Articolo metodologico

Linfodenectomia renale bilaterale murina

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DOI:

10.3791/68695

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30 dicembre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Yale University School of Medicine, 2Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Section of Rheumatology, Yale University, 4Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive una procedura di sopravvivenza per una linfadenectomia renale bilaterale murina sicura e ben tollerata.

Abstract

Le malattie autoimmuni sono il risultato di cellule immunitarie che colpiscono in modo inappropriato il tessuto autonomo, causando patologie e danni agli organi vitali. Gli organi linfoidi secondari fungono da sito per l'attivazione delle cellule B e T e per la tolleranza immunitaria periferica, conseguendo il drenaggio degli antigeni e il traffico delle cellule presentanti antigenici (APC) attraverso linfotici locali. Il ruolo dei linfonodi locali a drenaggio come sito iniziale di attivazione dei linfociti è stato descritto in contesti di tumori, infezioni e malattie autoimmuni specifiche per organi, ma non nell'autoimmunità sistemica. Il lupus eritematoso sistemico, una di queste malattie, è una malattia autoimmune diffusa con un coinvolgimento renale comune che porta a lesioni renali e insufficienza finale. Una ulteriore comprensione del ruolo dei linfonodi renali, che rappresentano il principale sito di drenaggio degli antigeni e traffico di APC dai reni, è limitata dall'incapacità di perturbare selettivamente questo tessuto. Qui è descritta una procedura di sopravvivenza per una linfadenectomia renale bilaterale murina sicura e ben tollerata. Sono incluse istruzioni dettagliate, ausili visivi, consigli utili per migliorare il successo e soluzioni di problemi procedurali. La sopravvivenza a lungo termine è eccellente ed è stata osservata per almeno 4 mesi dopo l'intervento. I linfonodi renali resezionati sono intatti e immediatamente pronti per il trattamento a valle. Questa procedura è particolarmente adatta per studi sull'effetto locale dei linfonodi renali.

Introduzione

Le malattie autoimmuni si estendono a ogni organo del corpo umano, da malattie relativamente limitate agli organi come l'epatite autoimmune, l'uveite e il diabete di tipo 1, fino a malattie diffuse come la sclerosi sistemica e la sindromedi Sjögrens 1,2,3,4,5. La tolleranza immunologica è una fase critica nello sviluppo delle cellule B e T per prevenirel'autoreattività 6. Sebbene la tolleranza centrale tramite delezione clonale nel timo sia necessaria ed efficace, questo da solo lascia lacune nella difesa contro l'autoimmunità 7,8. La tolleranza periferica è una barriera secondaria all'auto-reattività tramite anergia, delezione o esaurimento delle cellule B e T, che avviene negli organi linfoidi secondari, inclusi i linfonodi regionali che drenano i tessuti dopo il drenaggio degli antigeni 9,10. Tuttavia, sta diventando sempre più chiaro che cellule autoreattive possono risiedere all'interno di questi linfonodi e migrare da questi linfonodi in individui geneticamente e/o ambientalmente sensibili a seguito di un'attivazioneinappropriata 11,12.

Il lupus eritematoso sistemico è una di queste malattie autoimmuni, con chiaro coinvolgimento delle cellule B e T in più sistemid'organo 13. Una manifestazione particolarmente comune e morbosa è la nefrite lupica e la progressione verso una malattia renaleterminale 14. La capacità di comprendere l'effetto diretto delle cellule B e T localmente presenti nella malattia renale autoimmune, a differenza della fisiopatologia sistemica circolante, è attualmente limitata dall'incapacità di perturbare selettivamente questi linfonodi. Tenendo conto di questa lacuna, è stata sviluppata una procedura di sopravvivenza per la linfadenectomia renale bilaterale murina, che è descritta qui.

L'obiettivo generale di questo protocollo è ottenere l'escissione sicura e affidabile dei linfonodi renali bilaterali nei topi con alta sopravvivenza e tolleranza post-operatoria. Questa procedura sarebbe più adatta per studi sull'effetto locale dei linfonodi renali sull'innesco, l'attivazione e la tolleranza delle cellule immunitarie associate alla malattia renale. Questa procedura è ideale se abbinata a modelli autoimmuni o oncologici che interessano il rene.

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Protocollo

Tutte le procedure vengono eseguite in conformità con i protocolli del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali di Yale. Per sviluppare questa procedura, sono stati utilizzati 15 tipi di ceppi Balb/c di 8-12 settimane, topi propensi al lupus (MRL/MpJ-Faslpr/J/J) e controlli sham abbinati età/sesso/genotipo15. Inoltre, sono stati testati anche topi selvatici di tipo C57BL/6 di 8-12 settimane e i nodi sono stati resezionati in sicurezza. Sono stati inclusi sia maschi che femmine. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione di strumenti, animali e sala operatoria

  1. Sterilizza tutti gli strumenti chirurgici. Assicurati che la superficie operativa e il cono nasale anestetico siano puliti con il 70% di etanolo.
  2. Installare il microscopio operatorio, garantendo un'ergonomia confortevole per il chirurgo operatorio.
  3. Installa una macchina per vaporizzatori anestetici inalati con un cono nasale e aspirazione per la recuperazione eccessiva di anestetici. Prepara una superficie operativa con un tappeto circolante ad acqua calda per mantenere la temperatura corporea e le forniture dell'animale in un luogo comodo e sterile.
  4. Indurre l'anestesia somministrando isoflurano inalato al 2%-3% con un flusso di ossigeno di 2 L/min tramite il cono nasale da una macchina vaporizzatore anestetica inalata (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
    1. Assicurati un piano di anestesia adeguato confermando una frequenza respiratoria di circa 30-40 respiri al minuto e la mancanza di risposta al pizzicamento del piede posteriore. Controllare periodicamente il piano di anestesia appropriato e regolare di conseguenza la portata dell'isoflurano.
      NOTA: In alternativa, è appropriato anche un anestetico iniettabile.
  5. Segui le linee guida dell'istituto per l'analgesia appropriata e l'anestesia locale. Ad esempio, si può somministrare sottocutaneamente un analgesico a lunga durata come 3,25 mg/kg buprenorfina XR e somministrare fino a 0,04 mL/5 g di peso corporeo di soluzione di lidocaina da 1 mg/mL in zone di incisione pianificate.
  6. Prepara l'animale per la procedura applicando lubrificante per gli occhi, strappando o tagliando il pelo bilateralmente, sterilizzando la schiena con soluzione di povodina/iodio, seguita dal 70% di etanolo, e posizionando il decubito laterale destro (lato destro verso il basso).
    1. Usa del nastro adesivo per fissare il braccio sinistro dell'animale verso l'alto e la coda verso l'inferiore, creando una postura rilassata ma allungata (Figura 1A). Questo sposterà il rene più verso il basso, portando a una migliore visualizzazione ed esposizione.
  7. Indossa guanti sterili e applica tende sterili sull'animale con una finestra sul campo operatorio. Mantieni la sterilità durante tutta la procedura.
    1. OPZIONALE: Iniettare 10-20 μL di Evans Blue sterile e filtrato al 5% in soluzione salina tamponata fosfato nei cuscinetti bilaterali del posteriore del piede prima del posizionamento animale per una migliore identificazione dei linfonodi renali tramite drenaggio lungo il tratto linfaticoiliaco 16 (Figura 1D-G).
      NOTA: Attenzione che questo colorante può interferire con le colorazioni e le analisi citometriche del flusso. Inoltre, col tempo, Evans Blue si infiltrerà anche nella cisterna chyli, vedi "risoluzione dei problemi" per consigli (Tabella 1).

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Figura 1: Posizionamento anatomico del topo e degli organi e iniezione opzionale di Evans Blue. (A) Posizionamento e fissazione degli animali per esposizione renale sinistra. (B) Orientamento anatomico all'interno delle finestre operative. La catena dei linfonodi renali sinistri si trova adiacente ai vasi surrenalici e all'aorta, superiore ai vasi renali. Il linfonodo renale destro si trova appena sopra i vasi renali. (C) Posizionamento e sicurezza degli animali per l'esposizione renale destra. (D-G) Implementazione di iniezione di Evans Blue al 5% da 20 μL. (D) Posteriore del piede sinistro e catena dei linfonodi renali sinistri (freccia bianca) prima della tintura. Nota la posizione generale della cisterna chili (scatola tratteggiata), che spesso è trasparente e/o difficile da identificare a meno che non sia piena di linfa. (E) Retropiede sinistro e catena linfonodica renale sinistra (freccia bianca) 5 minuti dopo l'iniezione del colorante. Si noti i vasi linfatici afferenti (freccia nera). (F) Posteriore destro e linfonodo renale destro (freccia bianca) prima del colorante. G) Retropiede destro e linfonodo renale destro (freccia bianca) 5 minuti dopo l'iniezione del colorante. Si noti i vasi linfatici afferenti (frecce nere). Barre di scala: A,C = 1,0 cm; D-G (vista posteriore) = 0,5 cm; D-G (viste interne) = 0,1 cm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Linfodenectomia renale sinistra

  1. Effettuare un'incisione obliqua di 1 cm attraverso la pelle, appena inferiore alla milza (circa 1 cm sotto la costola finale). Disseziona la pelle in modo diretto lontano dalla parete addominale/toracica e identifica la milza all'interno dell'addome.
    1. Effettuare un'incisione di 1 cm attraverso la muscolatura della parete addominale appena inferiore alla milza per accedere alla cavità peritoneale (Figura 2A,B).
      NOTA: Nei topi con pelle non pigmentata, la milza è facilmente visibile attraverso la pelle preparata come un organo scuro e mobile che risiede lateralmente nell'addome e appena al di sotto della costola finale.
  2. Identifica il rene sinistro come un organo liscio lungo la parete addominale posteriore e appena inferiore alla milza. I reni e i linfonodi renali associati si trovano nel retroperitoneo. Utilizzando due pinze angolate, sezionare in modo diretto la parte posteriore del rene sinistro per accedere al retroperitoneo (Figura 2C).
    NOTA: La tecnica corretta e sicura di dissezione contundente consiste nell'applicare una piccola pressione con forcette chiuse nel piano tissutale desiderato e lasciare che lo strumento si apri delicatamente, separando i piani tissutali.
  3. Riflette il rene sinistro anteromedialmente.
  4. Utilizzando il microscopio dissezionante, identifica il cuscinetto adiposo che avvolge il linfonodo renale sinistro, che sarà a posteriore al rene sinistro e superiore ai vasi renali sinistri. Identificare ed evitare la ghiandola surrenale superiormente, l'aorta posteriormente e il chilo cisternale anteromedialmente (Figura 1B,D).
  5. Utilizzando una pinza a punta fine, sezionare in modo diretto intorno alla capsula linfonodica (separandola dai vasi circostanti), applicando una delicata controtensione con una pinza angolata (Figura 2E). Si possono anche usare forbici a punta fine per sezionare in modo spietante questo piano.
  6. Utilizzando una pinza dritta a punta fine, si ritrae il linfonodo renale sinistro cefalade mentre si usano forbici a punta fine per incidere nettamente gli attacchi posteromediali del linfonodo. Fai attenzione a non disturbare i vasi sanguigni vicini e la cisterna chili/dotto toracico (Figura 2F).
  7. Osserva l'area per l'emostosi (Figura 2G).
  8. Riportare il rene nella sua posizione anatomica e chiudere l'addome in due strati (parete addominale e pelle) con una sutura monofilamento in polipropilene 6-0 in modo continuo. Applica una colla chirurgica sterile sulla ferita.

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Figura 2: Linfodenectomia renale sinistra. (A) Incisione obliqua sinistra appena inferiore e posteriore all'ombra splenica. (B) Identificazione della milza superiormente (linea bianca), surrenale sinistra posteriormente (freccia nera) e rene sinistro inferiormente (linea nera). (C) Un piano nel retroperitoneo viene creato dissezionando bruscamente immediatamente a posteriore al rene (freccia nera). (D) Il linfonodo renale sinistro (frecce bianche) è immediatamente visibile all'interno di una guaina adiposa. (E) Un piano viene creato tra i vasi vicini e il nodo (frecce bianche). (F) Il nodo viene delicatamente ritratto ed estratto bruscamente lungo il piano creato. (G) È confermata l'emostasia, e lo spazio vuoto (frecce sbiadite da (D)) dove in precedenza viveva il linfonodo (freccia bianca) è considerato privo di qualsiasi linfonodo residuo. (H) Il linfonodo sinistro è spesso una catena di più linfonodi (frecce bianche). L'inserimento è una catena linfonodica sinistra ex vivo (1 mm x 3,5 mm). Barre: 0,2 cm. Tick = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Linfodenectomia renale destra

  1. Riposizionare l'animale nel decubito laterale sinistro (lato sinistro verso il basso). Ancora una volta, usa del nastro adesivo per fissare il braccio destro dell'animale verso l'alto e la coda verso l'inferiore per creare una postura rilassata ma allungata. Questo è particolarmente importante a destra, dove il fegato può interrompere l'esposizione (Figura 1C).
  2. Fai un'incisione obliqua di 1 cm attraverso la pelle, appena inferiore alla costola finale (leggermente più alta del lato sinistro). Dissezionare la pelle con delicatezza lontano dalla parete addominale/toracica e eseguire un'incisione di 1 cm attraverso la muscolatura della parete addominale per accedere alla cavità peritoneale (Figura 3A).
  3. Identifica il rene destro come un organo liscio lungo la parete addominale posteriore e appena inferiore al fegato. Potrebbe essere necessario utilizzare un tampone con punta di cotone per ritrarre la cefalade epatica. Utilizzando due pinze angolate, si seziona in modo diretto la parte posteriore del rene destro per accedere al retroperitoneo (Figura 3B,C).
  4. Rifletti il rene destro anteromedialmente.
  5. Utilizzando il microscopio dissezionale, identifica il cuscinetto adiposo che avvolge il linfonodo renale destro, che sarà a posteriore al rene destro e superiore ai vasi renali destro. Identificare ed evitare la ghiandola surrenale superiormente (Figura 1B,D).
  6. Utilizzando una pinza a punta fine o forbici a punta fine, seziona in modo sbrigato intorno alla capsula linfonodicale (separandola dai vasi circostanti), applicando una delicata controtrazione con una pinza angolata (Figura 3E).
  7. Utilizzando forze dritte a punta fine, ritrai il linfonodo renale destro cefalade mentre usi forbici a punta fine per incidere nettamente gli attacchi posteromediali del linfonodo (Figura 3F). Fai attenzione a non disturbare i vasi sanguigni renali, che sono appena inferiori al linfonodo.
  8. Osserva l'area per l'emostosi (Figura 3G).
    NOTA: In generale, il linfonodo renale destro presenta un vaso sanguigno posteriore più grande, che ha maggiori probabilità di sanguinare in caso di prelievo riuscito del linfonodo. Il sanguinamento da questo vaso può essere controllato con una pressione delicata con un tampone con punta di cotone fino al raggiungimento dell'emostasi.
  9. Riportare il rene nella sua posizione anatomica e chiudere l'addome in due strati (parete addominale e pelle) con una sutura monofilamento in polipropilene 6-0 in modo continuo. Applica una colla chirurgica sterile sulla ferita.

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Figura 3: Linfodenectomia renale destra. (A) Incisione obliqua destra appena inferiore e posteriore alla costola finale. (b) Il bordo epatico è identificato superiormente (linea bianca) e il rene sinistro inferiormente (linea nera). La surrenale destra è nascosta dal bordo del fegato. (C) Un piano nel retroperitoneo viene creato dissezionando bruscamente immediatamente a posteriore al rene (freccia nera). (D) Il linfonodo renale destro (frecce bianche) è immediatamente visibile all'interno di una guaina adiposa. (E) Viene quindi creato un piano attorno al nodo (freccia bianca). (F) Il nodo viene delicatamente ritratto ed estratto bruscamente lungo il piano creato. (G) È confermata l'emostasia, e lo spazio vuoto (frecce sbiadite da (D)) dove in precedenza viveva il linfonodo (freccia bianca) è considerato privo di qualsiasi linfonodo residuo. (H) Il linfonodo destro è un singolo linfonodo sferico (freccia bianca). L'inset è un linfonodo ex vivo (2 mm x 1,5 mm). Barre: 0,2 cm. Tick = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Cure post-operatorie

  1. Spostate l'animale in una gabbia pulita, metà sopra e metà su un tappetino di circolazione ad acqua calda con accesso ad libitum a cibo e acqua.
  2. Lascia che l'animale si riprenda dall'anestesia (~10-15 minuti) e monitora attentamente eventuali segni di disagio. Se gli animali non si riprendono rapidamente dall'anestesia con comportamenti appropriati (ad esempio, aumento della frequenza respiratoria, auto-raddrizzazione, camminata, toelettatura), eutanasia umanamente l'animale (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
  3. Quando tutti gli animali si sono ripresi dall'anestesia, restituire le gabbie alla struttura di cura animale con accesso ad libitum ad libitum ad acqua, cibo, biancheria da letto e materiali di arricchimento.
  4. Valuta i topi postoperatoriamente ogni 12 ore per 3 giorni per segni di dolore o disagio (ad esempio, postura curva, diminuzione dell'attività, diminuzione del coinvolgimento, cattiva toelettatura). Eutanasiare umanamente i topi che mostrano segni di disagio.
  5. Se si utilizzano suture permanenti (come il polipropilene monofilamento 6-0), esaminare le incisioni al giorno 10 postoperatorio e rimuovere qualsiasi materiale residuo per la sutura.

5. Gestione dei linfonodi

NOTA: Il linfonodo espulso è immediatamente pronto per entrare nelle pipeline per ulteriori applicazioni a valle.

  1. Quando si apprende per la prima volta questa procedura e l'anatomia, confermare l'escissione dei linfonodi tramite istologia o citometria di flusso utilizzando colorazioni per anticorpi a scelta.
  2. Inserire il tessuto in mezzi di coltura cellulare (ad esempio, DMEM, RPMI) o soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) su ghiaccio per tecniche di cellule vive o in un fissativo (ad esempio, formalina tamponata neutra al 10%, 4% paraformaldeide) per l'istologia programmata.
    NOTA: Un modo rapido, ma meno accurato, per confermare i linfonodi è mettere il campione resezionato nel PBS. In generale, un campione prevalentemente di linfonodi, mentre un campione prevalentemente di tessuto adiposo galleggia; tuttavia, si raccomandano ulteriori test di conferma quando si ottimizza questa procedura.

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Risultati

Questa procedura può essere eseguita in 15-20 minuti per topo. Per confermare l'accuratezza di questa procedura, sono state eseguite linfadenectomie renali bilaterali su cinque cucciolate di 8-12 settimane, di età, sesso e genotipo abbinate. Tutti i topi hanno tollerato bene la procedura con una sopravvivenza perioperatoria del 100%. I campioni essiccati sono stati depositati in PBS su ghiaccio. Tutti i campioni sono subito affondati, confermando un basso contenuto adiposo. Campioni espu...

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Discussione

Qui è descritta una procedura di sopravvivenza per una linfadenectomia renale bilaterale murina sicura e ben tollerata. La principale limitazione di questa procedura è la dimensione relativamente piccola dei linfonodi renali, che richiede un microscopio chirurgico. Senza un microscopio chirurgico, una resezione sicura può essere difficile da raggiungere. Alcuni modelli genetici di topo hanno linfonodi ingranditi, rendendo più facile l'identificazione e l'apprendimento delle tecniche

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Dichiarazioni

R.A.F. è consulente di Glaxo Smith Kline, Plythera Inc. e Ventus Therapeutics. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo J. Alderman, B. Cadugan, E. Hughes-Picard e J. Horrocks per l'assistenza amministrativa, e a C. Hughes per la gestione delle colonie di topi. H.N.B. è un fellow del Yale Surgeon Scientist Training Program, che ha parzialmente finanziato e sostenuto questo progetto. Questo lavoro è stato finanziato anche dall'Howard Hughes Medical Institute (a R.A.F.) e dal American College of Surgeons Resident Research Award (a H.N.B.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Circuito anestesiicoQualsiasiO anestetico iniettabile
Citometro di flusso BD LSRII (o equivalente)BD in BiologiaEquipaggiato con il software FACS Diva
Buprenorfina XRQualsiasiPer l'analgesia
Mezzi per coltura cellulare  Qualsiasi(per le tecniche a cellule vive; cioè DMEM o RPMI)
DAPIBiolegend422801Concentrazione di lavoro: 15 ug/mL
Luci LED a doppio o doppio collo d'ocaQualsiasi
Etanolo (70% in acqua)QualsiasiPer la pulizia
CD45.2 (104) con FITC coniugato anti-mouseBiolegend109806Concentrazione di lavoro: 5 ug/mL
Pinzep: Pinze inclinate con punta fine (x2)RobozRS-5058Materiale: Dumoxel; Schema #5, angolo di 45 gradi; Dimensione della punta 0,1 x 0,06mm
Pinzep: Pinze a punta fineRobozRS-4960Materiale: Dumostar; Modello #1; Dimensione della punta: 0,20 x 0,12mm
Pinzep: Pinze a punta fineRobozRS-4966Materiale: Dumostar, punta Biologie; Schema #3; Dimensione della punta: 0,08 x 0,04mm
LidocainaQualsiasiPer l'analgesia
TopiJaxPer il ceppo C57BL/6, topi selvatici: The Jackson Laboratories #000664
Conduttore a agoRobozRS-6410Portaaghi Castroviejo; Dritto
Microscopio operativoLeicaMZ9.5Microscopio estero a testa funzionante Leica Mz9.5
OPTIONAL: tintura blu EvansSigmaE2129-10GPer il tracciamento linfatico.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Qualsiasi
Soluzione di povidone/iodioQualsiasiPer la preparazione/sterilizzazione della pelle
Forbici: Forbici con punta extra fineRobozRS-5605McPherson-Vannas; filo da taglio da 3mm; curvo
Forbici: Forbici medieRobozRS-5676Noyes; filo da taglio da 13mm; retto
Colla chirurgicaQualsiasiad esempio adesivo tissue 3M Vetbond
Sutura: polipropilene monofilamento blu 6-0Qualsiasi
Fissativo tissutaleQualsiasi(per istologia programmata; cioè 10% formalina neutrale tamponata o 4% paraformaldeide)
Cuscina riscaldante a circolazione di acqua caldaQualsiasi
Topi   I laboratori JacksonPer la ceppa Balb/c, topi propensi al lupus (MRL/MpJ-Fas-lpr/J): #000485

Riferimenti

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