La neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) porta a tumori benigni della guaina dei nervi periferici (neurofibromi) che richiedono uno specifico microambiente nervoso per la crescita. È stato sviluppato un modello di xenotrapianto ortotopico ottimizzato, utilizzando l'iniezione intraneurale di cellule di Schwann umane in topi NSG. Questo modello ricapitola i neurofibromi umani e fornisce una preziosa piattaforma per valutare le strategie terapeutiche.
Articolo metodologico
Uno xenotrapianto ortotopico di nervo sciatico per neurofibromatosi di tipo 1
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) è una malattia genetica causata da varianti patogene nel gene NF1 , che porta alla perdita della funzione della neurofibromina e allo sviluppo di tumori benigni della guaina dei nervi periferici noti come neurofibromi. Sebbene i modelli murini geneticamente modificati (GEMM) abbiano fatto progredire la nostra comprensione della fisiopatologia di NF1, spesso non riescono a replicare la tumorigenesi spontanea e la complessità microambientale dei neurofibromi derivati dai pazienti. Una sfida chiave nella modellazione dei neurofibromi benigni è la loro dipendenza dal microambiente nervoso, che gli approcci convenzionali agli xenotrapianti non ricapitolano. Qui, è stato sviluppato un modello di xenotrapianto ortotopico ottimizzato per i neurofibromi associati a NF1. Utilizzando l'iniezione intraneurale di cellule di Schwann umane immortalizzate derivate dal neurofibroma nel nervo sciatico di topi immunodeficienti NSG, questo modello ricapitola le caratteristiche chiave della biologia del neurofibroma umano, tra cui la crescita nervo-dipendente e le interazioni con il microambiente tumorale. Questo protocollo consente il monitoraggio dinamico e in tempo reale della progressione tumorale tramite imaging a bioluminescenza, fornendo un metodo riproducibile e quantitativo per valutare la crescita del neurofibroma. A differenza dei GEMM, questo modello consente l'inizio controllato del tumore e la valutazione precisa delle strategie terapeutiche precliniche. Inoltre, funge da ponte tra i GEMM e i modelli di xenotrapianto derivati da pazienti, migliorando la rilevanza traslazionale della ricerca sul neurofibroma. Offrendo un ambiente fisiologicamente rilevante per lo studio delle interazioni tumore-nervo, questo modello fornisce una preziosa piattaforma per lo studio della biologia del neurofibroma e la valutazione di potenziali interventi terapeutici. I futuri perfezionamenti, tra cui l'integrazione di componenti immunitarie o tecniche di imaging avanzate, potrebbero migliorare ulteriormente la sua applicazione alla ricerca sulla NF1.
Introduzione
La neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) è una malattia genetica causata da varianti patogene nel gene NF1 , che porta alla perdita di funzione della neurofibromina, un soppressore tumorale chiave che sottoregola la via di segnalazione RAS-mitogen-activated protein chinasi (MAPK)1. La NF1 è una sindrome da predisposizione al tumore2 con importanti manifestazioni cliniche che coinvolgono il sistema nervoso, la pelle e il sistema scheletrico, colpendo principalmente i tessuti derivati dalla cresta neurale. Un segno distintivo di NF1 è lo sviluppo di tumori benigni dei nervi periferici noti come neurofibromi. Questi tumori sono composti principalmente da cellule di Schwann che ospitano l'inattivazione biallelica di NF1 (NF1-/-)3, insieme ad altri elementi stromali tra cui fibroblasti NF1+/- , cellule perineuriali, cellule immunitarie e componenti della matrice extracellulare4.
I modelli animali sono essenziali per comprendere la fisiopatologia del neurofibroma e per testare le strategie terapeutiche. Topi omozigoti per una mutazione Nf1 knockout (KO) (Nf1-/-) sono morti in utero; I topi Nf1+/− sono vitali, fertili e inclini al cancro, come le loro controparti umane5. Tuttavia, questi animali non sviluppano le caratteristiche distintive della malattia umana NF1: i topi Nf1+/− non hanno manifestato né anomalie della pigmentazione né neurofibromi. Nell'ultimo decennio è stata creata una grande varietà di modelli murini geneticamente modificati (GEMM) per modellare in modo indipendente alcuni dei sintomi, attraverso approcci KO condizionali. Alcuni GEMM sono stati sviluppati per indurre la formazione di neurofibromi inattivando condizionatamente Nf1 nei precursori delle cellule di Schwann 6,7,8.
Sebbene questi GEMM abbiano fatto progredire in modo significativo la nostra comprensione di NF19, la loro complessità fenotipica ed eterogeneità richiedono modelli murini alternativi e complementari per i saggi terapeutici. Gli xenotrapianti ortotopici forniscono una valida alternativa consentendo l'impianto di cellule umane direttamente nella loro nicchia anatomica nativa, offrendo così un modello fisiologicamente più rilevante. Tuttavia, la maggior parte degli studi basati sugli xenotrapianti si è concentrata sui tumori maligni della guaina dei nervi periferici (MPNST)10, probabilmente perché i neurofibromi non si innestano ectopicamente, lasciando così una lacuna nella modellazione dei tumori benigni.
Questo studio descrive un nuovo modello ortotopico di neurofibroma NF1, basato sull'iniezione intraneurale di cellule umane di Schwann immortalizzate derivate dal neurofibroma (hTERT NF1 ipNF04.4 CVCL_UI78 linea cellulare) nel nervo sciatico di topi immunodeficienti NOD SCID gamma (NSG). Questo approccio sfrutta appieno il microambiente nervoso nativo, consentendo la formazione di tumori benigni, consentendo al contempo il monitoraggio dinamico attraverso l'imaging a bioluminescenza (BLI).
Questo protocollo mira a: (1) Stabilire un modello di neurofibroma ortotopico riproducibile per NF1, (2) Fornire una solida piattaforma preclinica per studiare le interazioni tumore-nervo e valutare nuove terapie e (3) Colmare il divario tra i GEMM11,12 e gli xenotrapianti derivati da pazienti (PDX)13 offrendo un sistema sperimentale intermedio e controllato. Questo modello consente uno sviluppo rapido ed economico del tumore, in genere entro 5 giorni dall'iniezione, senza richiedere la generazione di linee di topi transgenici, combinando così l'accessibilità degli xenotrapianti con la rilevanza anatomica del posizionamento ortotopico.
Questo modello murino di xenotrapianto tumorale (CDX) derivato da linee cellulari ortotopiche per neurofibroma offre diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi. A differenza dei GEMM, che si basano su predisposizioni genetiche per guidare la tumorigenesi, questo modello consente un controllo diretto sull'inizio e la progressione del tumore.
Il protocollo di attecchimento ortotopico dei tumori maligni della guaina dei nervi periferici (MPNST)10 è stato adattato ai modelli di neurofibromi benigni. Ciò rappresenta un significativo passo avanti nella ricerca traslazionale sulla NF1, con potenziali applicazioni nell'identificazione di nuovi bersagli terapeutici e nella sperimentazione di strategie di trattamento innovative.
Protocollo
Tutte le procedure sono state esaminate e approvate dal comitato etico dell'Institut Curie CEEA-IC #118 (Autorizzazione #50186 rilasciata dall'Autorità Nazionale) in conformità con le linee guida internazionali e sono state condotte da personale addestrato seguendo le linee guida etiche per la ricerca sugli animali. I topi NOD SCID GAMMA (NSG) (NOD. Cg-Prkdc Il2rg/SzJ) sono stati selezionati per questo studio a causa della loro grave immunodeficienza, che consente il successo dell'attecchimento di cellule umane. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione del modello animale e della linea cellulare
- Eseguire la depilazione nel sito chirurgico utilizzando un rasoio elettrico il giorno prima dell'innesto per semplificare la procedura per grandi coorti di topi NSG.
- Per prevenire la compromissione bilaterale degli arti posteriori, iniettare solo un nervo sciatico (lato sinistro) per topo in tutti gli esperimenti. Monitora i topi per segni di angoscia, perdita di peso e deficit motori.
- Dopo la procedura, lasciare che i topi si riprendano completamente su un termoforo in una gabbia senza lettiera per evitare l'inalazione accidentale del materiale della lettiera. Una volta che i topi sono completamente mobili e non mostrano segni di stordimento, reintrodurli nella struttura per animali.
- Per lo xenotrapianto, utilizzare la linea cellulare NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78), una linea cellulare umana di Schwann immortalizzata con hTERT derivata da un paziente con NF114. Queste cellule sono state trasdotte stabilmente con un costrutto CMV-luciferasi, pLenti CMV Puro LUC (w168-1), consentendo il tracciamento longitudinale tramite BLI utilizzando un sistema di saggio della luciferasi commerciale.
- Mantenere le cellule in DMEM integrato con il 5% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina a 37 °C con il 5% di CO2. Espandere le cellule all'80% di confluenza per mantenere le condizioni di crescita ottimali.
- Il giorno dell'innesto, tripsinizzare le cellule (≤4 min a 37 °C); contarli e risospenderli a 5 × 103 cellule in 4 μL per topo.
2. Procedura chirurgica per xenotrapianto ortotopico
- Preparazione pre-chirurgica
- Preparare la stazione chirurgica prima dell'induzione dell'anestesia disinfettando accuratamente l'area di lavoro. Coprire tutte le superfici di contatto del microscopio operatorio e del sistema di illuminazione con una pellicola trasparente sterile e assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici siano stati precedentemente sterilizzati in autoclave.
- Pretrattare i topi con analgesia preoperatoria con buprenorfina sottocutanea (0,1 mg/kg) 30 minuti prima dell'intervento chirurgico per garantire un'adeguata analgesia iniziale.
- Indurre e mantenere l'anestesia tramite iniezione intraperitoneale di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (15 mg/kg), preparata fresca in soluzione fisiologica sterile e regolata in base al peso corporeo (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Confermare la profondità dell'anestesia con un riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi prima di procedere.
- Mantenere la temperatura corporea utilizzando un termoforo durante l'intera procedura, compresa l'anestesia, l'innesto e il recupero.
- Applicare gocce di lubrificante sugli occhi per prevenire l'essiccazione corneale.
- Procedura di iniezione
- Posiziona il mouse sul lato destro, con le zampe posteriori delicatamente divaricate. Coprire l'area chirurgica con un telo sterile prima di iniziare l'incisione.
- Preparare un campo chirurgico sterile utilizzando lo iodio povidone.
- Incisione e dissezione: praticare una piccola incisione cutanea (~5 mm) parallela al femore utilizzando delle forbici sottili. Separa accuratamente il muscolo sottostante per esporre il nervo sciatico: usa una pinza fine e micro forbici per separare delicatamente gli strati muscolari, facendo attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni. Identificare il nervo sciatico come una struttura bianca, simile a un cordone, situata medialmente al femore.
- Conservare la sospensione cellulare in una provetta da 1,5 ml e sbattere delicatamente per risospendere le cellule depositate. Caricare 4 μl della sospensione cellulare in una siringa Hamilton da 10 μl con un ago da 33 G (che è stato scelto per ridurre al minimo il trauma nervoso mantenendo un'elevata vitalità cellulare).
- Inserire l'ago parallelamente all'asse del nervo sciatico (per evitare la perforazione) a una profondità di ~2 mm. Iniziare lentamente l'iniezione per creare pressione e uno spazio tra il nervo e la guaina periferica. Far avanzare lentamente l'ago per altri 4-5 mm. Quindi iniettare lentamente la sospensione ritirando l'ago dal nervo. Evitare qualsiasi tensione o movimento del nervo.
- Eseguire la procedura senza allungare il nervo sciatico per evitare danni e non utilizzare pinze. Attendere 10-15 secondi prima di ritirare lentamente l'ago per ridurre al minimo il reflusso.
- Dopo l'iniezione, assicurarsi che il nervo sciatico appaia leggermente gonfio nel sito di iniezione, senza perdite o scolorimento. Il successo dell'iniezione è indicato da un aspetto stabile del nervo senza stravaso.
- Chiudere l'incisione chirurgica utilizzando 3 o 4 semplici suture interrotte con materiale non assorbibile (3-0, 30 mm, 3/8 c) per evitare l'infiammazione nel sito chirurgico. Se l'intervento dura più di 10 minuti, somministrare 1 mL di lattato di Ringer (s.c.). Somministrare Meloxicam (5 mg/kg, per via sottocutanea) alla fine della giornata.
- Contrassegna ogni topo per un'identificazione univoca utilizzando un punzone per l'orecchio o un tag subito dopo l'intervento chirurgico e prima del recupero dall'anestesia.
- Consenti ai topi di riprendersi in un ambiente a temperatura controllata e monitora le complicanze post-chirurgiche.
3. Imaging a bioluminescenza per l'attecchimento e il monitoraggio della crescita tumorale
- Per valutare il successo dell'attecchimento e la progressione del tumore, eseguire il BLI in più punti temporali. Per il monitoraggio in vivo , utilizzare un sistema di imaging in vivo per catturare la luce emessa dalla reazione enzimatica tra la luciferasi della lucciola, espressa dalle cellule tumorali, e il suo substrato, la D-luciferina. Questo approccio ha fornito un metodo accurato per visualizzare e quantificare l'attività tumorale, offrendo preziose informazioni sulle dinamiche tumorali nel tempo.
- Quantificare i segnali di bioluminescenza in momenti specifici dopo l'innesto, inclusi i giorni 5, 12, 19, 26, 30 e 33 dopo l'innesto (Figura 1). In genere, è possibile visualizzare cinque mouse contemporaneamente per semplificare il processo e mantenere la coerenza tra le misurazioni.
4. Configurazione dell'imaging
- Anestetizzare i topi con isoflurano al 2% durante l'acquisizione delle immagini e utilizzare un termoforo integrato nell'imager IVIS.
- Posizionare i topi in modo coerente con lo stesso orientamento e visualizzarli 10 minuti dopo l'iniezione intraperitoneale di D-luciferina alla dose di 10 μL/g di peso corporeo (concentrazione di riserva: 15 mg/mL in PBS, appena preparato e filtrato).
- Acquisisci l'immagine durante 1 minuto, utilizzando il software di acquisizione dati, assicurandoti che nessun pixel si saturi durante il processo.
- Misura l'intensità del segnale bioluminescente come numero di fotoni relativi/s. Utilizzare il sistema di imaging con le seguenti impostazioni: Tempo di esposizione: Auto; Binning: Medio; F/Stop: 1,2; Campo visivo: 12,5 cm; Software: Living Image Software v4.7.3.
- Misura l'emissione di luce dalle regioni tumorali, riportata come conteggio relativo dei fotoni al secondo, utilizzando un software proprietario. Visualizza l'intensità della bioluminescenza utilizzando la scala pseudocolore, che viene sovrapposta alle immagini in bianco e nero acquisite contemporaneamente.
5. Criteri per il successo dell'attecchimento
- Escludere i topi se non mostrano bioluminescenza rilevabile o se il segnale diminuisce nel tempo.
- Includi solo i topi con un aumento progressivo della luminescenza tra i giorni 5 e 12.
- Procedere al monitoraggio del tumore utilizzando l'imaging a bioluminescenza come descritto nella sezione Risultati rappresentativi.
Risultati
Utilizzando la procedura sopra descritta, è stato stabilito con successo un modello di tumore ortotopico del nervo sciatico in topi NSG con cellule immortalizzate derivate dal neurofibroma (ipNF04.4). L'imaging a bioluminescenza con D-luciferina ha rivelato una chiara localizzazione del tumore nel nervo sciatico già dal giorno 5, con evidenza di crescita esponenziale nel tempo. L'attecchimento ha avuto successo nel 90% (37/41) dei topi iniettati. La progressione del tumore è stata monitorata nei giorni 5, 12, 19, 26, 30 e 33 (Figura 1A) e non sono stati osservati segnali non specifici durante il periodo di monitoraggio. I topi sono stati soppressi il giorno 33, in conformità con le linee guida istituzionali, al primo segno di angoscia o di eccessivo carico tumorale. Al momento della dissezione, il tumore appariva ben sviluppato e integrato all'interno del nervo sciatico, senza segni di formazione di ascessi (Figura 1B). In particolare, i topi hanno mostrato una deambulazione normale subito dopo il recupero dall'anestesia.
Figura 1: Imaging a bioluminescenza e analisi macroscopica di xenotrapianti di nervo sciatico ortotopico in topi NSG. (A) Imaging a bioluminescenza longitudinale (BLI) di due topi NSG iniettati per via intraneurale con cellule ipNF04.4 nel nervo sciatico sinistro. Le immagini sono state catturate ai giorni 5, 12, 19, 26, 30 e 33 dopo l'iniezione, illustrando la crescita progressiva del tumore nel tempo negli stessi due topi. L'aumento dell'intensità del segnale bioluminescente riflette il successo dell'attecchimento e dell'espansione del tumore all'interno del microambiente nervoso. (B) Vista macroscopica del nervo sciatico al giorno 33 dopo l'innesto, che mostra un tumore ben sviluppato e integrato senza segni di formazione di ascessi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Micrografia fotografica del sito di innesto di questo topo che dimostra la crescita del tumore e l'invasione focale. Sezioni di tessuto incluse in paraffina colorate con ematossilina ed eosina (H&E). Vengono mostrati esempi di tumori tipici di tre topi. Barre della scala: 2000 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Evoluzione rappresentativa del peso corporeo dei topi NSG (n=15) nel corso dell'esperimento di xenotrapianto. Non è stata osservata alcuna perdita di peso significativa. Clicca qui per scaricare questa figura.
Discussione
La riuscita creazione di un modello di xenotrapianto derivato da linee cellulari di neurofibromi ortotopici (CDX) nei topi NSG rappresenta un progresso significativo nella ricerca NF1, affrontando i principali limiti dei modelli esistenti. Il protocollo conferma che le cellule di Schwann umane immortalizzate associate a NF1 (ipNF04.4)14,15,16 possono essere efficacemente innestate nel nervo sciatico di topi immunodeficienti, portando a uno sviluppo tumorale riproducibile all'interno di un microambiente fisiologicamente rilevante. Gli xenotrapianti ortotopici di linee cellulari di Schwann sono stati menzionati negli studi originali che hanno stabilito linee cellulari umane di Schwann14,15 e un protocollo dettagliato è fornito qui.
La chiave del successo di questo protocollo è stata la meticolosa preparazione e il monitoraggio sia dei componenti cellulari che degli animali ospiti. Durante la procedura, l'anestesia è stata gestita con attenzione, assicurando che i topi fossero mantenuti in uno stato di anestesia appropriato senza stress significativo. Per ridurre al minimo qualsiasi danno potenziale, il nervo sciatico non è stato allungato con pinze o pinze ed è stata prestata grande attenzione per evitare stress meccanici sui tessuti. L'uso di BLI a base di luciferasi ha consentito un monitoraggio longitudinale non invasivo della crescita tumorale, fornendo dati quantitativi e riproducibili. Questa strategia di imaging non solo ha confermato la vitalità del trapianto, ma ha anche permesso l'identificazione di deviazioni precoci nella dinamica del tumore. L'assenza di una significativa perdita di peso (Figura supplementare 1), disfunzione motoria o altri segni di disagio nei topi evidenzia la compatibilità di questo protocollo con i principi etici del benessere animale e le 3R (Sostituzione, Riduzione, Perfezionamento).
Rispetto ai GEMM, che si basano sull'inattivazione condizionale di Nf1 6,7,9, questo approccio offre diversi vantaggi distinti. I GEMM richiedono specifiche modificazioni genetiche, ma potrebbero non replicare completamente le complesse interazioni tumore-stroma osservate nei neurofibromi umani 1,17. Questo modello consente lo studio diretto delle cellule di Schwann umane nella loro nicchia nervosa nativa, preservando i fattori estrinseci cellulari4. A differenza dei GEMM, in cui i tumori si sviluppano in modo imprevedibile nel tempo, il modello di xenotrapianto consente un controllo spazio-temporale preciso sulla formazione del tumore. Questo modello fornisce una piattaforma rapida e riproducibile per testare le terapie candidate, con BLI che consente il monitoraggio in tempo reale della progressione del tumore e della risposta al trattamento.
Inoltre, questi risultati sono in linea con studi precedenti sui MPNST, in cui è stato dimostrato che lo xenotrapianto ortotopico migliora la fedeltà dei modelli tumorali5. Tuttavia, i neurofibromi benigni pongono sfide uniche, poiché la loro crescita dipende fortemente da specifiche interazioni nervose, che i metodi convenzionali di innesto sottocutaneo non riescono a ricapitolare6. I risultati confermano che l'iniezione intraneurale fornisce un ambiente ottimale per lo sviluppo prolungato del neurofibroma.
Pertanto, questo modello in vivo può essere considerato un'alternativa complementare rilevante ai GEMM, per i test terapeutici preclinici. Tuttavia, ci sono limitazioni al modello. Le cellule di Schwann umane derivate da neurofibromi sono state immortalizzate e mostrano un fenotipo tumorale che potrebbe essere considerato più aggressivo di quello di un neurofibroma plessiforme, con proliferazione cellulare densa (Figura 2). Non è stata osservata alcuna evidenza di disseminazione a distanza negli animali e non è stata dimostrata una completa trasformazione maligna. Sono necessari ulteriori studi per dimostrare se il fenotipo cellulare possa corrispondere al fenotipo "intermedio" che ricorda il neurofibroma atipico, come le neoplasie neurofibromatose atipiche con potenziale biologico sconosciuto (ANNUBP)18. Un altro limite critico del modello risiede nella sua dipendenza da topi immunodeficienti. L'assenza di un sistema immunitario adattativo nei topi NSG limita lo studio delle interazioni immunitarie-tumorali, che sono sempre più riconosciute come fattori chiave per la biologia del neurofibroma 7,19,20,21. I futuri perfezionamenti potrebbero incorporare modelli murini umanizzati o strategie alternative per catturare meglio gli aspetti immunologici della malattia. Inoltre, la dipendenza dall'espressione della luciferasi per il monitoraggio del tumore, sebbene altamente efficace, può limitare l'applicabilità di questo protocollo a configurazioni sperimentali prive di accesso alle apparecchiature BLI. Sebbene il BLI sia un metodo sensibile e non invasivo, non fornisce informazioni dirette sui cambiamenti istopatologici. Analisi complementari, come la risonanza magnetica o l'istologia avanzata, potrebbero migliorare ulteriormente la caratterizzazione della progressione del neurofibroma.
Diverse fasi procedurali possono richiedere un'ottimizzazione per garantire il successo dell'attecchimento del tumore. La mancata iniezione può derivare da un posizionamento errato dell'ago o da un'eccessiva perdita della sospensione cellulare. Per mitigare questo problema, l'ago deve essere inserito con cura parallelamente al nervo sciatico e ritirato lentamente dopo l'iniezione. La variabilità dei segnali di bioluminescenza può derivare da un dosaggio incoerente della luciferina o da un disallineamento durante l'imaging. Si raccomanda di standardizzare i tempi dell'iniezione post-luciferina (10 minuti) e di mantenere impostazioni di imaging identiche in tutti gli animali. Se la variabilità nella crescita del tumore rimane elevata, confermare la vitalità cellulare prima dell'iniezione e ridurre al minimo lo stress dell'animale durante la manipolazione.
In conclusione, questo studio stabilisce un modello di xenotrapianto di neurofibroma ortotopico nuovo e riproducibile, offrendo un'efficace piattaforma preclinica per lo studio dei tumori benigni associati a NF1. Sfruttando le cellule di Schwann umane nel loro microambiente nervoso naturale, questo modello imita da vicino la biologia del neurofibroma umano, consentendo al contempo il monitoraggio del tumore in tempo reale e interventi terapeutici controllati. Questo modello rappresenta un passo essenziale tra i GEMM e i modelli derivati dai pazienti (PDX), aprendo la strada ad approcci più rilevanti dal punto di vista clinico alla ricerca e al trattamento del neurofibroma.
I futuri perfezionamenti dovrebbero mirare a integrare componenti immunitarie, come i modelli murini umanizzati, per studiare il ruolo del microambiente tumorale6. L'espansione delle modalità di imaging, tra cui la risonanza magnetica o le scansioni PET, potrebbe integrare il BLI con intuizioni strutturali e metaboliche22. L'estensione delle tempistiche sperimentali sarà essenziale per studiare lo sviluppo a lungo termine del neurofibroma e i potenziali rischi di trasformazione maligna. Colmando il divario tra i modelli GEMM e PDX, questa piattaforma migliora la ricerca traslazionale in NF1, offrendo nuove opportunità per l'innovazione terapeutica nei tumori benigni della guaina dei nervi periferici.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Institut national du cancer (Inca_18828). Ringraziamo la piattaforma HistIM (diretta da Maryline Favier) e Pierre Sohier, dell'Institut Cochin.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Buprenorfina | Buprecare | Per analgesia preoperatoria | |
| Tappetini riscaldanti | ANIPHY | VI-653246 | Per mantenere la normotermia durante un intervento chirurgico del topo |
| hTERT NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78) linea cellulare | Materiali biologici applicati | T0194 | Linea cellulare di Schwann umana NF1-null immortalata |
| Isoflurano | Iso-Vet | Per l'anestesia del topo durante l'imaging bioluminescente | |
| IVIS Lumina Serie III | Revvity | Per l'imaging della bioluminescenza | |
| Ketamina | Ketamina 1000 Virbac | Per l'anestesia chirurgica nei topi | |
| Software per immagini viventi | Revvity | Incluso con IVIS | Per acquisizione e quantificazione dell'immagine |
| Sistema di analisi della luciferasi | Promega | E1500 | Per il rilevamento BLI |
| Meloxicam | METACAM | Farmaco antinfiammatorio non steroideo (FANS) | |
| Sutura monofilamento non assorbibile | ETHILON | F2419H | Per suturare l'incisione |
| Ago per siringa | Hamilton | Consuetudine | GA33/12,7mm/PST4-12&Deg; |
| NOD SCID gamma (NSG) topi | Fiume Charles | 614NSG | |
| pLenti CMV Puro LUC (w168-1) | Addgene | 17477 | Per l'espressione della luciferasi delle luciole |
| Povidone iodo e acuto; e dermique 10% | Viatris | 330200775 | Antisettico topico per la disinfezione cutanea |
| Lama del bisturi | FST | 10015-00 | Per incisione cutanea durante l'intervento chirurgico |
| Microscopio Stereo L125 | Leica | Per visualizzare il sito di iniezione cellulare nel nervo sciatico | |
| Siringa 10 & micro; l | Hamilton | 1701RN | Per iniezione cellulare nel nervo sciatico |
| Xilazina | Rompun 2% | Per l'anestesia chirurgica nei topi |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
