai ricercatori di comprendere meglio la risposta del sistema immunitario con e senza le attuali terapie come la chemioterapia, la radioterapia, l'immunoterapia e altre terapie mirate 22,23,24,25. Il protocollo genera un modello rappresentativo della malattia in fase iniziale all'inoculazione (tumore nel parenchima polmonare) e della metastasi verso la fine degli studi, poiché il tumore spesso supera il parenchima polmonare e semina altri tessuti.

Un aspetto importante dello studio dei modelli ortotopici è la capacità di monitorare ripetutamente la crescita del tumore, con il minimo stress per l'animale, e rapidamente in modo che ogni animale in uno studio possa essere valutato in un singolo punto temporale. Sebbene le tecniche di imaging come la risonanza magnetica o la TC consentano una maggiore risoluzione del tumore, queste modalità di imaging sono costose, richiedono molto tempo e hanno difficoltà a monitorare la crescita precoce del tumore in piccoli modelli animali come i topi 26,27,28,29,30,31. Pertanto, abbiamo scelto di monitorare la crescita tumorale attraverso la bioluminescenza utilizzando cellule tumorali ingegnerizzate con luciferasi. In questo protocollo, abbiamo iniettato 25.000-50.000 cellule LLC ingegnerizzate con luciferasi firefly (LLC-luc) e rilevato i tumori già il giorno successivo mediante BLI. La reazione luciferina-luciferasi è uno strumento utile per monitorare la crescita tumorale in vivo utilizzando strumenti di imaging spettrale. A causa della sensibilità di questi sistemi di imaging per tracciare i fotoni di luce, le cellule tumorali che esprimono luciferasi possono essere tracciate in vivo precocemente, spesso prima che i tumori possano essere rilevati in un modello murino mediante risonanza magnetica o TC, e frequentemente 26,32,33,34.

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Protocollo

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Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono esaminate e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università dell'Iowa. I topi C57BL6/N (età 4-6 settimane) vengono acquistati e acclimatati per almeno 1 settimana prima degli interventi chirurgici. Tutti gli animali seguono un ciclo luce/buio di 12 ore. Gli animali sono alloggiati in 4 per gabbia e hanno pieno accesso a cibo e acqua fino al momento dell'anestesia.

1. Selezione e crescita delle cellule per l'iniezione

  1. Eseguire un saggio della luciferasi per selezionare una linea cellulare come descritto in35.
    1. Coltivare le cellule LLC-luc nel terreno di Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), L-glutammina e penicillina/streptomicina in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C con elevata umidità. Eseguire il test quando le cellule sono confluenti al 50%-100%.
    2. Prima di eseguire il test, lavare le cellule con 1x PBS.
    3. Aggiungere 200 μL di tampone/pozzetto di lisi (25 mM Tris/fosfato, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, 10% glicerolo) in una piastra a 6 pozzetti. Raschiare le cellule dal pozzetto e trasferirle in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare le celle a 16.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Verificare che si formi un pellet di cella compatta sul fondo della provetta e raccogliere il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga.
    4. Trasferire metà dell'estratto cellulare in una nuova provetta da microcentrifuga e conservarlo per la quantificazione delle proteine. Aggiungere 2 mM di ditiotreitolo alla metà rimanente e mescolare bene.
    5. Combinare 8 μL di estratto cellulare contenente 2 mM di ditiotreitolo con 42 μL di tampone per il saggio (25 mM Tris/fosfato, 20 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 2 mM ATP, 1 mM ditiotreitolo). Aggiungere 50 μl di luciferina 0,5-1 mM.
    6. Misurare il picco di luminescenza riportato come unità di luce relativa (RLU) e valutare il contenuto proteico con un metodo di quantificazione proteico preferito per riportare la luminescenza come RLU per mg di proteina (RLU/mg).
  2. Selezionare una linea cellulare con luminescenza compresa tra 8.000 e 15.000 RLU/mg.
    NOTA: Evitare di selezionare un'espressione di luciferasi più elevata (>15.000 RLU/mg) in quanto ciò potrebbe saturare lo strumento BLI.

2. Preparazione delle cellule

  1. Coltivare cellule LLC-luc in DMEM integrato con il 10% di FBS, L-glutammina e penicillina/streptomicina in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C con elevata umidità per almeno 1 settimana prima dell'uso.
    NOTA: Monitorare la crescita per limitare la confluenza al 70%-80% e dividere utilizzando tripsina-EDTA allo 0,25% secondo necessità per raggiungere la quantità desiderata per le iniezioni come descritto in precedenza36.

3. Preparazione prechirurgica

  1. Per i topi con pelo, radersi 1 giorno prima dell'intervento.
  2. Posizionare il topo in una camera di induzione per anestetizzare utilizzando l'isoflurano. Impostare la portata di ossigeno a 2,0 L/min e il vaporizzatore al 2% di isoflurano; Regolalo in base alle dimensioni del mouse indotto.
  3. Monitorare la respirazione dei topi e utilizzare un riflesso di ritiro del pedale per confermare l'anestesia appropriata.
  4. Posizionare il mouse in un cono del naso in posizione prona su un dispositivo di riscaldamento approvato IACUC. Verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato utilizzando il riflesso di ritiro del pedale prima di continuare.
  5. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi.
  6. Quando il mouse è adeguatamente anestetizzato, utilizzare un tagliaunghie elettrico per rimuovere un'ampia area rettangolare (2 cm x 3 cm) nella parte dorsale sinistra del mouse. Radersi alla colonna vertebrale medialmente, alla tavola lateralmente fino a quando non è visibile il pelo, all'ultima costola (13a) inferiormente e al bordo superiore della scapola verso la testa.
  7. Posizionare il mouse in una gabbia vuota su un dispositivo di riscaldamento approvato IACUC e osservare la respirazione del mouse fino a quando il mouse non è sveglio e vigile. A questo punto, riporta il topo nella sua gabbia di casa fino all'intervento chirurgico.

4. Preparazione della sospensione cellulare per l'iniezione

  1. Il giorno del prelievo delle cellule (fase 2.2), aggiungere terreno fresco con 50 mg/mL di gentamicina 3-4 ore prima del prelievo per rimuovere le cellule morte e staccate.
  2. Aspirare il terreno e lavare le cellule con 1x PBS. Aggiungere tripsina-EDTA e incubare per 1-2 minuti a 37 °C.
  3. Disperdere le cellule e aggiungere terreno per neutralizzare la tripsina. Raccogliere le cellule in una provetta conica da 50 mL.
  4. Centrifugare a 1.200 × g per 3 minuti a temperatura ambiente. Verificare che si formi un pellet di cella compatta sul fondo del tubo, aspirare il surnatante e lavare il pellet con 1x PBS. Ripeti questo passaggio 3 volte.
  5. Risospendere il pellet cellulare in 1x PBS a circa 1-2 milioni di cellule/mL per il conteggio. Filtrare attraverso un filtro cellulare da 40 μm prima del conteggio.
  6. Combinare 10 μL di sospensione cellulare con 10 μL di Trypan Blue e contare utilizzando un emocitometro. Crea una sospensione cellulare 2 volte e conta entrambe per verificare il conteggio delle cellule. Calcola la conta totale delle cellule e la vitalità.
  7. Far girare le celle a 1.200 × g per 3 minuti a temperatura ambiente per la risospensione nel volume di iniezione finale. Aspirare il PBS.
  8. Risospendere le cellule in 0,5 mg/mL di Matrigel in 1x PBS al numero di cellule desiderato per iniezione in un volume di 50 μL. Mantenere la sospensione cellulare finale su ghiaccio durante la procedura per evitare la solidificazione.
    NOTA: Questo protocollo utilizza celle LLC-luc. Iniettare a 25.000-50.000 cellule in 50 μL di volume per topo.

5. Preparazione chirurgica

  1. Eseguire la procedura in una sala chirurgica approvata dall'IACUC per le procedure asettiche. Pulire il tavolo operatorio con un disinfettante approvato dal veterinario.
  2. Posizionare un termoforo disinfettato approvato dall'IACUC nell'area chirurgica. Stendere un telo chirurgico sterile sul termoforo.

6. Anestesia chirurgica

  1. Posizionare il topo in una camera di induzione per anestetizzare utilizzando l'isoflurano. Impostare la portata di ossigeno a 2,0 L/min e il vaporizzatore al 2% di isoflurano.
    NOTA: La concentrazione di isoflurano può essere regolata in base alle dimensioni del mouse.
  2. Monitorare la respirazione del topo e utilizzare un riflesso di ritiro del pedale per confermare l'anestesia appropriata.
  3. Posizionare il mouse in una cono nasale in posizione sdraiata laterale destra sul telo chirurgico sterile. Verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato utilizzando il riflesso di ritiro del pedale prima di continuare.
  4. Somministrare analgesico preoperatorio, meloxicam (2 mg/kg di peso) per via sottocutanea e unguento oftalmico a entrambi gli occhi.

7. Iniezione polmonare ortotopica

  1. Pulire il sito chirurgico 3 volte alternando etanolo al 70% e betadina utilizzando una garza sterile. Posizionare sul mouse un telo chirurgico fenestrato sterilizzato con un'apertura di 3 cm x 4 cm. Posizionare gli strumenti sterilizzati in autoclave sul telo chirurgico.
  2. Determina dove eseguire l'incisione individuando il bordo cranico della scapola e il bordo caudale della gabbia toracica toracica usando una pinza. Assicurarsi che la pelle sia tesa utilizzando il pollice e l'indice del chirurgo e praticare un'incisione superficiale di 5 mm solo attraverso la pelle direttamente sotto la scapola con una lama di misura 10.
    NOTA: Il chirurgo deve indossare guanti sterili.
  3. Usa le forbici dritte da 115 mm per sezionare il grasso sottocutaneo dalle costole e dai muscoli intercostali. Non tagliare i muscoli intercostali.
    NOTA: Fare attenzione a non danneggiare l'arteria toracodorsale e il ramo profondo dell'arteria cervicale trasversale, che si trovano vicino alla scapola. Un leggero sanguinamento può verificarsi a causa del taglio dei capillari all'interno della pelle e del grasso sottocutaneo. Arrestare l'emorragia applicando una leggera pressione con un applicatore sterilizzato con punta di cotone.
  4. Usa la pinza Micro-Adson per tenere aperta l'incisione. Partendo dalla settima costola vera, usa una pinza curva a punta media per contare verso l'alto per identificare le costole quattro e cinque. Osservare quest'area per l'iniezione.
  5. Mescolare la sospensione cellulare invertendo delicatamente 3-4 volte. Immediatamente prima dell'iniezione, utilizzare una siringa da insulina sterile da 300 μl 31 G da 8 mm per aspirare 50 μl di sospensione cellulare e assicurarsi che non siano presenti bolle.
  6. Aggiungere una striscia di nastro metallico sterilizzato di 4 mm di spessore all'ago, a filo con la siringa, per fungere da tappo. Ciò garantisce che l'ago entri solo 4 mm in profondità nel polmone.
  7. Iniettare la sospensione cellulare da 50 μL direttamente sotto la quarta costola nello spazio intercostale tra la quarta e la quinta costola con un angolo di 90° perpendicolare al polmone. Dopo aver iniettato la sospensione cellulare, tenere l'ago in posizione per 2-3 secondi per consentire al Matrigel di indurirsi e impedire alle cellule di uscire dal sito di iniezione.
  8. Rimuovere lentamente l'ago con la stessa angolazione e gettarlo in un contenitore per oggetti taglienti.
  9. Sutura la pelle con 2-3 punti di sutura, chiudendo con nodi quadrati, e aggiungi adesivo chirurgico veterinario per assicurarti che la ferita sia sufficientemente chiusa.

8. Procedure post-chirurgiche

  1. Posiziona il mouse in una gabbia vuota su un dispositivo di riscaldamento approvato IACUC. Monitorare il mouse fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia, che dovrebbe richiedere 1-2 minuti.
  2. Una volta che il topo è vigile e si muove, mettilo in una gabbia con lettiera fresca. Osservare frequentemente il topo entro le prime 24 ore per eventuali segni di dolore o infezione.
  3. Somministrare l'analgesico FANS, meloxicam (2 mg/kg di peso), tramite iniezione sottocutanea per 2 giorni dopo l'intervento chirurgico.

9. Monitoraggio della crescita tumorale mediante BLI in vivo

  1. Monitorare la crescita del tumore nel polmone utilizzando il BLI già il giorno dopo l'intervento chirurgico e una volta al giorno.
  2. Esegui l'imaging in vivo utilizzando un sistema di imaging in vivo (IVIS).
    1. Preparare la luciferina a 15 mg/mL in 1x PBS senza magnesio o calcio. Per un topo da 20 g, ciò equivale a iniettare 200 μL della soluzione di luciferina da 15 mg/mL.
      NOTA: Proteggere la soluzione di luciferina preparata dalla luce coprendola con un foglio di alluminio quando non è in uso poiché è sensibile alla luce.
    2. Apri il software e imposta i parametri per l'imaging bioluminescente. Impostare il tempo di esposizione su Auto. Impostare il fattore di binning su 4.
    3. Iniettare nei topi per via intraperitoneale 150 mg di luciferina per kg di peso.
    4. Quando si esegue l'imaging di un nuovo modello di cellula tumorale per la prima volta, eseguire una curva cinetica per identificare il tempo ottimale di assorbimento della luciferina, che è indicato da quando la luminescenza raggiunge il picco prima che inizi a stabilizzarsi.
      1. Iniettare nei topi la luciferina. Attendere 3 minuti per l'assorbimento della luciferina.
      2. Immagini di mouse ogni 5-10 minuti per 60 minuti.
        NOTA: Il tempo di assorbimento ottimale per le diverse linee cellulari varia in genere da 5 a 15 minuti.
    5. Per tutte le successive sessioni di imaging, utilizzare il tempo di assorbimento ottimale della luciferina. Anestetizzare i topi in preparazione per l'imaging durante questo periodo. Posizionare i topi in una camera di induzione al 2% di isoflurano con una portata di 2,0 L/min.
    6. Al termine dell'acquisizione, scattare due immagini selezionando Acquisisci.
      1. Prima immagine: il topo sdraiato in posizione sdraiata laterale destra. Ciò consente alla telecamera di catturare il sito di iniezione, che si trova nella parte laterale sinistra del mouse. Utilizzare questa vista per quantificare la crescita del tumore. Le immagini catturate in questa posizione saranno indicate da qui in poi come vista laterale sinistra.
      2. Subito dopo aver completato la prima immagine, scattare una seconda immagine del mouse in posizione supina. Ciò consente alla fotocamera di catturare i fotoni emessi dal tumore nella cavità toracica dalla vista ventrale. Utilizzare questa vista (qui indicata come vista ventrale) per stimare la posizione del cancro all'interno della cavità toracica.
  3. Per analizzare le immagini, modificare le unità da Conteggi a Radianza.
  4. Aprire il palato degli attrezzi. Andare su Regolazione immagine, selezionare Manuale. Scegli un minimo e un massimo per la barra dei colori che meglio si adatta alle immagini scattate.
  5. Apri Strumenti ROI. Seleziona il menu a discesa del cerchio per aggiungere un cerchio della regione di interesse (ROI) all'immagine. Sposta il cerchio sopra l'incisione per la vista laterale sinistra e sopra il centro del torace per la vista ventrale.
  6. Seleziona Misura ROI.

10. Valutazione dei criteri di inclusione e di esclusione

  1. Innanzitutto, confermare la presenza di luminescenza tumorale nel polmone osservando l'immagine della vista laterale sinistra.
  2. Successivamente, confermare la presenza di luminescenza tumorale nella cavità toracica sinistra nell'immagine di visualizzazione ventrale. Quindi, verificare che ci sia un solo sito di luminescenza dall'immagine della vista ventrale.
  3. Se questi due criteri (passaggi 10.1, 10.2) sono soddisfatti, valutare i criteri di esclusione assicurandosi che la luminescenza non attraversi la linea mediana nella cavità toracica nell'immagine di visualizzazione ventrale. Se non è rilevabile alcuna luminescenza nell'immagine laterale sinistra dopo due immagini IVIS consecutive nel corso di 4 giorni dopo l'intervento chirurgico, escludere questo topo da ulteriori studi, poiché le cellule tumorali probabilmente non hanno preso.

11. Valutazione dei tumori al termine degli studi

  1. Quando il flusso totale della luminescenza tumorale raggiunge 1 × 108 fotoni/s (p/s) o superiore, raccogliere i topi per le valutazioni degli endpoint.
  2. Raccogliere il tumore per l'analisi anatomica macroscopica o l'istologia eseguendo i seguenti passaggi per l'anestesia e la perfusione del polmone come descritto in precedenza37.
    1. Posizionare il topo in una camera di induzione per anestetizzare utilizzando l'isoflurano. Impostare la portata di ossigeno a 2,0 L/min e il vaporizzatore al 2% di isoflurano. Monitorare la respirazione del topo e utilizzare un riflesso di ritiro del pedale per confermare l'anestesia appropriata.
      NOTA: La concentrazione di isoflurano può essere regolata in base alle dimensioni del mouse.
    2. Posiziona il mouse in un cono del naso in posizione supina. Verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato utilizzando il riflesso di ritiro del pedale prima di continuare.
    3. Apri la cavità toracica del topo per visualizzare i polmoni e il cuore dietro il diaframma.
    4. Esegui un lungo taglio verticale inferiormente lungo la linea mediana del mouse. Muovi l'intestino per visualizzare l'arteria renale sinistra.
    5. Taglia il diaframma per visualizzare il cuore.
    6. Tagliare l'arteria renale sinistra.
    7. Iniettare circa 5-10 mL di 1x PBS attraverso il ventricolo destro del cuore a una frequenza di circa 5 mL/min.
    8. Fai un'incisione lungo il collo. Eliminare il grasso sottocutaneo situato sopra la trachea. Fare attenzione a non tagliare la trachea.
    9. Forare la trachea parallelamente con un ago per iniettare il 10% di formalina direttamente nella trachea per gonfiare e fissare i polmoni.
    10. Procurare i polmoni dalla cavità toracica tagliando la trachea sopra l'apice del polmone e tagliare la pleura e i legamenti che collegano il polmone alla cavità toracica.
    11. Mettere in formalina al 10% per fissare.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo studio, i topi C57BL6/N sono stati iniettati secondo il protocollo presentato (Figura 1). Sono state utilizzate cellule LLC geneticamente modificate per esprimere la luciferasi (LLC-luc). Inoltre, a un topo fittizio è stato iniettato Matrigel senza cellule tumorali. Il BLI su IVIS può essere iniziato già 1 giorno dopo l'intervento. Questo studio LLC-luc è stato ottimizzato su BLI per valutare il carcinoma polmonare in fase iniziale. Il sistema BLI ...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive una procedura ottimizzata, minimamente invasiva che consente tempi di recupero rapidi e un monitoraggio quasi immediato del tumore, che differisce dai metodi più intensi chirurgicamente precedentemente descritti 10,11,20,38,39,40,41,42,43,44,45

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C.H. e C.S.C. sono i fondatori di Geminii, Inc. I termini di questo accordo sono stati esaminati e approvati dall'Ufficio per il conflitto di interessi nella ricerca dell'Università dell'Iowa. Tutti gli altri autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo ringraziare i membri dei laboratori Carter e Sheffield, Susan Walsh, Bryan Allen e Kranti Mapuskar per le preziose discussioni. Vorremmo anche ringraziare Samantha Eckley, veterinaria clinica senior presso l'Office of Animal Resources, per la sua guida e i suoi consigli. Ringraziamo l'uso del sistema di imaging IVIS Lumina S5 presso la Small Animal Imaging Core Facility, una risorsa fondamentale supportata dal Dipartimento di Radiologia dell'Università dell'Iowa. Illustrazioni grafiche da figure generate utilizzando Biorender (https://biorender.com). Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health NCI R21CA256301 (C.S.C., V.C.S.), Free Radical Radiation Biology Program NCI T32CA078586 (S.C.H.), IVIS Lumina S5 Imaging System acquistato su 1S10OD026835.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% Tripsina-EDTA (1x)Gibco25200-056
Formalina tamponata al 10% di neutroVWR16004-112
Piatti trattati per coltura tissutale 100 mm x 20 mmDot Scientific Inc.667621
Etanolo puro a 190 proofDecon Labs2801
Siringa di insulina 3/10 mL con ago BD Ultra-Fine 31 G x 5/16 in.Beckton Dickinson328438
3M Vetbond3M1469SB
ATPSigmaA5394
Soluzione Betadina 10% Antisettico Povidone-IodoArvio Health L.P.67618-150-04
Mouse C57BL6/NLaboratori Charles River
Cell Strainer 40um Nylon & nbsp;Falcone352340
Macchina anestetica compattaAnestesia Vetamac  
Pad riscaldante a infrarossi lontani con controllerKent Scientific Corporation & nbsp;
Manico a lama chirurgica convenzionale, taglia 3Brad-Parker371030
Pinze curbate a punto medio a uso generaleFisherbrand16-100-110
DitiotreitoloProdotti di Ricerca InternazionaleD11000
D-Luciferina (sale di sodio)Cayman Chemical14682
Drappeggio, Chirurgico 18" x 26" Non Fenestrato, SterileTrattato783410
Dulbecco' s Eagle Medium Modificato (1x)Gibco11965-092
Dulbecco' s Soluzione Salina Tamponata con Fosfato (PBS) 1xGibco14190-144
EGTASigmaE3389
Siero bovino fetaleGibcoA5670402
Sorgente luminosa del microscopio a fibra ottica FL150Meiji 
Soluzione di solfato di gentamicinaIBI ScientificIB02030
GliceroloProdotti di Ricerca InternazionaleG22025
IsofluranoPrimal Pharma Limited66794-013-25
IVIS Lumina S5PerkinElmer 
Software per immagini viventiPerkinElmer 
LL/2 (LLC1)ATCCCRL-1642Utilizzare la linea cellulare tumorale che meglio si adatti alle esigenze dello studio 
Solfato di magnesioFisher ScientificM63
Matrice di membrana basale MatrigelCorning354234
Portaago per aghi Mayo-Hegar, 6", mascelle seghettateMiltex8-44TC
Pinze Micro-AdsonStrumenti scientifici di qualità10018-12
Tagliazampele N5 con doppia lamaOneisall 
Spugne di garza non sterili a 12 stratiNDCP157112
Lubrificante Occhi OptixcareAventix5914304
Penicillina StreptomicinaGibco15140-122
Sutura di seta permanente a mano 6-0 1 x 18"Ethicon K802H
Acido fosforico 85%Fisher ScientificA242
Bisturi Dimensione 10, Acciaio Inossidabile, SterileChirurgia di Cincinnati110
Tubo a vite conico 50 mLSarstedt62.547.100
Forbici per tessuti 4,5" Staight PremiumOnsungSCT115
Triton X-100SigmaT6878
Trizma BaseSigmaT1503
Tripano Blu (0,4%)Gibco15250-061
Nastro di alluminio utilitario con foderoIPGALF150L
Applicatori di cotone con punte di legno a fustoNDC76200

Riferimenti

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