Creazione di rapide oscillazioni dell'ossigeno nell'analisi della crescita microbica di singole cellule utilizzando un dispositivo microfluidico a doppio strato

Sommario

Questo protocollo presenta un metodo per la fabbricazione di un chip microfluidico a doppio strato e l'analisi della crescita microbica in presenza di rapide oscillazioni di ossigeno. Le prestazioni del dispositivo sono state convalidate attraverso il rilevamento dell'ossigeno nei canali dei fluidi e nella coltivazione microbica.

Abstract

L'analisi microbica di singole cellule mediante microfluidica abbinata alla microscopia time-lapse è promettente per lo studio del comportamento di crescita microbica in ambienti confinati con risoluzione spazio-temporale, offrendo informazioni che non possono essere ottenute dalle piattaforme di coltivazione e analisi convenzionali. L'ossigeno svolge un ruolo cruciale nel determinare la crescita microbica. Tuttavia, il controllo temporale nell'ordine dei secondi non è stato implementato nell'analisi microbica utilizzando la microfluidica. Di recente abbiamo sviluppato un chip microfluidico PDMS a doppio strato che consente il controllo temporale dell'ossigeno nell'ordine delle decine di secondi. Il chip comprende uno strato superiore per la gassificazione e uno strato inferiore per la coltivazione e la perfusione dei fluidi. I due strati sono separati da una sottile membrana PDMS intermedia, che consente un rapido scambio di gas tra i due strati. In questo articolo metodologico, spieghiamo la procedura per la fabbricazione, la caratterizzazione e la coltivazione microbica del chip utilizzando il chip. Come risultati rappresentativi, dimostriamo la rapida capacità di commutazione dell'ossigeno in decine di secondi, la coltivazione microbica e l'analisi della crescita risolta nel tempo in condizioni di ossigeno costante e oscillante. Questo protocollo mira ad assistere i ricercatori interessati all'implementazione del controllo temporale dell'ossigeno nella loro configurazione microfluidica.

Introduzione

L'ossigeno è strettamente legato alla crescita microbica e alla fisiologia tra vari fattori ambientali, influenzando in particolare i processi cellulari come la risposta allo stress ossidativo, l'omeostasi del ferro e le infezioni patogene ^1,2,3. Convenzionalmente, la coltivazione microbica è stata condotta in condizioni ambientali o con un controllo minimo a specifici livelli di ossigeno. Negli scenari realistici, invece, gli ambienti di ossigeno spesso non sono costanti in molti casi, ma piuttosto fluttuano nel tempo. Ad esempio, i microbi possono essere esposti a cambiamenti nei livelli di ossigeno in pochi secondi o minuti nei sistemi acquatici mentre si muovono nell'ambiente a causa del movimento dei fluidi e della motilità microbica ^4,5,6. Allo stesso modo, anche i bioreattori industriali creano ambienti di ossigeno disomogenei a causa di una miscelazione inadeguata, che influisce sulla crescita microbica e sulla resa finale ^7,8. Lo studio delle risposte microbiche a tali condizioni dinamiche è fondamentale per comprendere i processi ecologici e migliorare le applicazioni biotecnologiche.

Gli anaerobi facoltativi come l'Escherichia coli (E. coli) possono passare da percorsi aerobici a anaerobici a seconda della disponibilità di ossigeno ^9,10. Sebbene la ricerca precedente abbia esplorato questa adattabilità metabolica, la maggior parte degli studi si concentra su singoli spostamenti di ossigeno utilizzando sistemi di coltivazione convenzionali, che non riescono a replicare i rapidi cambiamenti che i microbi spesso affrontano 9,11,12,13,14. Di conseguenza, c'è una comprensione limitata di come i microbi rispondono fisiologicamente ai frequenti cambiamenti dei livelli di ossigeno.

Come accennato, le configurazioni di laboratorio tradizionali non hanno la precisione e la velocità necessarie per imitare le rapide fluttuazioni dell'ossigeno e non supportano il monitoraggio continuo e ad alta risoluzione. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente sviluppato una piattaforma microfluidica specializzata con un chip di polidimetilsilossano (PDMS) a doppio strato, che consente un rapido controllo dell'ossigeno e l'imaging di singole cellule¹⁵. Qui, forniamo protocolli per la fabbricazione di un chip microfluidico a doppio strato che crea rapide oscillazioni di ossigeno e consente l'analisi della crescita microbica di singole cellule in condizioni di ossigeno controllate. Il chip è composto da due strati: uno strato superiore per la perfusione di gas e uno strato inferiore per la perfusione di fluidi e la coltivazione microbica. La sottile membrana intermedia tra i due strati consente un rapido scambio di gas. A titolo dimostrativo, E. coli MG1655 è stato coltivato nel chip sviluppato. È stata analizzata la crescita in condizioni di ossigeno costante e oscillante.

Protocollo

1. Preparazione dello stampo

1. Prepara uno stampo per lo strato superiore mediante stampa 3D. Fabbricare lo stampo dello strato superiore con una superficie liscia per garantire una superficie liscia dello strato superiore PDMS risultante. Si consiglia l'uso della stampa 3D stereolitografica (SLA).
   1. Progetta lo stampo con il software CAD 3D (Figura 1A). Assicurarsi che il design includa canali del gas che si sovrappongano ai canali del fluido inferiore. Eseguire questo processo di progettazione in parallelo alla progettazione dello strato inferiore (passaggio 1.2.1).
   2. Stampa lo stampo utilizzando la stampa 3D SLA. Rimuovere la resina rimanente dallo stampo stampato e lavarla in un bagno di alcol isopropilico (IPA) per 30 minuti (Figura 1B).
   3. Eseguire la polimerizzazione post-stampa esponendo lo stampo alla luce a 405 nm con durata e temperatura adeguate a seconda del tipo di resina e della geometria.
   4. Lasciare lo stampo in ammollo in IPA in un bagno ad ultrasuoni per 15 minuti per rimuovere la resina non polimerizzata rimasta nello stampo, che altrimenti potrebbe inibire l'indurimento PDMS.
2. Preparare uno stampo per wafer di silicone per lo strato inferiore.
   1. Progetta il chip microfluidico con l'editor di layout CAD (Figura 1C). Assicurarsi che il design includa ingressi, canali del fluido e uscite.
   2. Crea uno stampo per wafer di silicio utilizzando la fotolitografia a due strati, come descritto nel documento precedente (Figura 1D)¹⁶.
      NOTA: I canali sullo strato inferiore hanno le dimensioni di μm e richiedono una fabbricazione precisa, mentre i canali sullo strato superiore hanno le dimensioni di mm. Poiché la stampa 3D SLA offre tempi di fabbricazione più brevi e quindi una prototipazione più rapida, la stampa SLA è stata utilizzata per la fabbricazione di strutture piuttosto grandi per lo stampo dello strato superiore. Lo strato inferiore è stato fabbricato mediante fotolitografia per garantire una fabbricazione precisa. Nel caso in cui anche i canali nello strato superiore siano nell'intervallo di μm e richiedano precisione, prendere in considerazione la fabbricazione di uno stampo utilizzando anche la fotolitografia.

2. Fabbricazione di chip microfluidici a doppio strato PDMS

1. Preparare la soluzione di prepolimerizzazione PDMS mescolando accuratamente la base e l'agente indurente in un rapporto di 10:1. Degassare la miscela in un essiccatore per 1 ora.
2. Pulire lo stampo dello strato superiore con IPA e asciugare con aria compressa.
3. Versare il PDMS nello stampo dello strato superiore, seguito da polimerizzazione termica a 80 °C per 20 minuti (^1a fase di polimerizzazione, Figura 1E). La^1a fase di polimerizzazione consente la pelatura, il taglio e la punzonatura del PDMS mentre non è completamente indurito.
4. Controllare l'appiccicosità del PDMS a mano o con una pinzetta dopo 20 minuti di riscaldamento. Se il PDMS è ancora appiccicoso, regolare il tempo di riscaldamento.
5. Staccare il PDMS dallo stampo dello strato superiore e tagliarlo in pezzi singoli (qui 20 mm x 18 mm). Fori (diametro = 0,75 mm) per gli ingressi del gas (Figura 1F). Pulire la superficie inferiore dello strato superiore risciacquando con alcool isopropilico, asciugando con aria compressa e attaccando il nastro adesivo.
6. Pulire lo stampo dello strato inferiore con IPA e asciugarlo con aria compressa. Fissare lo stampo dello strato inferiore su una centrifuga e versare il PDMS al centro dello stampo. Versare il PDMS vicino al wafer per ridurre le bolle d'aria. Se si riscontrano bolle d'aria dopo aver versato il PDMS, spostarle sul lato esterno utilizzando una pinzetta o aghi puliti.
7. Centrifugare il PDMS sullo stampo dello strato inferiore a 1000 giri/min per 60 s, seguito da polimerizzazione termica a 80 °C per 10 minuti (^1a fase di polimerizzazione, Figura 1G). Controllare l'aderenza del PDMS a mano o con una pinzetta dopo 10 minuti e, se necessario, regolare il tempo di riscaldamento.
8. Posizionare i pezzi PDMS dello strato superiore sullo strato PDMS inferiore sullo stampo e premere con decisione dall'alto per garantire il fissaggio superficiale degli strati superiore e inferiore (Figura 1H).
9. Polimerizzare termicamente completamente il PDMS a 80 °C per almeno 1 ora (2a fase^{di polimerizzazione} ). La seconda fase^{di polimerizzazione} consente la polimerizzazione PDMS finale, in cui gli strati superiore e inferiore sono legati insieme in modo irreversibile (Figura 1H).
10. Tagliare delicatamente lo strato inferiore del PDMS a pezzi. Staccare con cura l'intero chip PDMS dallo stampo (Figura 1H).
    NOTA: Se i chip PDMS sono difficili da staccare dallo stampo, prendere in considerazione un ulteriore trattamento superficiale dello stampo dello strato inferiore, come la silanizzazione e il rivestimento chimico della superficie, per facilitare la procedura di pelatura. Se gli strati superiore e inferiore si staccano durante il distacco, prendi in considerazione la possibilità di ridurre il tempo per la^1a fase di polimerizzazione.
11. Praticare fori (diametro = 0,5 mm) per gli ingressi e le uscite del fluido su entrambe le estremità dei canali del fluido (Figura 1H). Pulire accuratamente la superficie inferiore del chip risciacquando con alcool isopropilico, asciugando con aria compressa e attaccando lo scotch.
12. Incollare il chip con un vetro di copertura di 0,175 mm di spessore dopo aver attivato la superficie mediante ossidazione al plasma (25 s, Figura 1H).
13. Dopo aver posizionato il chip sul substrato di vetro, lavare lo strato superiore con aria pressurizzata per assicurarsi che lo strato inferiore della membrana PDMS sia fissato correttamente al vetro.
14. Riscaldare il truciolo incollato a 80 °C per 10 s - 1 min per aumentare la stabilità dell'adesione.
    NOTA: La suddetta fase di polimerizzazione PDMS e il tempo di polimerizzazione richiesto possono essere influenzati da vari parametri, come lo spessore dello stampo, l'attrezzatura e le condizioni ambientali. Pertanto, regolare il tempo di polimerizzazione di conseguenza nel caso in cui il protocollo suggerito non sia adatto all'applicazione.

3. Configurazione sperimentale

NOTA: Come configurazione sperimentale standard viene utilizzato un microscopio invertito dotato di una fotocamera CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor), una telecamera FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) (dominio della frequenza) e un incubatore a temperatura. Alla telecamera FLIM è collegata una sorgente laser a eccitazione modulata (445 nm, 100 mW). Per il controllo del gas vengono utilizzati tre regolatori di flusso di massa (azoto, ossigeno e anidride carbonica). Le pompe a siringa sono utilizzate per la perfusione media.

1. Preparare i tubi per la perfusione di gas (ingresso) e fluido (ingresso e uscita). Accendere l'incubatrice per raggiungere la temperatura desiderata prima dell'esperimento (qui 37 °C).
2. Selezionare l'obiettivo desiderato (in questo caso, 20x per il rilevamento dell'ossigeno e 100x per l'osservazione microbica) e, se necessario, aggiungere olio da immersione. Fissare il chip a doppio strato su un portachip con adesivi.

4. Controllo e rilevamento dell'ossigeno su chip

1. Preparare una soluzione colorante sensibile all'ossigeno con una concentrazione appropriata (qui, 3 mM tris(2,2'-bipiridil)diclororutenio(II)esaidrato, RTDP).
2. Calibrare la termocamera FLIM utilizzando un vetrino di riferimento con una durata nota (qui 3,75 ns). Misura l'intensità del segnale con la fotocamera FLIM e regola il tempo di esposizione o l'apertura del microscopio per ottenere un'intensità del segnale di 0,68 - 0,72 per una migliore calibrazione.
3. Fissare il portatrucioli sul tavolino del microscopio. Collegare i tubi appropriati all'ingresso e all'uscita del fluido. Iniziare a perfondere la soluzione colorante sensibile all'ossigeno a una portata costante utilizzando una pompa a siringa (in questo caso 100 nL/min).
4. Collegare l'ingresso del gas e i regolatori di flusso di massa con un tubo appropriato. Iniziare il lavaggio del gas con concentrazione di ossigeno controllata (qui 0% o 21% di ossigeno, portata massica totale 600 mL/min).
5. Misurare la durata della fase in assenza di ossigeno (τ₀) e ad un'altra concentrazione nota di ossigeno (qui al 21%). Calcolare la costante di quenching (K_q) utilizzando l'equazione di Stern-Volmer come segue, che descrive il quenching di fluorescenza in presenza di ossigeno. In alternativa, si può utilizzare l'intensità di fluorescenza (I); Tuttavia, la misurazione basata sull'intensità può essere influenzata dalle variazioni dell'intensità della sorgente luminosa, dallo sbiancamento delle foto e così via.
   
   NOTA: Si consiglia di attendere alcuni minuti dopo l'avvio del lavaggio del gas per garantire una calibrazione accurata, in particolare quando si mirano a livelli di esaurimento dell'ossigeno fino allo 0%. Per una maggiore precisione, è consigliabile integrare il processo con metodi di esaurimento dell'ossigeno aggiuntivi, come l'utilizzo di scavenger di ossigeno o una configurazione aggiuntiva della camera sigillata.
6. Misura la durata della fase e calcola la corrispondente concentrazione di ossigeno utilizzando l'equazione di Stern-Volmer. Per creare condizioni di ossigeno oscillanti, utilizzare qualsiasi sistema di controllo dello strumento per automatizzare la regolazione delle portate volumetriche di azoto e ossigeno.

5. Preparazione della coltura batterica

1. . Iniziare una precoltura inoculando un organismo desiderato (qui, E. coli MG1655, singola perlina pronta all'uso da una fiala criogenica per fiaschetta) in un terreno desiderato (qui, terreno LB composto da 10 g/L di peptone, 5 g/L di estratto di lievito e 10 g/L di NaCl) e incubare durante la notte (qui, 37 °C a 150 giri/min).
2. Misurare la densità ottica risultante utilizzando un fotometro a 600 nm (OD₆₀₀).
3. Iniziare la coltura successiva in terreno LB inoculando la precoltura (qui OD iniziale₆₀₀ = 0,3 o 0,0001). Incubare la coltura fino a raggiungere la fase di crescita esponenziale.
   NOTA: Se il terreno per la coltivazione su chip è diverso dal primo terreno di precoltura, è consigliabile eseguire una seconda precoltura con il terreno per la coltivazione su chip per consentire agli organismi di familiarizzare con un nuovo terreno¹⁶.
4. Preparare una soluzione di semina diluendo la coltura a una densità ottica appropriata. Trasferire la soluzione di semina in una siringa da 1 ml per il passaggio successivo. Per E. coli, la densità ottica (OD₆₀₀) della soluzione di semina era di circa 0,5.

6. Coltivazione microbica su chip e imaging time-lapse in condizioni di ossigeno controllato

1. Fissare il portatrucioli sul tavolino del microscopio. Lasciare riscaldare il supporto del chip e il chip PDMS nell'incubatore (qui 37 °C) per diverse ore, in quanto ciò ridurrà il rischio di sfocatura durante l'imaging time-lapse a causa dello spostamento associato alla temperatura.
2. Prima di iniziare la coltivazione, iniziare a gassare con la concentrazione iniziale di ossigeno desiderata regolando la percentuale volumetrica di flusso di massa di ossigeno e azoto mantenendo costanti la portata totale e la portata di anidride carbonica.
3. Collegare l'ingresso del gas del chip e i regolatori di flusso di massa.
4. Seminare l'organismo nel chip collegando la siringa con la soluzione di semina all'uscita del fluido e spingendo manualmente la siringa. Controlla al microscopio se le cellule sono intrappolate con successo nelle camere di coltivazione.
5. Dopo l'inoculazione delle cellule, rimuovere la siringa e collegare un'altra siringa con il terreno fresco all'ingresso del fluido. Spingere manualmente la siringa per lavare le cellule rimanenti nel canale di alimentazione del mezzo.
6. Iniziare a perfondere il fluido a una portata costante (qui 100 nL/min) con la pompa a siringa. Garantire una portata sufficiente, poiché una portata inadeguata può causare l'essiccazione della camera. La portata sufficiente può variare a seconda di diversi fattori, tra cui la geometria del canale del fluido e la portata del gas nel canale dello strato superiore.
7. Avvia l'acquisizione dell'immagine in time-lapse. Per la coltivazione in condizioni di ossigeno oscillante, avviare il controllo automatico dei regolatori di flusso di massa contemporaneamente all'avvio dell'acquisizione dell'immagine. In caso di ritardo nell'avvio del controllo del gas e nell'acquisizione dell'immagine, tenere conto del ritardo per la successiva analisi dei dati dell'immagine.

7. Analisi dei dati delle immagini

1. Salva l'immagine time-lapse come una pila di immagini per posizione.
2. Pre-elabora l'immagine per ruotare, allineare e ritagliare la colonia coltivata utilizzando i programmi di analisi delle immagini. Esempi di file . Le immagini TIF sono disponibili qui: https://doi.org/10.5281/zenodo.13982747¹⁵
3. Segmenta le celle ed estrai i valori pertinenti, come il numero di cellule, la lunghezza, l'area, l'intensità della fluorescenza e così via. Analizza ulteriormente i comportamenti di crescita. Esempi di script Python sono disponibili qui: https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-2025¹⁵

Risultati

Fabbricazione di chip a doppio strato PDMS
Il chip a doppio strato fabbricato è raffigurato nella Figura 2A, con canali del gas colorati (rosso) e canali del fluido (blu) per la visualizzazione. Il chip ha tre canali del fluido identici e canali del gas sovrapposti per consentire esperimenti paralleli. Il canale del fluido ha un'area di coltivazione con una serie di camere di coltivazione (Figura 2A(i)). Le cellule vengono intrappolate all'interno delle camere di coltivazione e lasciate crescere in un formato monostrato, che consente l'imaging time-lapse ad alta risoluzione con un'elevata velocità di acquisizione delle immagini. La sezione trasversale del chip illustra uno strato superiore di 3 mm di spessore e uno strato inferiore di 65 μm, che consente una rapida diffusione del gas dal canale del gas al canale del fluido attraverso la membrana PDMS intermedia (Figura 2A (ii-ii')).

Controllo dell'ossigeno su chip
La capacità di scambio gassoso del chip sviluppato è stata testata utilizzando FLIM e il colorante¹⁵ sensibile all'ossigeno. Come mostrato nella Figura 2B, la concentrazione di ossigeno nel canale del fluido ha mostrato una corrispondente diminuzione o aumento entro decine di secondi quando la concentrazione di ossigeno è stata spostata tra il 21% e lo 0%. Questi risultati della misurazione dell'ossigeno dimostrano che la rapida oscillazione dell'ossigeno in decine di secondi può essere replicata nel chip microfluidico a doppio strato sviluppato.

Coltivazione microbica in condizioni di ossigeno costante
Il chip è stato impiegato per la prima volta per caratterizzare la crescita facoltativa di E. coli anaerobi in condizioni gassose costanti con varie concentrazioni di ossigeno. L'anidride carbonica è sempre stata aggiunta al gas di alimentazione poiché abbiamo osservato una crescita limitata di E. coli in condizioni di esaurimento dell'anidride carbonica negli esperimenti preliminari (dati non mostrati). La Figura 3A e la Figura 3B illustrano immagini rappresentative a contrasto di fase di E. coli in condizioni aerobiche (21% di ossigeno) e anaerobiche (0% di ossigeno), rispettivamente. Dopo 3 ore di coltivazione, E. coli coltivato in condizioni aerobiche ha portato a colonie più grandi rispetto alle condizioni anaerobiche. L'analisi quantitativa mostra anche diversi tassi di aumento delle dimensioni della colonia (colonia A) a seconda della disponibilità di ossigeno, come mostrato nelle curve di crescita nella Figura 3C. Si noti che una_colonia è normalizzata in base all'area iniziale per consentire il confronto tra diverse colonie e condizioni. Il tasso di crescita esponenziale μ può essere determinato dalla curva di crescita come segue e riassunto nella Figura 3D.

I risultati convalidano la capacità del dispositivo di controllare l'ossigeno alle concentrazioni mirate e di analizzare efficacemente la crescita microbica corrispondente dalle immagini time-lapse acquisite.

Coltivazione microbica in condizioni di ossigeno oscillante
Infine, E. coli è stato coltivato in condizioni di ossigeno oscillante, passando dalla fase di gassificazione aerobica a quella anaerobica con un intervallo di commutazione T'. Sono stati esaminati vari T' tra 60 minuti e 1 minuto per testare la capacità di analisi della crescita risolta nel tempo in correlazione alle condizioni di ossigeno oscillante. La Figura 4 mostra la crescita quantificata di E. coli in condizioni di ossigeno oscillante con T' = 60, 30, 10, 5, 2 e 1 min. Oltre alla curva di crescita basata sulla _colonia A, anche il tasso di crescita istantaneo μ_Δt è determinato per acquisire informazioni risolte nel tempo come segue.

I tassi di crescita in condizioni aerobiche e anaerobiche costanti sono mostrati anche con linee tratteggiate (μ_21%, μ_0%) nella Figura 4 come riferimenti di crescita. La crescita di E. coli ha presentato dinamiche distinte in risposta a condizioni gassose oscillanti. Ad esempio, dopo che la fase di gassificazione è stata commutata da condizioni aerobiche ad anaerobiche (T' = 60 min), la crescita ha mostrato (i) fase di risposta: improvvisa diminuzione del tasso di crescita, seguita da (ii) fase di recupero: aumento graduale del tasso di crescita, e (iii) fase di stabilizzazione: stabilizzazione della crescita intorno al μ_0%. Le dinamiche di crescita di E. coli sono state risolte temporalmente con successo in vari T' di appena 1 minuto, dove E. coli ha mostrato un tasso di crescita monotono su e giù a causa del tempo limitato per adattare la crescita alle mutevoli condizioni gassose. Inoltre, il comportamento di crescita può essere analizzato non solo a livello di colonia, ma anche a livello di singola cellula. La Figura 5 illustra lo sviluppo dell'area di una singola cellula sotto oscillazioni di ossigeno a vari intervalli di commutazione T'. La crescita di una singola cellula può essere dedotta seguendo i grafici vicini, senza tracciare l'analisi. Il comportamento di crescita a livello di singola cellula assomiglia a quello osservato a livello di colonia nella Figura 4; un aumento più rapido dell'area durante la fase di gassificazione aerobica e un chiaro cambiamento della velocità di crescita all'evento di commutazione del gas. I risultati dimostrano la capacità di coltivare microbi in condizioni gassose oscillanti e di analizzare la crescita microbica in correlazione con la disponibilità di ossigeno in modo risolto nel tempo.

Figura 1: Procedura di fabbricazione del chip a doppio strato. La procedura inizia con la progettazione dello stampo (A, C), la fabbricazione dello stampo (B, D), lo stampaggio PDMS (E-G) e l'assemblaggio del chip (H). Questa cifra è stata modificata da¹⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Chip a doppio strato fabbricato e la sua capacità di controllo dell'ossigeno. (A) Viene presentata l'immagine rappresentativa del chip fabbricato, con canali del gas colorati (rosso) e canali del fluido (blu) per la visualizzazione. L'immagine SEM è mostrata in (i), raffigurante una serie di camere di coltivazione collegate a canali del fluido su entrambi i lati (barra di scala 100 μm). La sezione trasversale del chip è mostrata in (ii-ii'), raffigurante lo strato superiore di 3 mm di spessore e lo strato inferiore di 65 μm di spessore. (B) La concentrazione di ossigeno misurata nel canale del fluido dopo il passaggio tra le condizioni aerobiche (21% di ossigeno) e anaerobiche (0% di ossigeno). Questa cifra è stata modificata da¹⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Coltivazione di E. coli in condizioni di ossigeno costante. (A) Le cellule vengono coltivate aerobicamente (apporto di ossigeno al 21%) per 3 ore e le immagini time-lapse vengono acquisite utilizzando la microscopia a contrasto di fase. (B) Le cellule vengono coltivate in modo anaerobico (0% di apporto di ossigeno) e vengono acquisite immagini time-lapse per 3 ore. (C) La crescita cellulare in varie condizioni di ossigeno costante viene tracciata sulla base della _colonia A. (D) Il tasso di crescita esponenziale è calcolato e riassunto. Tutte le barre della scala = 5 μm. I dati sono espressi come media ± S.D. n = 35 colonie (0%), 27 (0,1%), 21 (0,5%), 16 (1%), 13 (5%), 13 (10%), 29 (21%). Questa cifra è stata modificata da¹⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Coltivazione di E. coli in condizioni di ossigeno oscillante. Viene esaminata la crescita cellulare in varie condizioni di ossigeno oscillante (T', intervallo di commutazione tra condizioni aerobiche e anaerobiche). La crescita cellulare basata sulla _colonia A viene tracciata nel tempo (in alto) e μ_Δt viene tracciato nel tempo per consentire l'interpretazione dei dati risolta nel tempo (in basso). I dati sono espressi come media ± S.D. n = 5 colonie (60 min), 3 (30 min), 4 (10 min), 4 (5 min), 4 (2 min), 5 (1 min). Questa cifra è stata modificata da¹⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Area di una singola cellula (una _{singola cellula} ) di E. coli coltivata in condizioni di ossigeno oscillante. I dati provengono da una colonia rappresentativa di ciascun intervallo di commutazione T'. Questa cifra è stata modificata da¹⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo per la fabbricazione e il funzionamento di un sistema microfluidico a doppio strato è stato fornito per osservare la crescita microbica in condizioni di ossigeno rapidamente oscillanti con un'elevata risoluzione spazio-temporale. Abbinata all'imaging time-lapse, questa piattaforma consente la coltivazione su chip e il monitoraggio in tempo reale dei microrganismi in condizioni di ossigeno controllate, consentendo l'analisi della crescita microbica in correlazione alla disponibilità di ossigeno.

In questo protocollo, gli strati superiore e inferiore vengono preparati separatamente e quindi assemblati in un unico chip. Questo concetto modulare consente vari design di chip semplicemente sostituendo le configurazioni a due strati. Per gli stampi dello strato superiore e inferiore sono stati utilizzati diversi metodi di fabbricazione - stampa 3D SLA per la parte superiore e fotolitografia per la parte inferiore - in base ai rispettivi requisiti di dimensioni e precisione. Questo approccio migliora l'efficienza complessiva del processo di fabbricazione. L'assemblaggio dei due strati avviene attraverso un processo di polimerizzazione PDMS in due fasi. È essenziale ottimizzare il tempo di riscaldamento per la prima fase di polimerizzazione in base al progetto, poiché lo spessore dello stampo e le condizioni di riscaldamento locale possono influire sui risultati di polimerizzazione PDMS.

Sfruttiamo la natura del PDMS altamente permeabile all'aria per ottenere una rapida commutazione dell'ossigeno. D'altra parte, la precisione del controllo dell'ossigeno può anche essere influenzata dalla diffusione passiva dell'ossigeno attraverso il PDMS, in particolare a livelli di ossigeno più bassi. Per compensare questa limitazione, è possibile aggiungere ulteriori miglioramenti al protocollo. Ad esempio, il metodo di calibrazione per il sensore di ossigeno presenta opportunità di miglioramento. Nel protocollo dimostrato, il sensore viene calibrato a due punti di riferimento, 0% e 21% di ossigeno, utilizzando il chip PDMS a doppio strato. Di conseguenza, la precisione del rilevamento dell'ossigeno si basa sulla capacità di creare condizioni accurate di esaurimento dell'ossigeno per la calibrazione. Come indicato nel protocollo, si consiglia di attendere alcuni minuti dopo l'avvio del lavaggio del gas per garantire una calibrazione accurata, in particolare quando si mirano a livelli di esaurimento dell'ossigeno fino allo 0%. Tuttavia, questo compito è impegnativo a causa di potenziali perdite o ritenzione d'aria nel chip PDMS permeabile all'aria. L'accuratezza della calibrazione può essere ulteriormente migliorata utilizzando sostanze chimiche che eliminano l'ossigeno o racchiudendo il chip in una camera ermeticamente sigillata e impoverita di gas^17,18. Questi integratori potrebbero consentire un'analisi più robusta e precisa del comportamento microbico in condizioni strettamente anaerobiche e a basso contenuto di ossigeno.

Il dispositivo dimostrato sarebbe di interesse per vari campi di ricerca. Ad esempio, sarebbe utile per replicare le condizioni di ossigeno nei bioreattori industriali, dove si presume che la disponibilità di ossigeno sia spazio-temporalmente disomogenea 7,8,19,20. L'utilizzo del chip a doppio strato consente ai ricercatori di caratterizzare e comprendere il comportamento microbico in ambienti di ossigeno a rapida fluttuazione, cosa che non era possibile nelle configurazioni di coltivazione convenzionali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Clewin 5	Software WieWeb, Paesi Bassi	N/A	Editor di layout
Fotocamera CMOS	Nikon, Giappone	DS-Qi2
vetro di copertura	Schott AG, Germania	D263 Bio	39,5 mm x 34,5 mm x 0,175 mm
Pulitore al plasma femto	Diener Electronics, Germania	-	Incollaggio al plasma di chip
Modulo 3B	Formlabs, Stati Uniti	-	Stampante 3D
Riferimento a vita	Starna Scientific, Regno Unito	UMM-SFG
Regolatore di portata massica	Vö gtlin Instruments GmbH, Svizzera	GSC-A9SA-BB22	di azoto, di ossigeno
Regolatore di portata massica	Vö gtlin Instruments GmbH, Svizzera	GSC-A9SA-BB21	diossido di carbonio
Modello v3 resina	Formlabs, Stati Uniti	RS-F2-DMBE-03	Resina per stampa 3D
NaCl	Carl Roth, Germania	3957.1	Componente medio LB
Nikon Eclipse Ti-E 2	Nikon, Giappone	-	Microscopio invertito
Fotocamera PCO.FLIM	PCO AG, Germania	-
pco.flim laser	Omicron-Laserprodukte GmbH, Germania	-
Peptone	Carl Roth, Germania	8986.1	Componente medio LB
Piano Apo λ	Nikon, Giappone	-	100x olio, 20x
Polidimetilsilossano (PDMS)	Dow Chemical Company, Stati Uniti	Kit elastomero siliconico Sylgard 184
Strumento di punzonatura, Φ 0,50 millimetri	World Precision Instruments, Stati Uniti	504528
Strumento di punzonatura, Φ 0,75 millimetri	World Precision Instruments, Stati Uniti	504529
Fiala criogenica ROTI Store	Carl Roth, Germania	-
Solidworks 2016 edizione x64	Dassault Systems, Francia	N/A	CAD 3D
Spin coater per substrati	APT Automation, Germania	SPIN150i	Rivestimento di filatura PDMS
Pompa a siringa	CETONI, Germania	neMESYS
Incubatore a temperatura	Okolab, Italia	-	Attrezzature per microscopi
tris(2,2'-bipiridil)diclororutenio(II)esaidrato, (RTDP)	Acros Organics, Belgio	208750010
Tubatura	Saint-Gobain, Francia	Tygon F-4040-A	Tubo di ingresso del gas
Tubatura	Saint-Gobain, Francia	Tygon AAD04103	Tubi per fluidi
Estratto di lievito	Carl Roth, Germania	2363.3	Componente medio LB