Metabolomica spaziale multimodale con imaging con spettrometria di massa guidata al microscopio nel medio infrarosso

Summary

Presentiamo un flusso di lavoro di metabolomica spaziale multimodale che integra l'imaging con spettrometria di massa (MSI) e l'imaging nel medio infrarosso (MIR) sulla stessa sezione di tessuto per analisi metaboliche e biochimiche spazialmente risolte.

Abstract

La metabolomica spaziale è un campo in rapida evoluzione per mappare la distribuzione dei metaboliti all'interno di tessuti, organi e persino singole cellule. Questo approccio fornisce informazioni metaboliche contestuali, fondamentali per comprendere l'eterogeneità biochimica dei sistemi biologici. L'imaging nel medio infrarosso (MIR) e l'imaging con spettrometria di massa (MSI) sono emersi come approcci potenti per la metabolomica spaziale, ognuno dei quali offre vantaggi unici e complementari. In questo studio, presentiamo un flusso di lavoro per l'esecuzione dell'imaging MIR e della ionizzazione di desorbimento laser assistita da matrice MSI (MALDI-MSI) sulla stessa sezione di tessuto, che comprende procedure sperimentali, co-registrazione dell'imaging, integrazione dei dati e analisi bioinformatiche. L'imaging MIR viene impiegato come modalità a monte, consentendo l'analisi biochimica non distruttiva dei tessuti. Successivamente, una matrice viene depositata nel tessuto per MALDI-MSI, guidata dalle informazioni spaziali ottenute dall'imaging MIR. Le immagini vengono integrate dopo la co-registrazione, consentendo l'analisi metabolomica spaziale multimodale utilizzando strumenti bioinformatici avanzati come Seurat. L'integrazione dell'imaging MIR e dell'MSI rappresenta un progresso trasformativo nella metabolomica spaziale, offrendo opportunità senza precedenti per esplorare la complessità spaziale e chimica dei processi metabolici sia in salute che in malattia. Questo approccio multimodale ha un potenziale significativo per guidare le innovazioni nella scoperta di biomarcatori, nella diagnostica delle malattie e nello sviluppo terapeutico.

Introduction

La metabolomica spaziale prevede la mappatura dei metaboliti all'interno del loro contesto tissutale nativo integrando l'imaging con spettrometria di massa (MSI) o altre tecniche spazialmente risolte, con l'analisi metabolica, offrendo informazioni sul metabolismo a risoluzione sub-tissutale, cellulare o subcellulare 1,2,3,4,5,6,7,8 . Tra queste modalità di imaging, la microscopia nel medio infrarosso (MIR) sta guadagnando sempre più attenzione per la sua capacità di mappare chimicamente le biomolecole sulla base del contrasto vibrazionale molecolare 4,7,9,10,11,12. La natura non distruttiva, priva di etichette, ad alta velocità ed economica 4,7,9,10,11,12 rende l'imaging MIR particolarmente adatto per l'integrazione con MSI, formando un promettente approccio multimodale per un'analisi spaziale completa.

La MSI (MALDI-MSI) è una delle tecniche più utilizzate nella metabolomica spaziale (Figura 1A)¹³. Consente il rilevamento di un'ampia gamma di metaboliti, tra cui lipidi, amminoacidi, zuccheri, nucleotidi e metaboliti secondari, con un'elevata sensibilità¹. I progressi nella selezione delle matrici (ad esempio, acido 2,5-diidrossibenzoico [DHB], 9-aminoacridina [9AA] o N- (1-naftil) etilendiammina dicloridrato [NEDC]) e nelle tecniche di ionizzazione (ad esempio, metodi di post-ionizzazione) hanno ulteriormente ampliato la copertura di rilevamento, in particolare per le specie a bassa abbondanza e scarsamente ionizzabili¹⁴. I moderni sistemi MALDI-MSI supportano velocità di imaging che vanno tipicamente da 5 a 50 pixel al secondo, a seconda della risoluzione spaziale e del tipo di analizzatore di massa utilizzato (ad esempio, tempo di volo [TOF], Orbitrap o risonanza ciclotronica ionica in trasformata di Fourier [FT-IRC]). In particolare, gli strumenti MALDI-TOF ad alta velocità hanno raggiunto velocità superiori a 100 pixel al secondo, consentendo l'imaging di grandi aree in poche ore¹⁵. La risoluzione spaziale di MALDI-MSI è generalmente compresa tra 5 e 50 μm, sufficiente a risolvere strutture cellulari e persino subcellulari^16,17. Tuttavia, una risoluzione spaziale più elevata in genere comporta tempi di acquisizione più lunghi, un rapporto segnale/rumore ridotto e maggiori esigenze computazionali durante l'elaborazione dei dati.

A differenza di MSI, l'imaging MIR è un approccio ottico ad ampio campo⁴, che lo rende intrinsecamente non distruttivo e ad alto rendimento. I recenti progressi nei laser a cascata quantica ad alta potenza (QCL) consentono un nuovo framework noto come imaging a infrarossi a frequenza discreta (DFIR), che aumenta significativamente la velocità di imaging fino alla velocità video (Figura 1B)^12,18. Inoltre, le sorgenti QCL hanno reso i rivelatori microbolometrici non raffreddati utilizzabili per l'imaging MIR, consentendo l'uso di rivelatori FPA (Focal Plane Array) più grandi¹². Di conseguenza, è possibile acquisire un'immagine MIR a frequenza singola su un'area di 1 cm² con risoluzione cellulare (~5 μm) in pochi secondi. L'imaging MIR può funzionare sia in modalità label-free che etichettata. In studi precedenti ^4,19,20, sono state introdotte piccole sonde vibrazionali IR-attive per monitorare la cinetica di varie attività metaboliche in situ. Queste sonde consentono il monitoraggio in tempo reale delle vie metaboliche riportando le trasformazioni chimiche globali attraverso bande spettrali MIR uniche⁴. Pertanto, l'imaging MIR fornisce sia la profilazione biochimica statica che il monitoraggio metabolico dinamico con un'elevata risoluzione spaziale e una rapida velocità di acquisizione.

In questo manoscritto, introduciamo un flusso di lavoro completo per eseguire la metabolomica spaziale MALDI-MSI guidata da MIR, dimostrando la fattibilità di acquisire entrambe le modalità dallo stesso campione (Figura 2, Figura 3). Integrando l'imaging MIR con MSI, stabiliamo un approccio multimodale che sfrutta i punti di forza complementari di ciascuna tecnica. L'imaging MIR offre una mappatura biochimica rapida e senza marcatura dell'intero vetrino alla risoluzione cellulare, fungendo da guida preziosa per la selezione della regione di interesse (ROI) nella successiva acquisizione di MSI. Questa strategia consente un flusso di lavoro MSI più mirato ed efficiente, riducendo i tempi e i costi di acquisizione e migliorando al contempo l'interpretabilità e la rilevanza biologica dei dati di metabolomica spaziale. A sua volta, MSI fornisce annotazioni molecolari altamente dettagliate delle immagini iperspettrali MIR, consentendo una comprensione più profonda della biochimica dei tessuti. Nel complesso, questo approccio integrato ha un grande potenziale per far progredire la scoperta di biomarcatori, la diagnostica delle malattie e lo sviluppo terapeutico.

Protocol

Il protocollo è stato condotto in conformità con il protocollo sperimentale sugli animali (DSF-2024-004) approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) del Laboratory Animal Resources Center dell'Università di Fudan.

NOTA: Questo studio fornisce un flusso di lavoro per l'esecuzione di imaging MIR e MALDI-MSI sulla stessa sezione di tessuto. Questo approccio integrato comprende procedure sperimentali, co-registrazione di immagini, fusione di dati e analisi bioinformatiche a valle (Figura 1C). L'imaging MIR viene utilizzato come modalità a monte, consentendo una mappatura biochimica non distruttiva e senza marcatura del tessuto. Guidati dalle informazioni spaziali dell'imaging MIR, viene successivamente applicata una matrice per l'acquisizione MALDI-MSI. A seguito di una precisa co-registrazione, i set di dati sono integrati per la co-analisi multivariata (Figura 4), consentendo una metabolomica spaziale completa attraverso strumenti computazionali avanzati.

1. Preparazione del campione

1. Preparazione di campioni di tessuto
   1. Prelievo di tessuti di topo
      1. House C57BL/6J topi (20 settimane di età, 40 g) in specifiche condizioni prive di agenti patogeni (SPF), mantenuti su un ciclo luce/buio di 12 ore e dotati di accesso ad libitum a cibo e acqua per garantire una salute ottimale prima dell'esperimento.
      2. Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico alla dose di 50 mg/kg di peso corporeo per garantire un'anestesia profonda. Monitorare l'animale e confermare l'assenza di riflessi pedalesi e corneali prima di procedere con la perfusione.
      3. Perfondere circa 20-30 ml di PBS freddo contenente eparina (5 UI/mL) attraverso il ventricolo sinistro a una pressione controllata di 150 mmHg per 6 minuti per eliminare il sangue e dissanguare l'organo prima della rimozione.
      4. Spegnere immediatamente tutti i tessuti raccolti con azoto liquido e conservarli a -80 °C per ulteriori analisi.
         NOTA: Il congelamento rapido è essenziale per prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio, che possono distorcere la morfologia dei tessuti.
   2. Inclusione tissutale e criosezione
      1. Impostare il microtomo a -20 °C e decontaminare la camera e la lama con etanolo (EtOH) per eliminare il mezzo di inclusione residuo. Lasciare che i vetrini CaF₂ , il mailer per vetrini, il supporto del campione e il campione di tessuto si equilibrino all'interno del criostato.
      2. Tagliare il fazzoletto a circa 5 mm × 5 mm × 3 mm. Incorporarlo in gelatina al 10% all'interno di un criomold standard a -20 °C, garantendo un corretto orientamento per il sezionamento. Congelare il campione incorporato su ghiaccio secco e conservarlo a -80 °C fino alla criosezione.
      3. Estrarre il tessuto dal suo stampo, tagliare il materiale in eccesso per ottimizzare il sezionamento e fissarlo al portacampioni utilizzando acqua ultrapura per garantire un'adesione stabile.
      4. Tagliare sezioni di 10 μm di spessore e immobilizzare le sezioni su substrati CaF₂ pre-rivestiti e conservarle a -80 °C.
      5. Posizionare le sezioni di tessuto montate in un liofilizzatore sottovuoto prima dell'imaging nel medio infrarosso. Impostare la pressione della camera a 0,1 mPa e la temperatura a -100 °C. Asciugare i campioni per 30 minuti.
2. Preparazione del campione cellulare
   1. Seminare 1,25 × 10⁵ cellule HeLa su substrati circolari CaF₂ di 13 mm di diametro posti in piastre di coltura standard. Utilizzare Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina. Incubare le cellule in condizioni di coltura standard (37 °C, 5% CO₂) per 24 ore.
   2. Dopo 24 ore, rimuovere con cura il terreno e fissare le cellule incubandole in paraformaldeide al 4% (PFA) disciolta in tampone PBS per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
   3. Sciacquare le celle fisse tre volte con tampone HBSS, quindi lavarle altre tre volte con ddH₂O.
   4. Asciugare completamente all'aria i substrati CaF₂ a RT prima di procedere all'imaging MIR.

2. Acquisizione di immagini multimodali

1. Acquisizione di immagini MIR con laser a cascata quantica (QCL)
   1. Esecuzione della microscopia per imaging QCL MIR utilizzando un microscopio QCL-MIR dotato di un microbolometro raffreddato a liquido non N₂, rivelatore FPA (Focal Plane Array) 520 × 480 e tecnologia di riduzione della coerenza spaziale.
   2. Seleziona la gamma spettrale da 950 ^cm-1 a 1800 ^cm-1.
   3. Utilizzare un obiettivo da 4× con un'apertura numerica (NA) di 0,6, con una dimensione nominale dei pixel di 4,25 μm.
   4. Raccogli uno spettro di fondo su un substrato CaF₂ pulito a una risoluzione spettrale di 4 ^cm-1 .
   5. Seleziona l'area di acquisizione in base alla morfologia del tessuto e raccogli i dati spettrali con una risoluzione spettrale di 4 ^cm-1. A questa risoluzione spettrale, la velocità di acquisizione dell'immagine è di circa 0,3 mm²/s.
      NOTA: Tutte le misurazioni vengono eseguite in modalità di trasmissione utilizzando vetrini CaF₂ , con regolazione manuale della messa a fuoco.
2. Acquisizione di immagini per spettrometria di massa
   1. Applicazione a matrice
      1. Utilizzare le sezioni di tessuto post-MIR per MALDI-MSI, applicare i marcatori fiduciali attorno al tessuto utilizzando una penna Tippex e acquisire un'immagine ottica pre-MSI con uno scanner piano per la registrazione dell'immagine.
      2. Preparare la matrice NEDC a 7 mg/mL in metanolo/acetonitrile/acqua deionizzata (V/V/V=75:25:5), quindi filtrare attraverso una membrana da 0,2 μm per rimuovere il particolato.
      3. Caricare i vetrini di tessuto marcati in uno spruzzatore automatico a matrice. Erogare la matrice NEDC sul campione utilizzando i parametri predefiniti.
   2. Misurazione MALDI-MSI
      1. Depositare 0,2 μl di sospensione di fosforo rosso sul vetrino CaF₂ per fungere da standard di calibrazione della massa esterna.
      2. Fissare la slitta rivestita a matrice nell'adattatore per slitte, garantendo un contatto elettrico ottimale con il supporto. Caricare la piastra in un sistema MALDI-MSI.
      3. Allineare l'immagine ottica del vetrino con le coordinate XY-motorie dello stadio MALDI utilizzando i marcatori fiduciali. Definisci le ROI per l'analisi dei tessuti e includi un'area "solo matrice" come controllo negativo.
      4. Configura lo strumento in modalità ioni negativi con una dimensione dei pixel di 20 × 20 μm², coprendo un intervallo m/z di 50-1000. Eseguire la calibrazione della massa utilizzando il punto rosso al fosforo prima di avviare l'acquisizione dei dati. Eseguire l'acquisizione dei dati utilizzando una piattaforma di analisi dei dati commerciale.

3. Pre-elaborazione e analisi dei dati delle immagini

NOTA: I codici personalizzati MATLAB vengono caricati come file supplementare 1.

1. Pre-elaborazione e analisi dei dati QCL-MIR
   1. Pre-elaborazione dei dati
      1. Esporta i dati iperspettrali in un formato appropriato per ulteriori analisi.
      2. Esegui la pre-elaborazione dei dati utilizzando CytoSpec e MATLAB, seguendo questi passaggi 3.1.1.3-3.1.1.8
      3. Importare i dati spettrali MIR in CytoSpec v2.00.07 per la preelaborazione.
      4. Valuta la qualità spettrale utilizzando il modulo di test di qualità integrato in CytoSpec. Selezionare il criterio 2 (spessore del campione) per valutare la consistenza del campione. Impostare l'intervallo di integrazione spettrale su 950-1800 ^cm-1. Definire le soglie di assorbanza tra 50 e 1000 unità per escludere gli spettri da regioni eccessivamente sottili o spesse.
      5. Riduci il rumore utilizzando il filtraggio basato su PCA in CytoSpec. Conserva i primi 10 componenti principali (PC) per eliminare il rumore ad alta frequenza preservando la varianza biochimica chiave.
      6. Esporta i dati spettrali pre-elaborati da CytoSpec in formato .mat per ulteriori analisi in MATLAB.
      7. Esegui la correzione della linea di base in MATLAB utilizzando un algoritmo di correzione dell'elastico nell'intervallo spettrale 950-1800 ^cm-1 per eliminare la deriva della linea di base e migliorare l'accuratezza spettrale.
      8. Applicare la normalizzazione spettrale utilizzando il ridimensionamento min-max sullo stesso intervallo spettrale per standardizzare le intensità su tutti gli spettri e garantire la comparabilità in tutto il set di dati.
   2. Analisi dei dati
      1. Identificare le caratteristiche associate alle proteine a 1.550 ^cm-1 e 1.650 ^cm-1, corrispondenti rispettivamente alle bande ammide II e ammide I. Identificare le caratteristiche associate ai lipidi a 1.740 ^cm-1, che rappresentano la vibrazione di allungamento dell'estere C = O.
      2. Calcolare il rapporto di intensità della banda dell'ammide I (1650 ^cm-1) rispetto all'estere C=O (1740 ^cm-1) e generare mappe del rapporto per visualizzare la distribuzione spaziale dei lipidi alle proteine.
      3. Analisi dei cluster non supervisionati: esegui l'analisi di clustering gerarchico (HCA) su dati iperspettrali utilizzando la distanza euclidea e il collegamento di Ward per classificare le regioni in base alla somiglianza spettrale. Genera mappe dei cluster per identificare regioni biochimicamente distinte e rivelare differenze strutturali o patologiche.
2. Pre-elaborazione e analisi dei dati MSI
   1. Importa i dati MSI grezzi in una piattaforma di analisi dei dati commerciali.
   2. Esegui il prelievo di picco con intensità relativa > 0,01%.
   3. Escludere i picchi derivati dalla matrice dall'elenco dei picchi sperimentali confrontandoli con lo spettro ottenuto da una regione di controllo di sola matrice. Rimuovere tutti i picchi che appaiono nello spettro di controllo e hanno un rapporto segnale/rumore (SNR) inferiore a 3.
   4. Normalizzare il set di dati in base al valore quadratico medio (RMS) per tenere conto della variabilità dell'intensità del segnale ionico tra pixel e campioni.
   5. Perfezionare l'identificazione dei metaboliti filtrando le caratteristiche in base alla loro distribuzione tissutale, alla corrispondenza con le voci del database del metaboloma umano (HMDB) e all'accordo con i valori teorici m/z.
   6. Selezionare i metaboliti rilevanti in base agli obiettivi sperimentali e al contesto tissutale.
   7. Esporta le intensità delle funzioni selezionate per tutti i pixel come file CSV.
   8. Applicare tecniche di riduzione della dimensionalità (ad esempio, PCA, t-SNE o UMAP) per ridurre la complessità dei dati e identificare cluster di pixel con firme metaboliche simili utilizzando strumenti bioinformatici come Seurat e Banksy, facilitando la visualizzazione dell'eterogeneità metabolica spaziale.

4. Co-registrazione e co-analisi di immagini multimodali

1. Selezionare l'immagine MIR acquisita a 1650 ^cm-1 come riferimento spaziale per la co-registrazione. Questo numero d'onda specifico evidenzia la banda proteica dell'ammide I, offrendo un forte contrasto tissutale.
2. Normalizza i valori di intensità delle immagini MIR e MSI per migliorare la comparabilità visiva. Applica tecniche di miglioramento del contrasto, come l'equalizzazione dell'istogramma utilizzando la funzione histeq in MATLAB, per ridistribuire le intensità dell'immagine e migliorare la visibilità delle caratteristiche strutturali critiche per la selezione dei punti di riferimento.
3. Carica entrambe le immagini MIR e MSI in MATLAB utilizzando la funzione cpselect dal Toolbox di elaborazione delle immagini. Questa funzione apre un'interfaccia interattiva per la selezione dei punti di riferimento.
4. Annotare manualmente da cinque a dieci punti di controllo anatomicamente rilevanti e ben distribuiti su entrambe le immagini MIR e MSI utilizzando la funzione cpselect . Questi punti di riferimento dovrebbero corrispondere a caratteristiche morfologiche distinte come i confini dei tessuti.
   NOTA: Distribuire i punti di controllo in modo uniforme sul campo dell'immagine per ridurre al minimo la distorsione localizzata.
5. Esporta e registra le coordinate dei punti di controllo annotati da entrambe le immagini. Memorizzali come due array corrispondenti per il calcolo della trasformazione (ad esempio, movingPoints e fixedPoints).
6. Calcola una matrice di trasformazione affine utilizzando la funzione MATLAB fitgeotrans in modalità affine . Questa trasformazione tiene conto del ridimensionamento, della rotazione, della traslazione e dell'inclinazione.
7. Applica la trasformazione calcolata all'immagine MSI utilizzando la funzione imwarp in MATLAB. Questo passaggio genera un'immagine MSI registrata spazialmente che è geometricamente allineata al quadro di riferimento MIR.
8. Ispezionare visivamente l'allineamento utilizzando la funzione imshowpair in modalità fusione per sovrapporre le immagini MSI e MIR e confermare la corretta registrazione delle caratteristiche strutturali.
9. Converti sia l'immagine MSI registrata che l'immagine MIR di riferimento in maschere binarie utilizzando la funzione imbinarize in MATLAB.
10. Calcola il coefficiente di somiglianza dei dadi (DSC) per quantificare la sovrapposizione spaziale tra le due maschere binarie. Il DSC è definito come: DSC = 2 × (Area di sovrapposizione)/(Area totale di entrambe le maschere). Un valore DSC vicino a 1,0 indica un'elevata sovrapposizione spaziale e precisione di registrazione.
    NOTA: Se necessario, affinare la registrazione regolando il numero o il posizionamento dei punti di controllo e ripetendo il processo di trasformazione. Prendere in considerazione metodi di registrazione non rigidi se persistono disallineamenti locali.
11. Salva l'immagine registrata, i parametri di trasformazione e le coordinate dei punti di riferimento per l'analisi delle immagini multimodali a valle, come la correlazione spaziale delle caratteristiche biochimiche e strutturali.

Results

Per convalidare la strategia di metabolomica spaziale multimodale sopra descritta, l'abbiamo implementata in un modello murino di cancro. Le cellule tumorali sono state geneticamente modificate per esprimere la proteina fluorescente verde (GFP), consentendo una localizzazione precisa della regione tumorale attraverso l'imaging a fluorescenza. La Figura 2A mostra i risultati dell'imaging QCL-MIR label-free con una copertura spettrale di 950-1800 ^cm-1, nota come "regione delle impro...

Discussion

Qui, presentiamo una strategia di metabolomica spaziale multimodale che integra l'imaging MSI e MIR per consentire un profilo metabolico ad alto rendimento e molecolarmente specifico sugli stessi campioni. L'imaging MIR consente una mappatura chimica non distruttiva e senza marcatura basata su vibrazioni molecolari, fornendo informazioni dettagliate sui gruppi strutturali e funzionali. Al contrario, l'MSI offre un'elevata sensibilità e specificità per l'identificazione e la quantificazio...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldeide al 4%, soluzione di fissazione tissutale	Sangon Biotech
Albumina sierica bovina	Sigma Aldrich	126615
C57BL/6JNifdc topi	Charles River	219
CaF2 vetrini	Crystran	CAFP25-1
Microtomo Criostato	Dakewe Biotech	CT520
Cytospec	Peter Lasch	Versione 2.10.01	Software per l'analisi dei dati MIR, inclusa la correzione della linea di base, la normalizzazione, la generazione di immagini e l'analisi iperspettrale.
tampone DPBS	Fisher Scientific	14-190-250
Siero fetale bovino	Gibco	10270106
Liofilizzatori	LABCONCO	FreeZone
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	Tipo A, da tampone HBSS per pelle suina
	Sangon Biotech
DMEM ad alto contenuto di glucosio	ThermoFisher Scientific
Matlab	MathWorks	Matlab R2024a	Software per l'analisi dei dati MIR, tra cui correzione della linea di base, normalizzazione, generazione di immagini e analisi iperspettrale.
Sistema di imaging per spettrometria di massa a ionizzazione a ionizzazione con desorbimento laser assistito da matrice (MALDI-MSI)	Bruker Daltonics GmbH.	timsTOF fleX MALDI-2
Metanolo	Sinopharm Reagente chimico	10014108
mMass	Institute of Entomology, Centro di Biologia dell'Accademia Ceca delle Scienze, Repubblica Ceca	Versione 5.5.0	Software per l'analisi dei dati MSI. Importa i dati MSI grezzi in SCILS Lab per la pre-elaborazione. Esegui il prelievo di picco in mMass con intensità relativa > 0,01%.
Matrice N-(1-naftil) etilendiammina dicloridrato (NEDC)	Sigma Aldrich	222488
Penicillina-streptomicina	ThermoFisher Scientific
Microscopia a medio infrarosso (QCL-MIR) con laser a cascata quantistica	... Bruker Optics GmbH	LUMOS II ILIM
Fosforo rosso	Sigma-Aldrich	8.0727
SCiLS Lab	Bruker Daltonics	SCiLS Lab 2024b	Software per l'analisi dei dati MSI. Importa i dati MSI grezzi in SCILS Lab per la pre-elaborazione. Esegui il prelievo di picco in mMass con intensità relativa > 0,01%.
Spruzzatore	HTX Technologies	TM
Tripsina, 0,25% EDTA	ThermoFisher Scientific