Articolo metodologico

Visualizzazione precisa dei recettori dell'insulina A e B nel cervello murino con un test di ibridazione in situ dell'RNA

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DOI:

10.3791/68677

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15 luglio 2025

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1Diabetes Section/Laboratory of Clinical Investigation, National Institute on Aging, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

Abbiamo messo a punto un saggio di ibridazione in situ Duplex per mappare le isoforme del recettore dell'insulina IR-A e IR-B nel plesso coroideo murino, superando i limiti dei metodi tradizionali. Questo approccio ad alta risoluzione rivela l'espressione specifica dell'isoforma, offrendo nuove intuizioni sulla segnalazione dell'insulina cerebrale e sulle potenziali terapie mirate all'isoforma per i disturbi neurologici.

Abstract

I recettori dell'insulina (IR) sono ampiamente espressi in tutti i tessuti e in tutti i tipi di cellule. Esiste in due isoforme funzionalmente distinte - IR-A e IR-B - che differiscono per 12 amminoacidi a causa dello splicing alternativo dell'esone 11. Queste isoforme mostrano modelli di espressione tessuto-specifici, con la loro abbondanza relativa che varia durante lo sviluppo, l'invecchiamento e la malattia. A causa della loro elevata somiglianza di sequenza, distinguere tra IR-A e IR-B utilizzando i metodi immunologici tradizionali è stato difficile. Qui, descriviamo un nuovo saggio di ibridazione in situ duplex (ISH) che consente la visualizzazione dell'espressione di IR-A e IR-B nei tessuti. Utilizzando questo approccio, dimostriamo per la prima volta che mentre entrambe le isoforme sono espresse nel plesso coroideo murino, l'IR-A è predominante. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare la distribuzione spaziale delle isoforme del recettore dell'insulina in situ tra diversi tessuti. Sebbene la qPCR in tempo reale sia in grado di rilevare i trascritti IR-A e IR-B in colture monocellulari in vitro , manca della capacità di localizzazione spaziale all'interno di tessuti complessi, evidenziando la necessità e l'utilità della tecnica Duplex ISH.

Introduzione

Il recettore dell'insulina (IR) è un recettore enzimatico transmembrana a passaggio singolo che media i diversi effetti fisiologici dell'insulina. Funziona come una proteina dimerica, con ogni monomero composto da due catene peptidiche legate da un legame disolfuro: la subunità α extracellulare, che contiene il dominio di legame del ligando, e la β-subunità transmembrana, la cui sequenza intracellulare possiede un'attività tirosin-chinasicaintrinseca 1. Attraverso lo splicing alternativo dell'esone 11, la trascrizione del gene IR dà origine a due varianti di mRNA IR. L'IR-A manca dell'esone 11, mentre l'IR-B lo conserva. Di conseguenza, IR-A e IR-B differiscono per una sequenza di 12 aminoacidi vicino al C-terminale della subunità α, con conseguente legame distinto di fattori di crescita oltre all'insulina matura e variabili proprietà di segnalazione a valle. Sebbene entrambe le varianti mostrino un'affinità simile per l'insulina, l'IR-A ha una maggiore affinità per il fattore di crescita insulino-simile-II-II (IGF-II) e la proinsulina rispetto all'IR-B. I modelli di espressione di IR-A e IR-B variano a seconda del tipo di tessuto e di cellula e dello stato di malattia2.

La loro espressione differenziale nei tessuti e nelle malattie sottolinea il loro contributo unico alla fisiologia e alla patologia. Il plesso coroideo (CP), una struttura specializzata che produce liquido cerebrospinale (CSF) e fa parte della barriera sangue-CSF, svolge un ruolo fondamentale nel trasporto dei nutrienti, nell'eliminazione dei rifiuti e nella neuroprotezione, specialmente durante l'infiammazione. Entrambe le isoforme IR sono espresse nel CP, dove probabilmente regolano il volume e la composizione del CSF. IR-A, attraverso il suo legame ad alta affinità da parte di IGF-II, probabilmente promuove la proliferazione cellulare e la riparazione tissutale nell'epitelio CP. IR-B, d'altra parte, è implicato nel trasporto di insulina attraverso la barriera emato-liquorale, supportando la disponibilità di insulina nel cervello per astrociti, neuroni, glia e omeostasi del glucosio 3,4.

I livelli pre-diabetici di IR sono stati associati a un'elevata tau del liquido cerebrospinale in individui asintomatici a rischio genetico per la malattia di Alzheimer (AD)5 e le alterazioni del rapporto IR-A/IR-B sono state collegate all'insulino-resistenza, all'invecchiamento e all'aumento dell'attività proliferativa, fattori che possono contribuire al cancro e ad altrepatologie. L'identificazione di pattern di espressione isoforma-specifici di IR-A e IR-B rappresenta un passo fondamentale verso lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per disturbi complessi del sistema nervoso centrale. Tuttavia, gli approcci attuali, come l'immunocolorazione e la qPCR, sono limitati: non tutte le proteine possono essere immunomarcate in modo affidabile a causa della mancanza di anticorpi convalidati e, sebbene la qPCR sia altamente specifica, manca di risoluzione spaziale.

Per superare queste limitazioni, abbiamo utilizzato l'ibridazione in situ duplex (ISH), una tecnologia avanzata di rilevamento dell'RNA basata sulla piattaforma RNAscope BaseScope. Questo test impiega un esclusivo design della sonda a doppia Z che richiede il legame tandem all'RNA bersaglio, consentendo un'elevata specificità e sensibilità, anche per i trascritti a bassa abbondanza. Il segnale fluorescente o cromogenico viene amplificato attraverso più eventi di legame con la sonda, migliorando il rilevamento e riducendo il fondo7. A differenza dell'RNAscope standard, questo test è ottimizzato per rilevare brevi sequenze di RNA (50-300 basi), il che lo rende particolarmente adatto per identificare eventi di splicing alternativi, varianti a singolo nucleotide e trascritti rari in tessuti complessi come il cervello8.

Questo test visualizza i bersagli simultaneamente come segnali cromogenici distinti verdi (C1) e rossi (C2) in campo chiaro. Garantisce il successo utilizzando tessuti fissati in paraformaldeide al 4% (PFA) o formalina tamponata neutra (NBF) al 10% e sezionati a 5 μm-15 μm (congelato/FFPE), contenenti RNA a bassa o alta abbondanza. A causa della sensibilità alla degradazione dell'RNA, alla sovrafissazione e agli errori della sonda, è necessario ottimizzare il pretrattamento, la progettazione della sonda e i controlli per massimizzare la specificità e ridurre al minimo lo sfondo. Qui, abbiamo applicato questo saggio Duplex ISH per caratterizzare i pattern di espressione di IR-A e IR-B nella CP murina, offrendo nuove intuizioni sulla biologia spaziale delle isoforme IR e sui loro possibili ruoli nella salute e nella malattia del cervello.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con i protocolli approvati dal National Institute on Aging (NIA), che è pienamente accreditato dall'American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). I protocolli sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del Programma di ricerca intramurale della NIA (IRP/NIA). I topi sono stati alloggiati in una struttura a temperatura controllata con un ciclo luce/buio di 12 ore, con accesso ad libitum all'acqua e al cibo standard, se non diversamente specificato. I topi maschi C57BL/6J sono stati ottenuti dal Jackson Laboratory e utilizzati per esperimenti a 3-4 mesi di età.

1. Corretta la preparazione del campione congelato

  1. Perfondere il topo con PFA al 4% appena preparato in 1x PBS e posizionare l'intero cervello in PFA al 4% appena preparato per 17-24 ore a 4 °C.
    NOTA: Tessuto posto in PFA al 4% (10 ml per ciascun cervello) per non più di 24 ore.
  2. Immergere il fazzoletto in saccarosio al 10% (10 mL) in 1x PBS a 4 °C fino a quando il fazzoletto non affonda sul fondo del contenitore. Quindi, trasferire in sequenza il tessuto al 20% di saccarosio e infine al 30% di saccarosio, lasciandolo affondare ad ogni passaggio.
    NOTA: Il tempo necessario affinché il tessuto affondi varia a seconda del tipo e delle dimensioni del tessuto. Per il tessuto cerebrale, ci vogliono circa 18 ore.
  3. Congelare il tessuto in un terreno di inclusione OCT e conservare i blocchi di tessuto in un contenitore ermetico a -80 °C.
  4. Sezionare coronalmente i tessuti cerebrali congelati fissati con formaldeide in fette da 10 μm e conservare a -80 °C fino al momento dell'uso.
    NOTA: Montare le sezioni su vetrini da microscopio caricati positivamente; Altri tipi di vetrini possono causare la perdita di tessuto. Se i vetrini non vengono utilizzati immediatamente, conservarli a -80 °C per un massimo di 3 mesi.

2. Pretrattamento della sezione prima del saggio di rilevazione duplex

  1. Il giorno del test, lavare i vetrini in 1x PBS per 5 minuti, muovendo delicatamente il rack dei vetrini su e giù per rimuovere eventuali residui di OCT.
  2. Infornare gli scivoli a 60 °C per 30 min.
  3. Post-fissare i vetrini in PFA preraffreddato al 4% in 1x PBS per 15 minuti a 4 °C.
  4. Trasferire i vetrini in sequenza attraverso una serie di EtOH: 50% EtOH per 5 min a RT, 70% EtOH per 5 min a RT, 100% EtOH per 5 min a RT, 100% EtOH di nuovo per 5 min a RT.
  5. Scivoli ad asciugatura all'aria per 5 minuti a RT.
  6. Applicare 2-4 gocce di perossido di idrogeno su ogni sezione e incubare per 10 minuti a RT. Sciacquare una volta con acqua distillata.
  7. Preparare 700 mL di soluzione fresca 1x Target Retrieval in un becher. Coprire con un foglio di alluminio e portare a ebollizione omogenea (99-100 °C).
    NOTA: Non far bollire per più di 30 minuti prima dell'uso. Nel frattempo preriscaldate il forno (vedi Tabella Materiali) a 40 °C.
  8. Immergere con cautela il rack per vetrini nella soluzione bollente Target Retrieval e incubare per 5 minuti. Mantenere la temperatura tra 98 e 102 °C e monitorare attentamente.
    NOTA: Potrebbe essere necessario regolare il tempo di ebollizione (5-15 min) a seconda del tipo di tessuto.
  9. Trasferire immediatamente la griglia calda in un piatto con acqua distillata, muovendo la griglia su e giù di 3-5 volte. Ripetere con acqua distillata fresca.
  10. Risciacquare i vetrini in 100% EtOH fresco, muovendoli su e giù 3-5 volte. Asciugare i vetrini all'aria.
  11. Usa una penna barriera idrofobica per disegnare attorno a ciascuna sezione di tessuto 2-3 volte. Lasciare asciugare completamente la barriera a RT.
  12. Posizionare i vetrini nel vassoio per vetrini batch. Aggiungere la proteasi (vedere la Tabella dei materiali) a ciascuna sezione, assicurandosi che il tessuto sia completamente coperto. Incubare in forno a 40 °C per 15 min.
    NOTA: Il tempo di incubazione della proteasi può richiedere un aggiustamento a seconda del tipo di tessuto e del gene bersaglio.
  13. Togliete la teglia dal forno e mettetela in acqua distillata. Lavare delicatamente i vetrini muovendoli su e giù per 2 minuti, ripetendo questo passaggio 2 volte con acqua distillata fresca.

3. Saggio di rilevamento duplex

  1. Sonde
    1. Preparare due sezioni aggiuntive per le sonde di controllo positivo e negativo.
    2. Selezionare le sonde di controllo con lo stesso numero di coppie ZZ della sonda target. Per 1 coppia ZZ, utilizzare un controllo positivo e un controllo negativo (vedere la tabella dei materiali).
    3. Prima dell'uso, equilibrare le sonde a 40 °C per 10 minuti e portare i reagenti AMP1-12 a RT.
  2. Ibridazione a sonda
    1. Far girare brevemente la sonda C2 e miscelarla in rapporto 1:50 con la sonda C1. Aggiungere una quantità sufficiente di sonda (100-200 μl) per coprire completamente ogni sezione e incubare i vetrini in forno a 40 °C per 2 ore. Lavare i vetrini per 2 x 2 minuti in 1x tampone di lavaggio a RT.
    2. Applicazione Duplex AMP1 dell'ambito di base
      1. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dai vetrini e aggiungere AMP1 (100–200 μl) per coprire completamente ogni sezione. Rimettere in forno e incubare a 40 °C per 30 min.
      2. Lavare 2 x 2 minuti in 1x tampone di lavaggio.
    3. Applicazione Base Scope Duplex AMP2
      1. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dai vetrini e aggiungere AMP2 (100-200 μL) per coprire completamente ogni sezione. Rimettere in forno e incubare a 40 °C per 30 min.
      2. Lavare 2 x 2 minuti in 1x tampone di lavaggio.
    4. Applicazione Base Scope Duplex AMP3
      1. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dai vetrini e aggiungere AMP3 (100–200 μL) per coprire completamente ogni sezione. Rimettere in forno e incubare a 40 °C per 15 min.
      2. Lavare 2 x 2 minuti in 1x tampone di lavaggio.
        NOTA: Non superare i 15 minuti di incubazione.
    5. Applicazione Base Scope Duplex AMP4
      1. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dai vetrini e aggiungere AMP4 (100–200 μl) per coprire completamente ogni sezione. Rimettere in forno e incubare a 40 °C per 15 min.
      2. Lavare 2 x 2 minuti in 1x tampone di lavaggio.
    6. Applicazione Base Scope Duplex AMP5
      1. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dai vetrini e aggiungere AMP5 (100-200 μl) per coprire completamente ogni sezione. Rimettere in forno e incubare a 40 °C per 30 min.
      2. Lavare 2 x 2 minuti in 1x tampone di lavaggio.
    7. Applicazione Base Scope Duplex AMP6
      1. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dai vetrini e aggiungere AMP6 (100–200 μL) per coprire completamente ogni sezione. Rimettere in forno e incubare a 40 °C per 15 min.
      2. Lavare 2 x 2 minuti in 1x tampone di lavaggio.
        NOTA: Come per AMP3, non superare i 15 minuti di incubazione.
    8. Applicazione Base Scope Duplex AMP7
      1. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dai vetrini e aggiungere AMP7 (100-200 μL) per coprire completamente ogni sezione e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
        1. Lavare 2 x 2 minuti in 1x tampone di lavaggio.
          NOTA: Incubare con AMP7 a temperatura ambiente (RT) per 30 min.
    9. Applicazione Base Scope Duplex AMP8
      1. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dai vetrini e aggiungere AMP8 (100-200 μL) per coprire completamente ogni sezione e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
      2. Lavare 2 x 2 minuti in 1x tampone di lavaggio.
        NOTA: Incubare con incubazione AMP8 per 15 minuti a RT.
    10. Rilevamento del segnale rosso (C2)
      1. Far girare brevemente il Fast Red-B e mescolare con il Fast Red-A in un rapporto 1:60.
      2. Applicare su ciascuna sezione (100-200 μl), coprire il vassoio e incubare per 10 minuti a RT al buio.
      3. Wash 2x in 1x Wash Buffer.
        NOTA: Utilizzare una soluzione miscelata Fast Red entro 5 minuti. Proteggere dalla luce (luce solare o UV).
    11. Applicazione Base Scope Duplex AMP9
      1. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dai vetrini e aggiungere AMP9 (100–200 μL) per coprire completamente ogni sezione. Rimettere in forno e incubare a 40 °C per 15 min.
      2. Lavare 2 x 2 minuti in 1x tampone di lavaggio.
    12. Applicazione Duplex AMP10 con cannocchiale di base
      1. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dai vetrini e aggiungere AMP10 (100–200 μL) per coprire completamente ogni sezione. Rimettere in forno e incubare a 40 °C per 15 min.
      2. Lavare 2 x 2 minuti in 1x tampone di lavaggio.
    13. Applicazione Duplex AMP11 per cannocchiale di base
      1. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dai vetrini e aggiungere AMP11 (100-200 μL) per coprire completamente ogni sezione. Incubare a RT per 30 min.
      2. Lavare 2 x 2 minuti in 1x tampone di lavaggio.
        NOTA: Incubare con AMP11 a RT per 30 minuti.
    14. Applicazione Base Scope Duplex AMP12
      1. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dai vetrini e aggiungere AMP12 (100–200 μL) per coprire completamente ogni sezione. Incubare a RT per 15 min.
      2. Lavare 2 x 2 minuti in 1x tampone di lavaggio.
        NOTA: Non superare i 15 minuti di incubazione.
    15. Rilevamento del segnale verde (C1)
      1. Far girare brevemente il tubo Fast Green-B e mescolare con Fast Green-A in un rapporto 1:50.
      2. Applicare la soluzione GREEN su ciascuna sezione (100-200 μL), coprire il vassoio e incubare per 10 minuti a RT.
      3. Lavare per 5 minuti in 1x Wash Buffer e risciacquare brevemente in acqua distillata.
        NOTA: Utilizzare la soluzione Fast Green miscelata entro 5 minuti. Proteggere dalla luce. Il rapporto B/A del verde è 1:50. Sia i substrati ROSSI che VERDI sono sensibili all'alcol. Non utilizzare reagenti contenenti alcol.

4. Contromacchia

  1. Immergere i vetrini in una soluzione colorante di ematossilina al 50% per 1 minuto a RT fino a quando le sezioni non appaiono violacee.
  2. Sciacquare con acqua di rubinetto 3-5 volte muovendolo su e giù. Ripeti con acqua fresca del rubinetto fino a quando lo sfondo non si schiarisce ma le sezioni rimangono viola.
  3. Immergere gli scivoli in acqua di ammoniaca allo 0,02% su e giù 3 volte fino a quando le sezioni diventano blu.
  4. Sciacquare nuovamente con acqua di rubinetto 3-5 volte.

5. Montaggio

  1. Asciugare completamente i vetrini in un forno asciutto a 60 °C per ~15 min.
  2. Immergere gli scivoli nello xilene fresco.
    NOTA: Poiché il mezzo di montaggio è piuttosto viscoso, un breve tuffo nello xilene prima del montaggio facilita una distribuzione più fluida del terreno attraverso la sezione del tessuto e riduce la formazione di bolle d'aria sotto il vetrino coprioggetti.
  3. Applicare il mezzo di montaggio (vedere la Tabella dei materiali) sul vetrino e sul vetrino coprioggetti, evitando la formazione di bolle.
  4. Asciugare gli scivoli all'aria per almeno 5 minuti.

6. Valutare i campioni

  1. Immagine delle sezioni con un microscopio a campo chiaro standard con ingrandimento 20x o 40x. (Figura 1).
    NOTA: i controlli positivi dovrebbero mostrare punti punteggiati nelle celle. I controlli negativi sono accettabili se non c'è più di 1 punto ogni 20 celle con un ingrandimento di 20x.

7. Punteggio (opzionale)

  1. Utilizzare software di analisi delle immagini (ad esempio, Halo o QuPath) per quantificare i punti di RNA per cellula.

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Risultati

Il recettore dell'insulina (IR) è un recettore tirosin-chinasico transmembrana composto da due subunità α extracellulari e due β-subunità transmembrana, che formano un eterotetramero funzionale. Le subunità α mediano il legame con l'insulina, mentre le subunità β possiedono un'attività tirosin-chinasica intrinseca che avvia la segnalazione a valle. Lo splicing alternativo dell'mRNA IR dell'esone 11 genera due isoforme dell'IR, IR-A e IR-B. In quanto tale, IR-B include un segmento di 12-am...

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Discussione

All'interno del cervello, l'espressione dei recettori dell'insulina (IR) è eterogenea, con alte densità osservate in regioni come il bulbo olfattivo, l'ipotalamo, l'ippocampo e il plessocoroideo 10. La caratterizzazione completa dei modelli di espressione delle varianti in specifiche regioni cerebrali e tipi di cellule fornirebbe informazioni cruciali, consentendoci di studiare e comprendere i ruoli specifici dell'insulina e della segnalazione IGF-II nella plastic...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dall'Intramural Research Program/National Institute on Aging/National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acqua di ammonioScienza del microscopio elettronico Codice 26754-4A
Kit di reagenti per la rilevazione BaseScope DulplexACD Bio323810
BaseScope Dulplex Duplex Sonda a Controllo Positivo - Mouse (mm)-C1-PPIB-1ZZ/C2-POLR2A-1ZZACD Bio700121
Sonda a controllo positivo duplex BaseScope Dulplex-C1-DAPB-1ZZ/C2-DAPB-1ZZACD Bio700141
Ematossilina I di GillSigma-AldrichGHS132-1L
Anticorpo secondario anti-coniglio di capra IgG (H+L) altamente adsorbito, Alexa Fluor Plus 488InvitrogenCodice: A32731
HybEZ OVEN, teglia, griglia e teglia di lavaggioACD Bio321721, 310012, 321716, 321717
Penna barriera idrofobica ImmEdgeLaboratorio VettorialeH-4000
Sonde INSR isoforma A e B: BA-Mm-Insr-tv1-E10E11, BA-Mm-Insr-tv2-E11E12-C2ACD Bio717411, 717421-C2
Anticorpo del recettore dell'insulinaSegnalazione cellulare 23413
RNAscope 10x Target RetrivalACD Bio322000
RNAscope Perossido di idrogeno, proteasi PlusACD Bio322381
Citrato salino-sodio (SSC) 20xFisher ScientificoBP1325-1
Vetrini SuperFrost PlusFisher Scientifico12-550-18
Supporto di montaggio permanente VectaMountLaboratorio VettorialeH-5000

Riferimenti

  1. Häring, H. U. The insulin receptor: signalling mechanism and contribution to the pathogenesis of insulin resistance. Diabetologia. 34 (12), 848-861 (1991).
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