Method Article

Tecnologia di selezione delle cellule tumorali circolanti ad alto rendimento e sequenziamento di singole cellule basata sulla microfluidica

DOI:

10.3791/68708

⸱

November 14th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Institute of Molecular Medicine, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono fondamentali per lo studio della progressione e delle metastasi del cancro. Questo articolo presenta un protocollo integrato ad alta produttività per l'arricchimento di CTC e il sequenziamento di CTC singolo, migliorando l'efficienza di cattura e la purezza delle CTC riducendo al contempo i costi di contaminazione e sequenziamento, facendo progredire la ricerca oncologica di precisione e le applicazioni cliniche.

Abstract

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Le cellule tumorali circolanti (CTC) fungono da promettente biomarcatore per il monitoraggio delle metastasi, della progressione e della recidiva del cancro. Le tecniche di biopsia liquida incentrate sul rilevamento delle CTC hanno dimostrato un notevole potenziale grazie alla loro natura non invasiva e alla capacità di fornire un monitoraggio in tempo reale della dinamica del tumore. Tuttavia, le analisi convenzionali delle CTC di massa non riescono a catturare l'eterogeneità intrinseca tra le popolazioni di CTC, oscurando le intuizioni cruciali sulla biologia dei tumori. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) consente la caratterizzazione ad alta risoluzione dell'eterogeneità delle CTC, offrendo nuove opportunità per l'oncologia di precisione e gli studi meccanicistici della progressione tumorale. Nonostante questi vantaggi, le metodologie esistenti per il sequenziamento di CTC singolo tendono a soffrire di inefficienze, tra cui bassi tassi di recupero, flussi di lavoro ad alta intensità di manodopera e rischi di contaminazione associati a più fasi di manipolazione manuale. Per risolvere questi limiti, presentiamo un protocollo microfluidico integrato che consolida l'arricchimento, la purificazione e il sequenziamento di singole cellule CTC in un flusso di lavoro unificato. Il metodo impiega la cattura magnetica controllata dinamicamente all'interno di un chip strutturato a spina di pesce, dove la miscelazione a vortice e il legame cumulativo di biglie immunomagnetiche consentono un isolamento CTC robusto e ad alto rendimento con danni cellulari minimi. La successiva purificazione utilizzando un chip microfluidico rivestito di anticorpi leucocitari rimuove efficacemente le cellule non bersaglio, migliorando ulteriormente la purezza delle CTC attraverso la selezione negativa. Infine, un chip di sequenziamento a singola cellula ad alta precisione, progettato sulla base di principi di resistenza al flusso differenziale, facilita l'efficiente cattura e l'accoppiamento di singole cellule con microsfere con codice a barre univoco. Questa nuova piattaforma supera i limiti dei metodi basati sulla distribuzione di Poisson, migliorando l'utilizzo della CTC e riducendo al minimo il consumo di microsfere e i costi di sequenziamento. Il nostro protocollo integrato migliora significativamente l'efficienza di cattura delle CTC, la purezza e la produttività del sequenziamento di singole cellule, rendendolo adatto per applicazioni cliniche e ricerca oncologica su larga scala. Consentendo un'analisi più precisa e scalabile dell'eterogeneità delle CTC, questo metodo ha il potenziale per perfezionare la diagnosi precoce del cancro, il monitoraggio del trattamento e gli studi meccanicistici delle metastasi, facendo progredire in ultima analisi il campo dell'oncologia di precisione.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metastasi tumorale è un processo complesso e multifase che inizia con la disseminazione e poi va incontro a dormienza e colonizzazione da parte delle cellule tumorali all'interno del tumore primario. Queste cellule invadono progressivamente attraverso la membrana basale nei tessuti più profondi e successivamente intravadono i vasi sanguigni o linfatici. Una volta in circolazione, queste cellule diventano cellule tumorali circolanti (CTC), che possono viaggiare verso organi distanti1. L'emergere delle CTC è un passo critico nella cascata metastatica, in quanto fungono da semi per le metastasi a distanza1. Negli ultimi anni, la tecnologia della biopsia liquida basata su CTC ha attirato una notevole attenzione grazie ai suoi meriti, tra cui la natura non invasiva e conveniente della procedura, nonché la capacità di monitoraggio dinamico in tempo reale. Questa tecnologia facilita una valutazione precisa, in tempo reale e completa della biologia del tumore, offrendo vantaggi unici nel monitoraggio dell'efficacia del trattamento, nella previsione delle recidive e nella guida della terapia 2,3,4. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che le CTC sono presenti nel sangue periferico anche durante gli stadi a basso carico tumorale, come il cancro precoce, le metastasi precoci o la recidiva 5,6. Di conseguenza, la biopsia liquida CTC supera i limiti delle biopsie tissutali tradizionali, che sono limitate ai tumori solidi rilevabili con imaging7. Fornisce una nuova prospettiva e un supporto tecnologico per la diagnosi precoce del cancro, il monitoraggio delle recidive e delle metastasi, la guida al trattamento, nonché il chiarimento dei meccanismi di inizio, progressione e metastasi del tumore. Ad esempio, è stato dimostrato che il numero di CTC nel sangue periferico funge da predittore indipendente sia della sopravvivenza libera da progressione che della sopravvivenza globale nei pazienti oncologici, con conteggi CTC più elevati che indicano una prognosi peggiore8. Anche i cambiamenti dinamici nel numero di CTC sono strettamente associati alla progressione della malattia e al carico tumorale dopo il trattamento 9,10.

Studi recenti hanno evidenziato le tecnologie basate sulla microfluidica come strumenti trasformativi per l'isolamento delle CTC. Queste tecnologie possono essere ampiamente classificate in approcci basati sulla fisica e sulla biologia, ognuno dei quali offre vantaggi distinti pur affrontando sfide specifiche. I metodi basati sulla fisica si basano su differenze di dimensioni e deformabilità per separare i CTC, consentendo uno smistamento senza etichette con un'elevata produttività. Tuttavia, questa strategia di separazione non specifica può compromettere sia l'efficienza di cattura che la purezza a causa dell'intrinseca eterogeneità delle CTC. Ad esempio, Lu et al. hanno riportato un chip microfluidico che integrava un design di separazione del fuoco e riduzione della velocità con array di trappole, che ha superato la maggior parte delle tecniche convenzionali basate sulla fisica in termini di arricchimento e purificazione CTC11. Tuttavia, il chip ha raggiunto solo una deplezione di 3-4 log dei globuli bianchi (WBC), che rimane insufficiente per le applicazioni cliniche. D'altra parte, le strategie di isolamento delle CTC basate sull'immunoaffinità offrono in genere un tasso di recupero e una purezza delle cellule bersaglio più elevate. Tuttavia, l'interazione di legame tra le molecole di cattura e le CTC spesso limita la produttività di tali approcci12,13. Di conseguenza, un metodo di isolamento che bilanci sia l'elevata efficienza di arricchimento che la produttività è essenziale per elaborare efficacemente campioni clinici con popolazioni di CTC rare.

Inoltre, la sostanziale eterogeneità tra le CTC rappresenta una sfida significativa per le analisi a valle 10,14,15, poiché le analisi convenzionali di CTC di massa spesso oscurano le singole distinzioni cellulari. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) facilita la caratterizzazione completa a livello molecolare dell'eterogeneità dell'espressione genica delle CTC, fornendo informazioni sulla classificazione, lo stato e la funzione delle CTC. Questa tecnologia offre nuovi approcci per l'oncologia di precisione e facilita la ricerca sui meccanismi di inizio, progressione e metastasi del tumore16. Ad esempio, Fan et al. hanno costruito un atlante trascrittomico a CTC singolo da vari siti vascolari in pazienti con carcinoma epatocellulare, rivelando l'eterogeneità spaziale tra le CTC e identificando mediatori chiave dell'evasione immunitaria17. Contemporaneamente, Miyamoto et al. hanno identificato mutazioni geniche del recettore degli androgeni e varianti di splicing nelle CTC di pazienti con cancro alla prostata, chiarendo così i meccanismi alla base della resistenza ai farmaci18.

Tuttavia, lo sviluppo del sequenziamento trascrittomico single-CTC sta progredendo lentamente. Le metodologie esistenti soffrono di carenze nell'automazione e nell'integrazione, con conseguente bassa efficienza di recupero CTC, procedure complesse e bassi tassi di successo sperimentale19. Ad esempio, i protocolli attuali richiedono un processo sequenziale che coinvolge l'arricchimento delle CTC, la purificazione, l'isolamento di singole cellule e l'amplificazione degli acidi nucleici. Queste fasi vengono eseguite in provette da centrifuga separate, richiedendo più fasi di pipettaggio e trasferimento. Le procedure ad alta intensità di lavoro non solo riducono l'efficienza, ma aumentano anche il rischio di perdita e contaminazione da CTC20. Gli approcci convenzionali, come il prelievo cellulare basato su capillari, limitano ulteriormente la produttività e l'efficienza analitica durante l'isolamento di singole cellule21. Inoltre, i metodi tradizionali sono anche limitati dalla distribuzione di Poisson, che è un fenomeno statistico che descrive l'incapsulamento casuale delle cellule. Ciò si traduce in un'elevata percentuale di goccioline vuote o di più celle per gocciolina, limitando così l'efficienza di cattura. Per affrontare queste sfide, i ricercatori hanno sviluppato chip microfluidici integrati per l'analisi trascrittomica CTC su singola cellula. Queste piattaforme consolidano più passaggi in un flusso di lavoro a chip singolo, riducendo i rischi di contaminazione e migliorando l'efficienza analitica. Ad esempio, Euisik Yoon et al. hanno sviluppato il metodo Hydro-Seq, che impiega la selezione delle dimensioni basata sulla fluidodinamica per isolare le CTC in microcamere e accoppiare in modo efficiente le singole CTC con microsfere con codice a barre univoco22. Tuttavia, questo metodo si basa sulla separazione CTC basata sulle dimensioni, che spesso si traduce in una bassa purezza CTC e in una produttività limitata (10 μL/min), che lo rende inadatto per l'elaborazione di campioni clinici di grandi volumi. Pertanto, vi è un urgente bisogno di sviluppare un sistema di analisi CTC a singola cellula integrato, ad alto rendimento, a basso volume e resistente alla contaminazione.

In questo articolo, descriviamo un protocollo efficiente e ad alto rendimento per l'arricchimento di CTC e il sequenziamento di singole cellule, che comprende tre componenti principali: smistamento e purificazione di CTC e un chip di sequenziamento di singole cellule (Figura 1). Il chip microfluidico di smistamento CTC è progettato in base al principio delle forze di cattura magnetiche regolate dinamicamente (Figura 2A). Consente l'arricchimento di CTC ad alto rendimento attraverso la miscelazione a vortice all'interno della struttura a spina di pesce, nonché la cattura cumulativa da parte di sfere immunomagnetiche. Il rilascio non distruttivo di CTC viene successivamente ottenuto attraverso una precisa modulazione del campo magnetico. Viene quindi impiegato un chip di purificazione, in cui vengono utilizzati microcanali rivestiti di anticorpi leucocitari per la selezione negativa, producendo CTC altamente purificate (Figura 2B). Infine, è stata impiegata una piattaforma di manipolazione a singola cellula ad alta efficienza basata sulla resistenza al flusso differenziale, superando con successo i limiti della distribuzione di Poisson e consentendo un efficiente accoppiamento e cattura di microsfere a singola cellula/codificate (Figura 3A). Migliora significativamente l'utilizzo del CTC, riducendo al contempo il consumo di microsfere e i costi di sequenziamento.

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Figura 1: Schema della tecnologia di smistamento CTC e sequenziamento a singola cellula basata sulla microfluidica. Questo flusso di lavoro illustra il processo mediante il quale le cellule tumorali si staccano dalle lesioni tumorali, entrano nel flusso sanguigno e formano CTC. I campioni di sangue periferico o di leucopak contenenti CTC vengono elaborati in sequenza attraverso i chip di cattura, purificazione e scRNA-seq delle CTC, consentendo in ultima analisi il sequenziamento trascrittomico e l'analisi bioinformatica delle CTC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

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1. Metodo 1: isolamento CTC basato su microfluidica

  1. Fabbricazione di chip a spina di pesce (HB-chip)
    1. Preparazione dello stampo master
      1. Preparare una cialda di silicone pulita e cuocerla a 135 °C per una notte per rimuovere l'umidità. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, trattare il wafer con un pulitore al plasma di ossigeno a 150 W per 1 minuto per attivare la superficie.
      2. Modellare il primo strato del chip per formare una matrice di pilastri di supporto (28 colonne × 7 righe, numerate da #1 a #28 lungo la direzione del flusso) utilizzando il fotoresist SU-8. Impostare la centrifuga in modo che funzioni in sequenza a 500 giri/min per 10 s, 2350 giri/min per 55 s e 500 giri/min per 10 s. Assicurarsi che l'altezza di questo strato sia di 50 μm.
      3. Cuocere il primo strato a 65 °C per 1 minuto, seguito da 95 °C per 20 minuti per far evaporare il solvente. Raffreddare a temperatura ambiente.
      4. Esporre il primo strato utilizzando una fotomaschera con il design del pilastro di supporto corrispondente. Impostare la dose di esposizione a 130 mJ/cm2.
      5. Eseguire la cottura post-esposizione a 65 °C per 1 minuto, seguita da 95 °C per 6 minuti.
      6. Dopo il raffreddamento, erogare lo sviluppatore SU-8 sulla superficie del wafer per rimuovere il fotoresist non reticolato e ottenere lo strato inferiore. Lasciare riposare per 30 s, quindi risciacquare con acqua deionizzata.
      7. Centrifugare il secondo strato di SU-8 sopra il primo strato utilizzando gli stessi parametri di centrifuga del passaggio 1.1.1.2. Modellare il secondo strato per formare strutture a spina di pesce con un angolo di 45° rispetto alla parete del canale, con una larghezza della scanalatura di 100 μm, un passo di 200 μm e sei creste per ciclo. Assicurarsi che anche l'altezza di questo strato sia di 50 μm.
        NOTA: Nella Figura 1 supplementare è stato fornito un diagramma schematico che illustra tutte le dimensioni rilevanti delle caratteristiche della microstruttura (compresa la matrice di pilastri di supporto e le scanalature a spina di pesce).
      8. Cuocere il primo strato a 65 °C per 1 minuto, seguito da 95 °C per 20 minuti per far evaporare il solvente. Raffreddare a temperatura ambiente.
      9. Esporre il secondo strato utilizzando una fotomaschera con il disegno a spina di pesce. Impostare la dose di esposizione a 130 mJ/cm2.
      10. Eseguire la cottura post-esposizione a 65 °C per 1 minuto, seguita da 95 °C per 6 minuti.
      11. Dopo il raffreddamento, utilizzare lo sviluppatore SU-8 per rimuovere le regioni non reticolate e rivelare la microstruttura completa a due strati.
    2. Preparazione della replica PDMS
      1. Formulare la miscela PDMS combinando il prepolimero e il reticolante con un rapporto in peso di 10:1. Preparare 10-15 ml di miscela per una singola patatina.
      2. Versare il composto nello stampo master ed eliminare l'aria intrappolata mediante degasaggio. Polimerizzare il PDMS mettendo lo stampo in forno a 95 °C per 30 min.
      3. Rimuovere la replica PDMS polimerizzata dallo stampo. Creare un ingresso e un'uscita utilizzando un perforatore PDMS di 1 mm di diametro.
    3. Assemblaggio del chip HB
      1. Impostare il pulitore al plasma a ossigeno su una potenza di 150 W per 3 minuti. Attivare le superfici trattando sia la replica PDMS che lo strato PDMS pre-incollato su un vetrino pulito.
        NOTA: A causa dell'abbondanza di legami Si-O nelle catene polimeriche PDMS, l'attivazione al plasma consente il legame covalente tra PDMS e substrati come vetro, silicio, facilitando così la sigillatura dei chip.
      2. Allineare le strutture PDMS trattate e legarle saldamente tra loro. Verificare che l'array di pilastri di supporto e le caratteristiche a spina di pesce siano completamente integrate con il substrato di vetro per finalizzare il chip HB.
  2. Preparazione di biglie immunomagnetiche (IMB)
    1. Incubare 25 μL di perle magnetiche modificate con streptavidina (SA-MB) lavate e risospese (1 μm) (≈4 × 10,8 perle per mL) con 1 μg di anticorpo biotinilato EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule) a temperatura ambiente con rotazione a 20 giri/min per 40 minuti per preparare gli IMB.
    2. Dopo la separazione magnetica su un rack magnetico, rimuovere il surnatante e risospendere le perle in 25 μl di tampone di isolamento (1% BSA, 2 mM EDTA, D-PBS).
  3. Funzionamento con chip di isolamento
    1. Pipettare 20 μl di sospensione di microsfere magnetiche entro 1-2 s, assicurandosi che non vengano introdotte bolle d'aria.
    2. Posiziona immediatamente il chip verticalmente su un magnete e lascia che le perline si depositino per 5 minuti senza disturbare.
    3. Raccogliere il campione di sangue (sangue periferico o campioni sperimentali di leucopac) e aspirare immediatamente 4 ml in una siringa, assicurandosi che le bolle d'aria vengano rimosse. Sigillare l'ingresso e l'uscita del truciolo con del liquido per eliminare le bolle d'aria. Inserire i tubi di ingresso e uscita del campione nel chip.
      NOTA: Assicurarsi che siano in atto misure di protezione personale di base durante la manipolazione di campioni biologici.
    4. Iniettare il campione con una pompa a siringa con una portata di 1,5 mL/h.
    5. Dopo il caricamento del campione, iniettare 60 μL di D-PBS nel chip HB a una velocità di flusso di 0,2 mL/h per lavare via le cellule non legate.
    6. Rimuovere il magnete e iniettare manualmente 1,5 ml di BSA (5% p/v in D-PBS) per lavare il chip e rilasciare le cellule tumorali catturate dal chip HB.

2. Metodo 2: Purificazione CTC basata su microfluidica

  1. Modifica del chip HB
    1. Preparare una soluzione di (3-mercaptopropil) trimetossisilano (MPTS) in etanolo con una frazione di volume (v/v) del 10%. Introdurre immediatamente 20 μL di soluzione MPTS nel chip HB e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
    2. Sciacquare una volta con etanolo anidro e asciugare a 100 °C per 1 ora.
    3. Preparare una soluzione di estere N-γ-maleimidobutirril-ossisuccinimide (GMBS) in etanolo a una concentrazione di 0,5 mg/mL. Raffreddare il chip a 37 °C, introdurre la soluzione GMBS e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
      NOTA: Quando si utilizzano MPTS e GMBS, indossare sempre guanti, camice da laboratorio e maschera. Questi reagenti possiedono proprietà tossiche e irritanti per le mucose e devono essere maneggiati con cura in un'area ben ventilata.
    4. Risciacquare due volte con ddH2O, quindi due risciacqui con D-PBS.
    5. Aggiungere immediatamente 15 μg/mL di streptavidina (SA), incubare a temperatura ambiente per 1 ora o per una notte a 4 °C.
    6. Risciacquare due volte con D-PBS.
    7. Preparare il tampone anticorpale CD45: 0,2% (p/v) di BSA e 20 μg/mL di anticorpo CD45 biotinilato, diluito a volume con D-PBS.
    8. Iniettare 20 μl del tampone anticorpale CD45 nel chip HB per la selezione negativa dei globuli bianchi. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora, quindi risciacquare con D-PBS.
    9. Aggiungere una soluzione bloccante contenente il 3% (p/v) di BSA e lo 0,05% (p/v) di Tween-20, incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Risciacquare con D-PBS prima di caricare il campione.
  2. Caricamento del campione
    1. Aspirare il campione utilizzando una siringa, assicurandosi che le bolle d'aria vengano rimosse. Sigillare l'ingresso e l'uscita del truciolo con del liquido per eliminare le bolle d'aria. Inserire i tubi di ingresso e uscita del campione nel chip.
    2. Iniettare il campione con una pompa a siringa e impostare la portata su 0,6 mL/h.
    3. Raccogliere le cellule tumorali purificate dall'uscita per il conteggio e il sequenziamento di singole cellule.

3. Metodo 3: tecnologia di codifica a barre e sequenziamento a cellula singola basata su micropozzetti

  1. Preparazione dei reagenti e dei materiali
    1. Pretrattamento trucioli
      1. Aggiungere 200 μl di 1x D-PBS e soluzione F-68 allo 0,5% all'ingresso del chip.
      2. Eseguire la sonicazione a bagno d'acqua tenendo premuto il chip. Quando le bolle sono visibili in tutta la regione microporosa, continuare la sonicazione per 30 s per rimuovere le bolle dai doppi pozzetti.
    2. Preparazione delle perle con codice a barre
      1. Miscelare accuratamente la soluzione madre di microsfere magnetiche con codice a barre e trasferire 200 μl in una provetta da centrifuga. Applicare la separazione magnetica fino a quando la soluzione non si chiarifica ed eliminare il surnatante.
      2. Lavare due volte le microsfere con codice a barre con 500 μL di TE-TW (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,01% Tween-20).
      3. Lavare e risospendere le microsfere con codice a barre in 200 μL di soluzione 20x TE (10 mM di Tris-HCl pH = 7,5, 1 mM EDTA) e 50 mM di DTT, quindi metterle su ghiaccio.
    3. Preparazione della sospensione a cellula singola
      1. Trasferire le cellule tumorali purificate in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e centrifugare a 400 × g per 3 minuti a temperatura ambiente. Lavare e risospendere il pellet in 1 mL di 1x D-PBS.
      2. Eseguire il conteggio delle cellule e preparare la sospensione a cellula singola di conseguenza. Il volume di caricamento del campione deve essere di 200 μl, per un totale di 80.000 celle (400 cellule/μl).
    4. Preparare il tampone di lisi cellulare, che include 1x citrato di sodio salino (SSC), 0,5 M LiCl, 0,6% Triton X-100, 10 mM EDTA, 5 mM DTT e 1 U/μL di inibitore della RNasi.
  2. Funzionamento del chip microfluidico
    1. Acquisizione di celle
      1. Iniettare 200 μl della sospensione di cellule tumorali nel chip (60000 pozzetti doppi), quindi agitare a 10 giri/min su un agitatore decolorante per 5 minuti per consentire alle cellule di depositarsi nei pozzetti di cattura per gravità.
      2. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare nel chip su e giù due volte. Quindi, posizionare il chip su uno shaker decolorante a 10 giri/min per 5 minuti per risospendere le cellule non catturate e lasciarle depositare di nuovo.
      3. Aggiungere 200 μl di 1x D-PBS e 0,5% di soluzione F-68 attraverso l'ingresso e aspirare la soluzione dall'uscita. Ripetere due volte per un totale di tre lavaggi della patatina.
    2. Acquisizione del cordone con codice a barre
      1. Risospendere la sospensione a cordone con codice a barre, quindi iniettare immediatamente 200 μl di sospensione nel chip attraverso l'ingresso. Agitare a 10 giri/min per 20 s.
      2. Pipettare delicatamente la sospensione del tallone due volte, quindi agitare a 10 giri/min per 20 s. Ripetere questo passaggio una volta.
      3. Estrarre la sospensione di microsfere con codice a barre dall'uscita, aggiungere 200 μl di soluzione 20x TE (pH = 7,5) e 50 mM di DTT, quindi prelevare il liquido dall'uscita. Ripetere questo passaggio due volte, per un totale di tre lavaggi.
    3. Lisi cellulare e cattura dell'mRNA
      1. Aggiungere lentamente 200 μl del tampone di lisi cellulare al chip attraverso l'ingresso. Subito dopo, aggiungere lentamente 200 μL di olio minerale per sigillare i pozzetti doppi.
        NOTA: La sigillatura deve avvenire immediatamente per evitare contaminazioni.
      2. Rimuovere la soluzione che fuoriesce dall'uscita del truciolo nel serbatoio di scarico. Posizionare la patatina orizzontalmente e lasciarla riposare a temperatura ambiente per 5 minuti.
    4. Recupero perline con codice a barre
      1. Dopo la lisi, aggiungere lentamente 200 μl di SSC 6x attraverso l'ingresso, rimuovere il liquido di scarto e aspirare la soluzione rimanente dall'uscita del truciolo.
      2. Aggiungere lentamente 200 μl di SSC 6x per riempire il chip. Tieni un magnete vicino alla superficie del chip e spostalo lentamente dall'ingresso all'uscita per raccogliere le perline con codice a barre dai pozzetti di cattura. Quindi, aspirare rapidamente la soluzione e le perle con codice a barre dal chip in una provetta da centrifuga precaricata con 6x SSC.
      3. Lavare tre volte con 200 μl di SSC 6x, seguite da una volta con 1x tampone RT (vedere la tabella dei materiali).
  3. Trascrizione inversa (RT), trattamento con esonucleasi I e PCR
    1. RT
      1. Risospendere le microsfere con codice a barre in 100 μL di miscela di reazione di trascrizione inversa, contenente 1× tampone RT, 1 mM GTP, 1 mM dNTP, 5% PEG 8000, 2,5 μM Template Switch Oligo (vedere la Tabella dei materiali), 1 U/μL inibitore della RNasi e 10 U/μL di trascrittasi inversa. Incubare la soluzione a 42 °C per 120 min.
    2. Trattamento con esonucleasi
      1. Dopo la trascrizione inversa, lavare le microsfere una volta con 200 μL di 1x TE-SDS (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,5% SDS), una volta con 200 μL di 1x TE-TW e una volta con 200 μL di 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Risospendere le perle in 100 μL di miscela di esonucleasi, contenente 1 tampone esonucleasi I e 1 U/μL di esonucleasi I, e incubare a 37 °C per 45 minuti.
    3. Sintesi del secondo filone
      1. Lavare le perle una volta con 200 μL di 1x TE-SDS. Risospendere le microsfere in 200 μL di NaOH 0,1 M e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente con rotazione a 30 giri/min per denaturare il prodotto ibrido mRNA-cDNA. Quindi lavare le perle una volta con 200 μL di 1x TE-TW e una volta con 200 μL di 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Risospendere le perle in 100 μL della miscela di reazione, contenente 1x tampone RT, 1 mM dNTP, 5% PEG 8000, 0,5 μM di primer di sintesi del secondo filamento (vedi Tabella dei materiali) e 0,125 U/μL di frammento di Klenow. Incubare la soluzione a 37 °C per 60 min.
    4. Amplificazione del cDNA
      1. Lavare le perle una volta con 200 μL di 1x TE-SDS, una volta con 200 μL di 1x TE-TW e una volta con 200 μL di 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Risospendere le perle in 150 μL di miscela per PCR, inclusa 1x PCR Reaction Mix e 0,8 μM di oligo ISPCR (vedere la tabella dei materiali). Impostare il programma PCR come segue: 95 °C per 3 min; quattro cicli di 98 °C per 20 s, 65 °C per 30 s e 72 °C per 3 min; otto cicli di 98 °C per 20 s, 67 °C per 20 s e 72 °C per 3 min; 72 °C per 5 min.
      3. Purificare il prodotto PCR due volte con biglie magnetiche 0,6x di immobilizzazione reversibile in fase solida (SPRI) per la purificazione del DNA secondo le istruzioni del produttore ed eluire in 20,5 μl di H2O. Misurare la concentrazione del prodotto PCR purificato utilizzando un saggio di quantificazione del DNA basato sulla fluorescenza.
      4. Eseguire una seconda amplificazione del prodotto PCR purificato utilizzando una miscela PCR contenente 1x miscela di reazione PCR e 0,8 μM di oligo ISPCR (vedere la Tabella dei materiali). Impostare il programma PCR come segue: 98 °C per 3 min; cinque cicli di 98 °C per 20 s, 67 °C per 20 s e 72 °C per 3 min; 72 °C per 5 min.
      5. Purificare due volte il prodotto PCR con microsfere magnetiche SPRI 0,6x per la purificazione del DNA secondo le istruzioni del produttore ed eluire in 20,5 μL di H2O. Misurare la concentrazione del prodotto PCR purificato utilizzando un saggio di quantificazione del DNA basato sulla fluorescenza23.
    5. Costruzione di librerie di cDNA
      1. Costruire la libreria con un kit standard per la preparazione della libreria del DNA (vedere la Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
      2. Amplificare la libreria mediante PCR utilizzando la coppia di primer N70X / P5 (vedi Tabella supplementare). Impostare il programma PCR come segue: 72 °C per 3 min; 98 °C per 30 s; dodici cicli di 98 °C per 15 s, 58 °C per 30 s e 72 °C per 3 min; 72 °C per 5 min.
      3. Purificare la libreria con microsfere magnetiche SPRI 0,6x per la purificazione del DNA secondo le istruzioni del produttore ed eluire in 20 μL di H2O. Misurare la concentrazione del prodotto PCR purificato utilizzando un saggio di quantificazione del DNA basato sulla fluorescenza.
        NOTA: Generalmente, una concentrazione finale della libreria di DNA di ≥ 2 ng/μL e una quantità totale di ≥ 50 ng è considerata accettabile24.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'assemblaggio e il rilascio dell'interfaccia di cattura CTC possono essere valutati mediante microscopia. Una distribuzione uniforme delle perle magnetiche (MB) nella parte inferiore del chip HB sotto un campo magnetico indica l'avvenuto assemblaggio, mentre gli MB residui minimi o assenti confermano il corretto rilascio (Figura 2C). Questo passaggio è fondamentale per determinare la resa e la purezza delle CTC catturate. Per convalidare l'efficienza di cattura del chip di isolamento CTC, abbiamo eseguito un esperimento di spike-in. Un piccolo numero di cellule tumorali con alta espressione di EpCAM (PC3 o LNCaP) sono state inserite in PBS contenenti un'ampia popolazione di cellule Jurkat, che mostrano una bassa espressione di EpCAM, simulando la presenza di abbondanti cellule del sangue in circolazione. Il chip di isolamento CTC ha catturato in modo efficiente le cellule tumorali da campioni da 1 mL e 10 mL, dimostrando la sua elevata produttività e l'efficiente capacità di smistamento CTC (Figura 2D). Per valutare la specificità della cattura basata su IMB, abbiamo utilizzato un chip di controllo modificato con SA-MB privo di coniugazione anticorpale EpCAM. L'assenza di una significativa cattura delle cellule tumorali ha confermato la specificità dell'isolamento delle CTC mediato da IMB (Figura 2D).

Oltre all'efficienza di cattura, la purezza è un altro parametro critico per la valutazione delle piattaforme di isolamento CTC. Abbiamo confrontato la purezza delle cellule tumorali isolate utilizzando il chip di cattura o il chip di purificazione da solo, nonché la purezza ottenuta attraverso la selezione sequenziale positiva e negativa (Figura 2E). Entrambi i chip hanno migliorato significativamente la purezza delle cellule tumorali rispetto al gruppo di controllo, dimostrando la loro efficacia nell'isolare le CTC. Ancora più importante, l'uso combinato della selezione positiva e negativa ha ulteriormente migliorato la purezza e la resa delle cellule tumorali rispetto all'utilizzo di un singolo metodo.

Per valutare ulteriormente le prestazioni dei chip di cattura e smistamento CTC in ambito clinico, abbiamo raccolto campioni di sangue periferico (PB) da sei donatori sani e condotto esperimenti di spiking. Data l'abbondanza estremamente bassa di CTC nei campioni clinici, circa 500-1000 cellule LNCaP sono state addizionate in ogni 10 mL di campione di PB. La conta leucocitaria in tutti i campioni di PB raccolti rientrava nell'intervallo normale (4-10 × 106 cellule/mL). I risultati hanno dimostrato che il sistema di smistamento CTC ha mantenuto un'elevata efficienza di cattura e purezza delle cellule tumorali, anche durante l'elaborazione di campioni clinici (Figura 2F-G e Figura 2 supplementare).

figure-results-1
Figura 2: Piattaforma di cattura e purificazione CTC strutturata a spina di pesce. (A) Flusso di lavoro del chip di isolamento CTC. Innanzitutto, un campo magnetico stabile e IMB coniugati con anticorpi EpCAM assemblano l'interfaccia di acquisizione. Successivamente, la miscelazione a vortice all'interno del chip HB migliora l'efficienza del trasferimento di massa tra CTC e IMB, facilitando la cattura accumulata. Infine, il rilascio delicato delle CTC si ottiene rimuovendo il campo magnetico. (B) Flusso di lavoro del chip di purificazione CTC. Il chip HB viene modificato con anticorpi a selezione negativa e la miscelazione a vortice facilita ulteriormente le interazioni leucociti-anticorpi, producendo infine CTC altamente purificate. Barra graduata, 100 μm. (C) L'imaging microscopico dimostra il successo dell'assemblaggio e del rilascio del chip di cattura. (D) I grafici a barre confrontano l'efficienza di cattura CTC della piattaforma di isolamento su diversi volumi di campioni, utilizzando SA-MB non funzionalizzati come controllo. Barre di errore, media ± SD, n = 3. (E) I grafici a barre confrontano la purezza delle CTC ottenute utilizzando un solo chip HB rispetto a quelle sottoposte a cattura e purificazione sequenziale. Il gruppo di controllo rappresenta la purezza CTC non trattata. Barre di errore, media ± SD, n=3. (F) Identificazione delle cellule nel chip di isolamento CTC. Le cellule LNCaP sono state colorate con Hoechst e Calceina AM, mentre le cellule del sangue sono state colorate solo con Hoechst. Barra della scala, 100 μm. (G) Purezza delle cellule tumorali ed efficienza di cattura in esperimenti di spiking utilizzando 1 mL o 10 mL di sangue periferico. Barre di errore, media ± SD, n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le cellule tumorali isolate sono state successivamente sottoposte a sequenziamento di singole cellule ad alto rendimento. Il nostro protocollo incorpora un sistema di codifica a barre a cella singola composto da 60.000 micropozzetti nidificati (Figura 3A-B). I micropozzetti inferiori, di forma quadrata, servono a catturare le singole cellule, mentre i micropozzetti superiori sono progettati per il caricamento a sfera. Ogni micropozzetto inferiore misura 25 μm in lunghezza, larghezza e altezza, adatto alla maggior parte dei tipi di celle. I pozzetti esagonali superiori hanno un diametro del cerchio inscritto e un'altezza di 50 μm per ospitare perle che in genere vanno da 30 a 50 μm. Il sistema migliora l'efficienza della cattura cellulare basata sulla cattura cumulativa, evitando al contempo la doppietta cellulare attraverso i micropozzetti di esclusione dimensionale. Per ottimizzare il protocollo di caricamento delle celle, abbiamo studiato l'efficienza di cattura delle celle e il rapporto di occupazione dei micropozzetti in diverse condizioni di input delle celle (Figura 3C). I risultati hanno mostrato che l'aumento dell'input della cella non ha diminuito l'efficienza di cattura; piuttosto, ha migliorato significativamente il tasso di occupazione. Per il chip di cattura da 60.000 pozzetti, il rapporto di occupazione dei micropozzetti si è stabilizzato quando l'input della cella ha raggiunto 80.000, senza mostrare ulteriori aumenti con input aggiuntivi. Per ridurre al minimo l'insorgenza di doppietti dovuti a un carico eccessivo delle celle, abbiamo selezionato 80.000 celle come input ottimale. Come mostrato nella Figura 3D, il chip di codifica a cella singola ha raggiunto un rapporto di occupazione delle perle con codice a barre dell'85,6% e del 95,7%, con un tasso di accoppiamento dell'81,9%. Inoltre, secondo il protocollo sono stati eseguiti più sedimenti, che hanno migliorato significativamente l'efficienza di cattura e il tasso di accoppiamento attraverso l'effetto di cattura cumulativo (Figura 3D). In particolare, la differenza osservata nei rapporti di occupazione tra le celle e le perle è attribuita alla maggiore densità e massa delle perle rispetto alle celle, che consente loro di stabilirsi in modo più efficiente nei micropozzetti per gravità. Pertanto, in condizioni di carico ottimizzate, un tasso di occupazione di coppia di circa l'80% è generalmente considerato l'ideale.

figure-results-2
Figura 3: Tecnologia di codifica a barre e sequenziamento a singola cellula ad alta produttività basata su microwell. (A) Flusso di lavoro del protocollo di sequenziamento single-CTC. (B) La microcopia dimostra le strutture microfluidiche dei pozzetti di cattura delle perle a cella singola/con codice a barre. I processi di cattura cellulare, cattura delle perle e recupero delle perle sono mostrati da sinistra a destra. Barra di scala 30 μm. (C) I grafici a linee illustrano l'efficienza di cattura delle celle e il rapporto di occupazione dei micropozzetti del chip di codifica a cella singola (60000 pozzetti doppi) in diverse condizioni di ingresso delle celle. (D) Tassi di occupazione delle celle e delle perle con codice a barre in condizioni di input delle celle ottimizzate, insieme al corrispondente rapporto di accoppiamento cella-perlina. I pannelli sinistro e destro mostrano l'approccio di acquisizione utilizzando rispettivamente più tentativi di assestamento e solo un singolo assestamento. Barre di errore, media ± SD, n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Infine, per convalidare il protocollo integrato per lo smistamento delle CTC e scRNA-seq, abbiamo mescolato le cellule PC3, LNCaP e Jurkat con un rapporto stimato di 1:3:4000 e le abbiamo caricate sui chip microfluidici per la cattura, la purificazione e il sequenziamento delle cellule tumorali. Attraverso l'efficiente piattaforma di isolamento delle cellule tumorali, abbiamo ottenuto cellule tumorali EpCAM-positive altamente pure (Figura 4B). Contemporaneamente, il chip scRNA-seq basato su microfluidica ha dimostrato una precisa capacità di profilazione del tipo cellulare, con i risultati visualizzati attraverso l'analisi t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) (Figura 4A). Siamo riusciti a identificare tre distinte popolazioni cellulari, ognuna delle quali poteva essere distinta da marcatori unici (Figura 4C). Inoltre, le proporzioni di cellule nell'output finale corrispondevano strettamente a quelle dell'input purificato, confermando che il processo di codifica a barre a singola cellula era imparziale e privo di contaminazioni (Figura 4B). Un cluster è stato identificato come cellule Jurkat in base all'espressione specifica di TRBC1, IGLL1, CD1E e CD3D (Figura 4D). L'analisi dell'arricchimento del percorso ha ulteriormente confermato la robustezza di questa classificazione (Figura 4E). Inoltre, le due linee cellulari di cancro alla prostata sono state nettamente separate in singoli cluster in base ai geni differenzialmente espressi (DEG) (Figura 4F-G). Il cluster PC3 era caratterizzato da un'elevata espressione di microseminoproteina (MSMP), nota anche come microproteina secreta da PC3. D'altra parte, il cluster LNCaP esprimeva in modo univoco marcatori correlati all'adesione, alla proliferazione e alla pluripotenza cellulare, come NEDD4, CTNNA1 (α-catenina 1) e RBBP7.

figure-results-3
Figura 4: Validazione del sorting delle CTC e del sequenziamento di singole cellule utilizzando un esperimento spike-in. (A) Grafico t-SNE che mostra il profilo del tipo di cellula delle cellule catturate e purificate. (B) Diagramma a barre che raffigura le proporzioni dei tre tipi di cellule in tre fasi: input iniziale, post-purificazione e output di sequenziamento finale. (C) Dot plot che illustra l'espressione di geni marcatori unici in diversi cluster cellulari. (D) Livelli di espressione di TRBC1, IGLL1, CD1E e CD3D in tutte le cellule. (E) Analisi dell'arricchimento della via GO e KEGG di geni differenzialmente espressi (DEG) nel cluster Jurkat. (F) Modelli di espressione di NEDD4 e MSMP in tutte le cellule. (G) Grafico del vulcano che mostra i DEG tra gli ammassi PC3 e LNCaP. I punti rossi rappresentano i geni sovraregolati in PC3; i punti blu rappresentano quelli sovraregolati in LNCaP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Miscela principaleReagenteDiluizione finaleTipo di buffer
0,5% F-68F-680.50%Acqua trattata DEPC
PBS1×
TE-TWTris-HCl (pH=8,0)10 mMAcqua trattata DEPC
EDTA1 mM
Interpolazione-200.01%
20× TE (pH=7,5)Tris-HCl (pH=7,5)200 mMAcqua trattata DEPC
EDTA20 mM
TE-SDSTris-HCl (pH=8,0)10 mMAcqua trattata DEPC
EDTA1 mM
SDS0.50%

Tabella 1: Composizione della miscela di reagenti per la preparazione del sequenziamento di CTC singolo. Sono mostrate parti dei reagenti necessari per scRNA-seq, che possono essere preparati prima dell'operazione del chip per garantire un processo rapido e regolare.

Figura supplementare 1: Progettazione per il chip HB. (A) Diagramma schematico della struttura microfluidica a due strati. Top: Strato superiore caratterizzato dalla struttura a spina di pesce. Un inserto ingrandito mostra la geometria dettagliata della spina di pesce, che è orientata con un angolo di 45° rispetto alla parete del canale, con una larghezza della scanalatura di 100 μm e un passo di 200 μm. Inferiore: Strato inferiore composto da una matrice di pilastri di supporto (28 colonne × 7 righe), numerata da #1 a #28 lungo la direzione del flusso. (B) Vista laterale del truciolo a spina di pesce. Le scanalature a spina di pesce hanno una larghezza di 100 μm. Le altezze sia delle strutture a spina di pesce che dei pilastri di supporto sono di 50 μm. (C) Vista dall'alto del truciolo a spina di pesce. Ogni pilastro di supporto misura 500 μm di larghezza e 1150 μm di lunghezza, con uno spazio di 550 μm tra i pilastri adiacenti. (D) Fotografia del chip HB fabbricato. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Immagine rappresentativa che mostra le cellule tumorali colorate in fluorescenza e le cellule del sangue presenti nel fluido di scarto raccolto dall'uscita del chip di isolamento CTC. Le cellule LNCaP sono state colorate con Hoechst e Calceina AM, mentre le cellule del sangue sono state colorate solo con Hoechst. Barra graduata 100 μm. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare: Sequenze oligonucleotidiche utilizzate nella trascrizione inversa e nella preparazione di librerie Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le CTC fungono da preziosi biomarcatori per la diagnosi del cancro, la guida al trattamento e gli studi sull'inizio, la progressione e le metastasi del tumore25. Tuttavia, i metodi di isolamento CTC esistenti non riescono a raggiungere sia un'elevata efficienza che un elevato throughput26. Inoltre, la bassa efficienza di rilascio delle CTC spesso si traduce in una bassa purezza e in un elevato danno cellulare, limitandone la compatibilità con le analisi a valle27. Qui, abbiamo proposto un protocollo integrato per lo smistamento di CTC ad alto rendimento e il sequenziamento di CTC singole, costituito da tre procedure principali: cattura di CTC, purificazione e scRNA-seq.

Questa piattaforma basata sulla microfluidica offre flessibilità e scalabilità. Il numero di canali paralleli nei chip HB, così come i pozzetti di cattura nel chip di codifica a barre, possono essere regolati in base alle diverse esigenze del campione, soddisfacendo così le esigenze di alta produttività. Nel chip di cattura CTC, gli IMB possono essere ottimizzati in base al tipo di cancro specifico. Ad esempio, nei campioni di pazienti con carcinoma prostatico, gli IMB possono essere funzionalizzati con un cocktail di anticorpi EpCAM e PSMA per migliorare l'efficienza di cattura. Inoltre, affidarsi esclusivamente alla cattura basata su EpCAM può comportare la perdita di CTC mesenchimali che hanno subito una transizione epitelio-mesenchimale (EMT). Per affrontare questo problema, è possibile incorporare anticorpi aggiuntivi contro la proteina da shock termico 70 (HSP-70) o la vimentina di superficie cellulare (CSV) per catturare le CTC in diversi stadi EMT.

Poiché i chip HB per la cattura e la purificazione di CTC sono basati sulla microfluidica, è essenziale un'attenta manipolazione durante gli esperimenti. Prima di introdurre i reagenti nell'ingresso del truciolo, tutte le bolle d'aria devono essere rimosse e sia l'ingresso che l'uscita possono essere sigillati per eliminare l'aria intrappolata. Inoltre, i reagenti devono essere introdotti rapidamente (entro 1-2 s), poiché le bolle d'aria intrappolate possono ostruire il passaggio di IMB e cellule, riducendo significativamente l'efficienza di cattura e la purezza. Inoltre, come accennato in precedenza, la distribuzione uniforme degli IMB è fondamentale per il successo della cattura CTC. Dopo aver caricato gli IMB, il chip deve essere posizionato verticalmente sul magnete e fissato in posizione per almeno cinque minuti per evitare che le variazioni del campo magnetico interrompano la distribuzione dell'IMB. In particolare, la velocità di flusso di carico delle celle specificata nel protocollo deve essere ottimizzata in base ai diversi tipi di campione. Ad esempio, i campioni di leucopatia mostrano livelli elevati di concentrazione e viscosità dei leucociti. Se la velocità di flusso è troppo elevata, può ostacolare interazioni efficienti tra CTC e IMB, prevenendo la cattura magnetica accumulata e riducendo così la purezza delle CTC. Per valutare le prestazioni della nostra piattaforma di isolamento e purificazione CTC nell'elaborazione di campioni di sangue clinico, abbiamo raccolto PB da diversi donatori sani e abbiamo inserito un piccolo numero di cellule LNCaP (circa 50-100 cellule per ml) nei campioni. In particolare, sebbene la piattaforma abbia mostrato un'elevata efficienza di cattura e purezza per le cellule tumorali nei campioni di PB, le sue prestazioni sono state leggermente inferiori a quelle osservate nei campioni di cellule basate su PBS (Figura 2D, Figura 2E e Figura 2G). Ipotizziamo che questa discrepanza sia dovuta alla maggiore viscosità del sangue e alla presenza di globuli rossi e piastrine abbondanti rispetto alla PBS. Pertanto, quando si maneggiano campioni di sangue clinici, possono essere prese in considerazione fasi di pretrattamento come la lisi dei globuli rossi o l'estrazione di PBMC per migliorare le prestazioni.

Simile ai chip HB, il chip di codifica a celle singole basato sulla microfluidica richiede un'attenta manipolazione per prevenire la formazione di bolle d'aria. Data la varietà di reagenti coinvolti, alcuni reagenti possono essere pre-preparati prima di iniziare le operazioni di chip (Tabella 1). Quando si caricano celle e microsfere, è necessario un attento controllo della velocità di iniezione per garantire una distribuzione uniforme, poiché le celle hanno una densità inferiore mentre le perle con codice a barre sono più dense. Tipicamente, la sospensione della cella deve essere aggiunta lentamente nell'arco di 3~5 s, seguita dall'aggiunta rapida della sospensione del tallone entro 1~2 s. Dopo aver caricato le celle e le perle, eseguire due cicli di aspirazione ed erogazione, quindi posizionare il chip su un agitatore per completare il processo di cattura cumulativa. Questo passaggio è fondamentale per migliorare il rapporto di occupazione e il tasso di abbinamento. Durante la lisi cellulare, viene utilizzato un metodo di tenuta dell'olio per isolare le superfici dei micropozzetti, prevenendo la contaminazione incrociata tra i pozzetti. In particolare, l'olio minerale deve essere aggiunto immediatamente dopo la lisi senza indugio. Dopo la lisi, il recupero delle perle con codice a barre viene eseguito spostando lentamente il magnete dall'ingresso all'uscita per garantire un alto tasso di recupero delle perline. Se necessario, questo passaggio può essere ripetuto più volte. Infine, le microsfere magnetiche recuperate nella provetta da centrifuga vengono sottoposte a RT, sintesi del secondo filamento, amplificazione PCR e costruzione della libreria, seguite dal sequenziamento di nuova generazione (NGS).

Questa piattaforma microfluidica integrata ha un potenziale significativo per le applicazioni cliniche. Migliorando l'efficienza e la produttività dell'isolamento delle CTC, aumenta il rilevamento delle CTC nelle fasi a basso carico tumorale, consentendo la creazione di un modello di classificazione che collega la conta delle CTC alla stadiazione del tumore. Questo progresso fornisce un nuovo approccio per la diagnosi del cancro, il monitoraggio del trattamento, la valutazione della prognosi e la previsione delle recidive. Inoltre, l'analisi trascrittomica su singola cellula delle CTC consente l'identificazione di caratteristiche molecolari chiave, tra cui percorsi genici essenziali, reti di interazione e geni biomarcatori. Questa analisi fornisce informazioni sui fattori critici che guidano le metastasi precoci del cancro e svela i meccanismi molecolari alla base della formazione di lesioni metastatiche, offrendo potenziali bersagli terapeutici per i pazienti con cancro ricorrente o metastatico. Inoltre, questa piattaforma è altamente scalabile. Può essere adattato per soddisfare requisiti analitici specifici e ampliato per supportare analisi multi-omiche, tra cui trascrittomica e genomica.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 82227801).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Mercaptopropile) trimetossisilano Sigma Aldrich175617-100GSoluzione MPTS
20 e volte; SSC BufferSangon BiotechB548109-0200
5 e volte; RT BufferSangon BiotechB610020-0500
Anticorpo monoclonale CD45 biotinilatoeBioscienza13-0459-82Deposito a 2°Deg; Da C a 8°°; C 
Anticorpo monoclonale EpCAM biotinilatoeBioscienza13-9326-82Deposito a 2°Deg; Da C a 8°°; C 
Albumina sierica bovina (BSA)Sangon BiotechA600332-0100Deposito a 2°Deg; Da C a 8°°; C 
Chip a cartuccia DECODERBiosistemi Dinamici2203106Deposito a 2°Deg; Da C a 8°°; C 
Kit di reagenti per cartucce DECODERBiosistemi Dinamici2203206Deposito a 2°Deg; Da C a 8°°; C 
Acqua trattata DEPCSangon BiotechB501005-0500
D-PBSSangon BiotechE607009-0500Contiene: NaCl 136,89 mM; KCl 2,67 mM; Na2HPO4 8,10 mM; KH2PO4 1,47 mM. pH=7.2-7.4 
DTTThermo ScientificR0861Deposito a 2°Deg; Da C a 8°°; C 
Dynabeads MyOne SA T1Invitrogen65602SA-MB, 1 e mu; m
EDTASangon BiotechB540625-05000,5 M, pH=8,0
KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKK26012 e volte; Mix di reazioni PCR
Soln di precipitazione cloruro di litio.InvitrogenAM94800.2 & micro; M filtrato
N-γ-maleimidobutiril-ossisuccinimide estereThermo Scientific22309Soluzione GMBS
Pluronic F-68Sangon BiotechA600749-0025
Qubit 1 e volte; Kit di analisi HS dsDNAThermo ScientificQ33231
Soluzione SDSSangon BiotechB648118-010010% SDS
StreptavidinaSigma Aldrich189730Deposito a 2°Deg; Da C a 8°°; C 
Fotoresist SU-8MicroChimicaSU-8 3050
Kit di elastomeri in silicone SYLGARD 184Dow Corning4019862
Tris-HCl (pH 7,5)LEAGENENR00721 mol/L, pH=7,5, RNasi libera
Tris-HCl (pH 8.0)LEAGENENR00731 mol/L, pH=8,0, senza RNASI
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
Trueprep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina VazymeTD502Kit di preparazione della libreria di DNA
Preadolescente-20Sangon BiotechA600560-0500
Perle pulite VAHTS DNAVazymeN411Sfere magnetiche di immobilizzazione reversibile in fase solida (SPRI) per la purificazione del DNA

References

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