Articolo metodologico

Miglioramento della tecnologia del recettore dell'antigene chimerico-vescicole extracellulari (CAR-EV): il futuro della terapia del cancro

DOI:

10.3791/68726

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19 settembre 2025

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1INOVIQ Ltd., 2Centre for Clinical Research, Faculty of Medicine, The University of Queensland

In questo articolo

Sommario

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L'applicazione terapeutica delle vescicole extracellulari (EV) ha il potenziale per rivoluzionare il trattamento del cancro e la somministrazione di farmaci. Le vescicole extracellulari derivate da cellule del recettore dell'antigene chimerico (CAR) isolate mediante cromatografia a scambio ionico mostrano una maggiore capacità di carico, migliorando significativamente la loro efficacia funzionale. Questo studio caratterizza ulteriormente i CAR-EV per chiarire la loro attività biologica e il loro potenziale terapeutico.

Abstract

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Le terapie cellulari CAR hanno fatto progredire significativamente il trattamento personalizzato per diverse neoplasie ematologiche. Attualmente, sette prodotti a base di cellule CAR sono approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) e sei dall'Agenzia europea per i medicinali (EMA) per il trattamento del linfoma, del mieloma multiplo e della leucemia linfatica cronica. Rimangono diverse sfide e limitazioni, tra cui la sindrome da rilascio di citochine (CRS) e la sindrome da neurotossicità associata alle cellule effettrici immunitarie (ICANS) che sono le più significative. Le terapie prive di cellule, come le CAR-EV, offrono vantaggi sostanziali rispetto alle loro controparti cellulari. Questi includono una maggiore infiltrazione tumorale e la possibilità di somministrazione ripetuta, riducendo al minimo i rischi di CRS, ICANS e altri effetti collaterali avversi. Inoltre, la potenza dei CAR-EV può essere regolata ingegnerizzando l'inclusione di agenti citotossici e acidi ribonucleici (RNA) che modificano la funzione. In questo articolo, riportiamo lo sviluppo di una piattaforma CAR-EV scalabile per la produzione di CAR-EV sintonizzabili. Questa piattaforma include l'ingegnerizzazione e il precondizionamento di cellule produttrici di EV (ad esempio, celle CAR-T e CAR-natural killer (CAR-NK)), l'isolamento e l'arricchimento di CAR-EV utilizzando una piattaforma di cromatografia a scambio ionico (IEX) di grado GMP (Good Manufacturing Practice), l'analisi completamente automatizzata della sottopopolazione di EV ad alto rendimento e l'analisi in vitro valutazione dell'attività citotossica funzionale di CAR-EV. La piattaforma è stata convalidata utilizzando CAR-NK-EV e CAR-T-EV per linee cellulari di tumori sia ematologici che solidi. La piattaforma CAR-EV rappresenta un approccio promettente per il rapido sviluppo di CAR-EV terapeutici pronti all'uso su misura per specifiche indicazioni di malattia, con il potenziale di ridurre gli effetti collaterali avversi associati alle terapie basate su cellule CAR.

Introduzione

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Le terapie basate su cellule CAR sono state approvate per il trattamento delle neoplasie ematologiche, tuttavia persistono sfide e limitazioni significative1. In particolare, i rischi di CRS e ICANS rimangono fattori critici nella valutazione dell'idoneità del paziente alla terapia CAR, sottolineando la necessità di continui progressi nelle strategie di trattamento2.

Le vescicole extracellulari derivate da cellule CAR (CAR-EV) sono emerse come un'opzione terapeutica allogenica più efficace e potenzialmente più sicura. Tali vescicole extracellulari offrono diversi vantaggi, tra cui una ridotta immunogenicità, un minor rischio di CRS, una maggiore infiltrazione tumorale, l'idoneità per la somministrazione ripetuta, il potenziale per terapie combinate, nonché processi di produzione e conservazione efficienti3. Le vescicole extracellulari di derivazione biologica possono essere ingegnerizzate per esprimere molecole mirate al cancro che si legano con elevata affinità a specifici recettori di superficie sulle cellule tumorali. Una volta modificati, questi veicoli elettrici di design presentano una strategia promettente per la consegna selettiva di carichi terapeutici, con il potenziale di ridurre al minimo gli effetti fuori bersaglio. Derivate da cellule CAR, queste vescicole extracellulari armate mostrano proprietà funzionali migliorate che consentono una somministrazione terapeutica più precisa e potente. Le loro caratteristiche intrinseche conferiscono molteplici vantaggi che contribuiscono collettivamente a migliorare l'efficacia del trattamento.

I due principali ostacoli all'uso efficace delle vescicole extracellulari in clinica sono la scala e l'efficacia. Le metodologie qui delineate mostrano una scalabilità intrinseca e sono facilmente adattabili in un ampio spettro di paradigmi sperimentali. L'aumento della produzione di vescicole extracellulari verso la produzione di livello clinico è un'area di sviluppo attivo, ma richiede un'ulteriore ottimizzazione per generare quantità sufficienti di materiale di livello clinico4. È importante sottolineare che studi recenti hanno dimostrato approcci promettenti per migliorare l'efficacia delle vescicole extracellulari, come il precondizionamento delle cellule madri con interleuchine (ad esempio, IL-7, IL-15, IL-21) e la generazione di vescicole extracellulari in condizioni di ipossia (1-2% O2) 5,6,7.

Lo scopo di questo studio è stato quello di indagare il potenziale terapeutico delle EV CAR mirate al recettore del fattore di crescita epidermico epidermico (EGFR) e al recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2) in vitro, utilizzando cellule di carcinoma mammario MCF-7 e cellule di leucemia mieloide K562. Le EV sono state isolate e arricchite da terreni condizionati con cellule CAR (CM) tramite IEX, caratterizzate utilizzando il tracciamento delle nanoparticelle e l'analisi Western blot e sottoposte a saggi funzionali. Le EV CAR contenenti carico citotossico endogeno hanno indotto efficacemente la morte cellulare in vitro. I dati ottenuti stabiliscono la fattibilità di una produzione mirata scalabile di EV per applicazioni terapeutiche.

Protocollo

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NOTA: Maneggiare tutte le cellule vive all'interno di un armadio certificato di biosicurezza di livello 2 (BSL-2) utilizzando DPI appropriati (ad es. guanti, camici da laboratorio). I materiali a rischio biologico, come i pellet cellulari contenenti cellule vive, devono essere decontaminati utilizzando una soluzione finale di ipoclorito di sodio (candeggina) al 10%.

1. Colture cellulari e raccolta di CM

  1. Coltura di cellule CAR
    NOTA: Sebbene le cellule CAR trasdotte lentivirali utilizzate in questo studio siano state esternalizzate, il protocollo rimane applicabile alle cellule CAR-T/NK generate internamente tramite tecniche standard di ingegneria cellulare.
    1. Mantenere le cellule CAR NK/T in coltura priva di xeno (terreno di crescita integrato con 100 UI/mL di IL-2) a una densità di 0,5-1 x 106/mL, in una camera umidificata a 37 °C (5% CO2, 21% O2). Monitorare ogni 2-3 giorni e limitare il numero di celle a 3 volte alla settimana a causa dei limiti di capacità di passaggio.
    2. Confermare l'espressione di CAR tramite microscopia, assicurandosi che le cellule siano fluorescenti (se opportunamente etichettate). Le cellule in grumi sani sono indicative di una robusta coltura cellulare CAR.
  2. Collezione CM
    1. Una volta che le colture cellulari raggiungono l'80% di confluenza, valutate la vitalità cellulare e determinate la densità delle cellule vive tramite l'analisi automatizzata del conteggio delle cellule in blu di tripano.
    2. Centrifugare le celle a 300 × g (temperatura ambiente) per 5 minuti fino a formare un pellet.
    3. Raccogliere con cura il surnatante e centrifugare a 3.000 × g per 10 minuti a 4 °C per chiarificare.
    4. Conservare il CM chiarificato a -80 °C fino al momento dell'arricchimento EV.

2. Isolamento e arricchimento delle vescicole extracellulari

NOTA: I seguenti metodi delineano due approcci per l'arricchimento delle vescicole extracellulari (EV): il metodo IEX, sviluppato per l'isolamento delle vescicole extracellulari per l'analisi funzionale in vitro, e il metodo ad alto rendimento per la cattura del pan-esosoma, ottimizzato per gli studi di caratterizzazione a valle.

  1. Arricchimento dei veicoli elettrici CAR funzionali tramite IEX
    NOTA: Tutte le specifiche volumetriche sono espresse in termini di volume della colonna (CV), che riflette la relazione proporzionale tra i volumi dei reagenti e il volume del letto di resina all'interno della colonna cromatografica.
    1. Portare la colonna IEX (vedere la tabella dei materiali per i dettagli della colonna utilizzata) a temperatura ambiente (RT) lasciandola riposare per 15 minuti prima dell'uso. Aggiungere 10 CV di tampone di rigenerazione, seguito dall'equilibratura con un tampone di equilibrazione isotonica da 10 CV (a pH 7,4) (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli dei tamponi).
      NOTA: Non lasciare che la colonna funzioni a secco per lunghi periodi. Tenere sempre la colonna in posizione verticale.
    2. Scongelare il CM e farlo passare attraverso un filtro in polietersulfone (PES) da 0,22 μm.
    3. Aggiungere il campione nella colonna equilibrata (fino a 31,2 CV), seguito da 10 CV di tampone di lavaggio isotonico (a pH 7,4). Aggiungere 2,5 CV di tampone di eluizione ipertonica (vedere la Tabella dei materiali) e raccogliere il flusso, poiché questo è il campione di eluato EV.
    4. Eseguire uno scambio tampone sull'eluato EV utilizzando filtri centrifughi di ultrafiltrazione disponibili in commercio (cutoff 30 kDa) e una soluzione isotonica come diluente, garantendo un fattore di diluizione minimo di 100x. Il volume target dopo lo scambio del buffer può essere determinato dall'utente in base ai propri parametri sperimentali.
    5. Eseguire una fase finale di filtrazione utilizzando un filtro da 0,22 μm per sterilizzare le vescicole extracellulari arricchite per i saggi funzionali in vitro .
    6. Determina la distribuzione dimensionale, la concentrazione e la resa dei CAR-EV utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA)8,9.
  2. Isolamento EV pan-esosoma ad alto rendimento (tramite sistema di purificazione automatizzato, eseguito a temperatura ambiente (RT)), per la caratterizzazione di una serie limitata o ampia di campioni10,11.
    1. Preparare tre piastre a 96 pozzetti profondi (DW) con 1 mL di 1x PBS per pozzetto.
    2. Creare una piastra di "eluizione" aggiungendo 35 μl di tampone dodecil solfato di sodio (SDS) all'1% a ciascun pozzetto.
    3. Preparare una piastra di "legame" contenente 1 mL di campione CM e 30 μL di perle di cattura pan-esosomiale EXO-NET per pozzetto.
    4. Configurare le seguenti impostazioni sul sistema di isolamento automatizzato:
      1. Passaggio 1: Suggerimento per il prelievo: assicurarsi che il protocollo di isolamento inizi con lo strumento che attiva un pettine a punta profonda 96 pozzetti per consentire la manipolazione delle microsfere magnetiche durante tutto il processo di isolamento.
      2. Fase 2: Assicurarsi che il campione CM e le microsfere magnetiche siano miscelati in condizioni continue di bassa velocità per 30 minuti per consentire una cattura efficiente delle vescicole extracellulari sulle particelle magnetiche. Dopo la miscelazione, sono inclusi 5 cicli di 30 s ciascuno per garantire la cattura delle perle magnetiche.
      3. Fase 3: Assicurarsi che ciascuna delle tre fasi di lavaggio utilizzi una miscela delicata a bassa velocità di 30 s per rimuovere i contaminanti non specificamente legati, preservando l'integrità delle vescicole extracellulari legate. Come in precedenza, la fase si conclude con 5 cicli di 30 s ciascuno per catturare le perle magnetiche.
      4. Fase 4: Eluizione proteica EV (lisi): assicurarsi che le EV legate vengano lisate per il recupero delle proteine attraverso un processo a due fasi. Una miscelazione iniziale per 30 s (miscelazione dal basso) viene eseguita prima di un'incubazione per 7 minuti e 30 s in uno stato di pausa, con la posizione del puntale mantenuta sopra il pozzetto. Una volta trascorso il tempo, c'è un secondo 30 s di miscelazione e pausa per altri 7 minuti e 30 s. Infine, vengono incorporati 5 cicli di 30 s ciascuno.
      5. Passaggio 5: a questo punto, assicurati che il contenuto proteico sia nel tampone, mentre le perle sono attaccate alla punta. Dopo la fase di eluizione, il pettine di punta usato viene scartato, completando il protocollo.
        NOTA: Le perle Pan-Exosome Capture di EXO-NET contengono una soluzione conservante allo 0,05% (p/p). Sebbene non siano classificati come pericolosi ai sensi delle normative OSHA (Occupational Safety and Health Administration), durante la manipolazione devono essere utilizzati dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati, soprattutto nel contesto dei biofluidi.

3. Caratterizzazione delle vescicole extracellulari tramite western blotting

NOTA: I CAR-EV sono stati caratterizzati da Western blot (Granzyme B e Calnexin), rispetto alle cellule come controllo.

  1. Preparare lisati cellulari aggiungendo 10 μl di tampone 1x per saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) (con inibitori della proteasi) per 1 × 106 cellule. Incubare con ghiaccio per 30 minuti, quindi centrifugare a 14.000 × g (4°C) per 15 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Le vescicole extracellulari possono essere lisate utilizzando lo stesso tampone o l'1% di SDS.
  2. Quantificare la quantità di proteine utilizzando il dosaggio dell'acido bicinchoninico (BCA) (o un nano spettrofotometro adatto).
  3. Assemblare un gel di poliacrilammide SDS al 4-12% in un apparecchio per elettroforesi seguendo il protocollo del produttore. Preparare i lisati proteici utilizzando il tampone di Laemmli.
    NOTA: I sistemi di gel possono variare in base alla marca
  4. Caricare 5 μg di campione in ciascun pozzetto e far funzionare i gel a 200 V per 20 minuti.
  5. Eseguire un trasferimento occidentale utilizzando membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF), bloccando i blot con albumina sierica bovina (BSA) al 5% in 1x soluzione salina tamponata con Tris con Tween 20 allo 0,1% (1x TBST) successivamente.
  6. Incubare i blot in anticorpo monoclonale primario (Granzyme B e Calnexin, diluizione 1 su 500 in una soluzione di BSA al 5% in 1x TBST), stagnante (non agitante) e per una notte a 4 °C.
  7. Il giorno seguente, lavare i blot 3 volte per 5 minuti ciascuno con 10-15 ml di 1x TBST prima di incubare in anticorpi secondari (specie-dipendenti, 1 su 1.000 diluizione in una soluzione di BSA al 5% in 1x TBST per 1 ora a RT). Rileva le bande utilizzando la chemiluminescenza avanzata (ECL), con immagini acquisite tramite una fotocamera digitale CCD (Charged-Coupled Device).

4. Saggio funzionale (tramite MTS)

NOTA: La citotossicità è stata valutata mediante saggio in vitro MTS [(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carbossimetossifenil)-2-(4-solfofenil)-2H-tetrazolio], in cui le cellule riducono il composto tetrazolio in un prodotto solubile di formano colorato, misurabile a 490 nm di assorbanza. Le cellule del carcinoma mammario MCF-7 e K-562 sono state trattate fino a 3 giorni in tre esperimenti indipendenti con concentrazioni crescenti (0-500.000 particelle/cellula) di CAR-EVs.

  1. Semina 5.000 cellule riceventi per pozzetto (50 μL/pozzetto) in una piastra da 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Riservare una colonna per il terreno vuoto (per la sottrazione del fondo del reagente MTS). Evitare i pozzetti perimetrali, riempiendoli con 200 μL di acqua sterile.
    NOTA: Le cellule aderenti devono essere piastrate con un giorno di anticipo per garantire l'adesione cellulare alla superficie della piastra prima del trattamento.
  2. Aggiungi EV in quantità crescenti (ad esempio, 2,5 x 105 e 4,5 x 105, o 0,5, 0,75 e 1 milione di EV per cella). Includi controlli: "No EV", 1x PBS "EV buffer" e un controllo positivo dell'uccisione cellulare (ad esempio, un inibitore di piccole molecole specifico per il bersaglio o TX-100 allo 0,1%).
  3. Incubare le cellule in camera umidificata a 37 °C (5% CO2, 21% O2) per 2-3 giorni.
  4. Al momento del trattamento designato, esaminare le cellule al microscopio. Aggiungere il reagente MTS (20 μl per ogni 100 μl di coltura per pozzetto). Incubare tra 1-4 ore, misurando l'assorbanza utilizzando un lettore di piastre a 490 nm, ogni ora.
  5. Sottrarre la lettura dell'assorbanza del mezzo bianco per l'analisi dei dati. Calcola le statistiche utilizzando il test t di Student per confronti a due gruppi o l'ANOVA unidirezionale con confronti multipli per tre o più gruppi.

Risultati

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Nella Figura 1 è illustrato un tipico flusso di lavoro della coltura cellulare CAR T/NK, seguito dall'isolamento, dalla caratterizzazione e dall'utilizzo delle vescicole extracellulari in un saggio funzionale. Il CM derivante dalla coltura di cellule CAR T/NK viene raccolto, prima dell'arricchimento delle EV e della caratterizzazione a valle (compresa l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle) e l'attività funzionale viene valutata tramite un saggio MTS su piastra multipozzetto (Figura 1).

Le cellule CAR marcate con GFP possono essere visualizzate al microscopio per confermare l'espressione del costrutto CAR in coltura. La microscopia deve essere eseguita come fase di routine prima e durante la raccolta del CM per garantire una sufficiente efficienza di trasduzione. È importante sovrapporre i canali del campo chiaro e della GFP per catturare la potenziale autofluorescenza quando si valuta l'efficienza. Da notare che le cellule T possiedono una tendenza ad aggregarsi naturalmente (osservata in modo simile nelle cellule NK; dati non mostrati) e la fluorescenza può essere chiaramente osservata quando le cellule mostrano un fenotipo aggregato (Figura 2).

Dopo l'arricchimento delle vescicole extracellulari, le vescicole extracellulari possono essere caratterizzate tramite NTA e immunoblotting occidentale. Utilizzando l'NTA, l'analisi della resa delle particelle può confermare un aumento della concentrazione nelle vescicole extracellulari isolate, rispetto alla CM (Figura 3A). I dati del Western blot confermano ulteriormente l'espressione del marcatore citolitico granzima B nelle cellule CAR e nelle EV, e l'assenza di calnexina in queste ultime, il che conferma l'assenza di materiale cellulare nelle preparazioni. HEK293T celle sono incluse come controllo CAR-negativo (Figura 3B).

L'analisi della funzionalità delle vescicole extracellulari è stata eseguita tramite il saggio MTS per determinare la vitalità/capacità di proliferazione cellulare. L'effetto di EGFR e CAR-EV mirati a HER2 sulla vitalità e la crescita delle cellule tumorali del sangue MCF-7 e K562 è determinato dalla misurazione del reagente colorimetrico MTS ad un'assorbanza di 490 nm (dopo la rimozione del segnale di fondo). In questo esempio, l'EGFR mirato ai CAR-EV ha ridotto la vitalità delle cellule MCF-7 e K562 rispettivamente del 70% e del 40%. L'HER-2 che prende di mira i CAR-EV ha ridotto l'MCF-7 del ~10% (come determinato tramite il t-test di Student). Considerando il layout sperimentale, l'impiego di un test non parametrico (ad esempio, Mann-Whitney U) può offrire intuizioni più solide negli studi successivi (Figura 4).

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Figura 1: Generazione, arricchimento, caratterizzazione delle EV e lettura funzionale dei veicoli elettrici CAR-EV. Diagramma schematico che illustra un flusso di lavoro tipico della generazione, produzione e caratterizzazione di veicoli elettrici di campioni CAR-EV arricchiti prima dell'analisi della funzionalità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Analisi microscopica rappresentativa mediante conferma dell'espressione di GFP nelle cellule CAR-T bersaglio di HER2. Le immagini sono state acquisite tramite microscopia a fluorescenza, utilizzando un obiettivo 20x. La barra della scala bianca rappresenta una lunghezza di 50 μm. Le cellule T hanno una tendenza naturale a crescere in grumi prima del distacco in singole cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Caratterizzazione di celle CAR ed EV. (A) Analisi delle particelle di nano-tracciamento di CAR-T CM e EV arricchite. La concentrazione di particelle di EV era 1,6-2,1 volte maggiore di quella di CM, mentre la concentrazione di proteine era ridotta del >80%. Le differenze statisticamente significative sono state testate con l'ANOVA unidirezionale e il test di confronto multiplo di Tukey; p≤ 0,001, **** p≤ 0,0001. (B) L'analisi Western blot delle cellule T trasdotte e delle CAR-EV arricchite ha confermato la presenza del granzima B citolitico sia nelle cellule CAR che nelle EV, mentre un'assenza è stata osservata in HEK293T cellule non CAR. La calnexina non è stata rilevata in CAR-EV, indicando una bassa contaminazione da particelle del reticolo endoplasmatico. Carico proteico per corsia = 5 μg. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Effetto delle CAR-EV sulla vitalità delle cellule bersaglio (cellule di carcinoma mammario MCF-7 e linea cellulare di leucemia mieloide cronica K562). Le cellule bersaglio sono state trattate con una singola dose di 4,5 x 105 e 2,5 x 105 EV/cellula (EGFR o HER2 CAR, rispettivamente) o di controllo (tampone EV) per un massimo di 3 giorni. (A) Cellule CAR-EVs bersaglio per EGFR. (B) CAR-EV che hanno come bersaglio HER2. In entrambe le linee cellulari è stata osservata una diminuzione della lettura dell'assorbanza (indicativa dell'efficacia del trattamento). I dati rappresentano l'assorbanza media ± SD (n = 3), analizzata utilizzando un t-test di Student non accoppiato a due code, con valori p che indicano significatività statistica; ** pag≤ 0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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La combinazione della comprovata efficacia della terapia CAR con i promettenti vantaggi della terapia basata su vescicole extracellulari (EV) può migliorare l'efficacia dei trattamenti antitumorali, come dimostrato in studi mirati ai tumori della mammella e del polmone12,13. L'approccio terapeutico CAR-EV affronta gli attuali limiti della terapia CAR, come le difficoltà di somministrazione e la tossicità associata, sfruttando al contempo la biocompatibilità e le capacità di targeting delle EV. L'integrazione di queste modalità può facilitare lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per il cancro, ampliando le opportunità per l'applicazione delle vescicole extracellulari in ambito clinico. Inoltre, l'ingegnerizzazione e l'arricchimento delle vescicole extracellulari funzionali forniscono un metodo più sicuro (attraverso l'incapsulamento del carico citolitico) e più preciso (cioè l'aggiunta di domini di puntamento) per la consegna di carichi terapeutici, in particolare in luoghi difficili come il nucleo tumorale, il midollo osseo e le aree protette da barriere come la barriera emato-encefalica o la barriera emato-testicolare 14,15,16. Nonostante il metodo consolidato di arricchimento delle vescicole extracellulari mediante ultracentrifugazione, permangono diverse limitazioni. I vincoli notevoli includono: scalabilità, co-isolamento delle impurità e resa limitata in post-produzione17. C'è una chiara necessità di migliorare i processi per generare vescicole extracellulari terapeutiche su larga scala.

Questo studio proof-of-concept dimostra che IEX è un metodo scalabile ed efficace per produrre, isolare e arricchire CAR-EV funzionali, utilizzando come input CM chiarificato da cellule che esprimono CAR. IEX consente un'elaborazione ad alto rendimento e supporta sia la ricerca che la produzione su scala cGMP, consentendo il controllo della qualità durante l'intero flusso di lavoro, dalla generazione di EV al test del prodotto farmaceutico finale18,19. Sebbene la caratterizzazione delle vescicole extracellulari sia essenziale per confermare la funzione, la resa può variare in modo significativo a causa delle differenze nel volume del campione, nella concentrazione di input e nelle proprietà specifiche delle vescicole extracellulari, come la carica superficiale e le proprietà di legame. I dati interni che utilizzano celle MCF-7 mostrano una resa media di pre-purificazione di ~2,85 × 108 particelle/mL, con concentrazioni post-purificazione tipicamente comprese tra 3 × 1011 a 1 × 1012 particelle/mL. Questi livelli possono essere regolati modificando il volume di risospensione durante lo scambio del buffer per soddisfare le esigenze a valle. Data questa variabilità, gli utenti sono fortemente incoraggiati a ottimizzare il protocollo con CM pertinente alla loro configurazione sperimentale, per garantire rendimenti riproducibili e robusti.

Diverse fasi all'interno del protocollo sono fondamentali per il successo della produzione di CAR-EV, con particolare enfasi sulle fasi di caricamento del campione e di eluizione. Questi passaggi influenzano direttamente l'efficienza della cattura delle EV da parte della colonna e, di conseguenza, la resa complessiva. La fase di sostituzione del tampone è fondamentale, poiché la rimozione incompleta dei soluti in eccesso può compromettere la stabilità delle vescicole extracellulari, portando alla degradazione nel tempo. Le EV possono quindi essere caratterizzate utilizzando metodi come NTA o profilazione proteomica. Se i CAR-EV sono destinati a saggi funzionali, come studi di captazione cellulare o interventi terapeutici, la sterilità è della massima importanza. Un'ultima fase di sterilizzazione "terminale" (0,22 μm) è essenziale per prevenire la contaminazione microbica, che può confondere i risultati sperimentali o comportare rischi per la biosicurezza. Alla luce di questi fattori, si consiglia vivamente agli utenti di prestare particolare attenzione durante queste fasi per mantenere la riproducibilità e l'integrità funzionale della preparazione finale della vescicola extracellulare.

Potrebbero essere necessarie diverse modifiche al protocollo per risolvere i problemi comuni riscontrati durante la produzione di CAR-EV. La bassa resa è più comunemente causata da un carico non ottimale di CM, superiore o inferiore alla capacità di legatura della colonna. Per determinare il volume di input ottimale, è consigliabile condurre uno studio di titolazione CM, aumentando in modo incrementale il carico per identificare il punto di massimo recupero EV. L'intasamento del filtro, tipicamente osservato durante la fase finale di filtrazione sterile, spesso deriva da un'eccessiva concentrazione e viscosità del campione, che possono favorire l'aggregazione delle vescicole extracellulari. In questi casi, si raccomanda di diluire la preparazione finale della vescicola extracorporea. Se la diluizione non è fattibile, la filtrazione sterile può essere eseguita prima della sostituzione del tampone; Tuttavia, questo approccio richiede che tutte le fasi successive siano condotte in condizioni rigorosamente asettiche per mantenere la sterilità.

Lo sviluppo di vescicole extracellulari come terapie antitumorali richiede processi di produzione riproducibili e una solida convalida della loro efficacia contro le linee cellulari tumorali bersaglio. Una limitazione comune dell'IEX nell'arricchimento delle EV è il co-isolamento di particelle non EV, una sfida identificabile attraverso l'analisi a valle di marcatori specifici per le EV e riducibile tramite un'ulteriore ottimizzazione del CM. La caratterizzazione delle vescicole extracellulari con rilascio di controllo dovrebbe includere: NTA per determinare il numero e la dimensione delle particelle e la concentrazione di vescicole extracellulari dopo l'arricchimento; analisi genetica e trascritta dell'espressione dei costrutti CAR; determinazione dell'espressione cellulare e proteica EV del CAR, biomarcatori EV canonici e marcatori citolitici (es. granzima B e perforina); ed effetti on- e fuori bersaglio. L'incorporazione di tecniche aggiuntive, come la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), fornirà una convalida morfologica per integrare la caratterizzazione basata sulle dimensioni, supportando un'analisi più completa. Per mantenere il controllo di qualità, i prodotti EV devono essere sottoposti a test di contaminazione da micoplasma ed endotossine per verificarne la sterilità e l'idoneità alla produzione clinica. L'impiego di formulazioni adeguate per la conservazione a lungo termine di CAR-EV funzionali può offrire opportunità per migliorarne la stabilità, compreso il mantenimento della qualità, della quantità e dell'efficacia terapeutica. Una valutazione coerente delle prestazioni funzionali è essenziale per garantire l'integrità del prodotto. In particolare, il test MTS utilizzato in questo studio offre una valutazione indiretta della citotossicità attraverso la misurazione dell'attività metabolica. Gli studi futuri trarrebbero vantaggio dall'integrazione di saggi standardizzati di citotossicità, come il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH), la colorazione con annessina V/PI o il profilo di attivazione delle caspasi, per delineare gli effetti citotossici in modo più accurato. Inoltre, l'incorporazione di comparatori di cellule CAR (non incorporati nel presente studio a causa di limitazioni di approvvigionamento) da soli o in combinazione con CAR-EV, e l'inclusione del trattamento parallelo di linee cellulari non tumorali di controllo, potrebbe approfondire il valore interpretativo dei risultati.

Questo studio evidenzia il potenziale utilizzo delle EV EGFR/HER2 CAR come strategia terapeutica praticabile per tumori specifici. Il miglioramento dell'efficacia delle vescicole extracellulari CAR può essere ottenuto attraverso il dosaggio multiplo o la pre-attivazione delle cellule T madri per aumentare la citotossicità. Inoltre, i progressi negli approcci emergenti, come i carichi di siRNA, e i miglioramenti nella capacità di legare EGFR/HER2 offrono opportunità per perfezionare la progettazione di queste piattaforme terapeutiche20,21. La promettente applicazione dei doppi recettori chimerici dell'antigene (dual-CAR) nella terapia cellulare offre un'ulteriore opportunità di avanzamento. Estendere l'uso delle CAR duali attraverso l'utilizzo delle loro controparti EV nelle terapie potrebbe essere un passo fondamentale per ampliare la loro portata terapeutica e migliorare le modalità di trattamento22,23. Il monitoraggio in tempo reale della citotossicità delle cellule tumorali guidate da CAR EV (ad esempio, attivazione della caspasi 3/7, lettura dell'impedenza) fornisce informazioni preziose per determinare i regimi di dosaggio ottimali, facilitando la traduzione semplificata in future applicazioni in vivo.

Dichiarazioni

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Asari K, Chelvaretnam C, Mom KT, Bhuiyan S, Pham Q, Fitri A, Palma C, Shojaee M, Khanabdali R, Hinch L e Rice G sono dipendenti di INOVIQ Ltd.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare Siena Barton, Hiba Rashid, Sara Nikseresht, Shayalini Wignarajah e Abel Sujeev per il loro contributo al laboratorio. Gli autori ringraziano tutti i collaboratori interni ed esterni, con questo studio sostenuto e finanziato da INOVIQ Ltd.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiali
1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4Gibco10010049Arricchimento EV
1% dodecil solfato di sodio (SDS)SigmaL3771-100GSciogliere 1 g di polvere SDS in 10 ml di acqua ultrapura
1x soluzione salina tamponata tris con Tween-20 (TBST)Termo Chimica ScientificaJ77500. K2Diluire con acqua ultrapura per ottenere una soluzione 1x (in alternativa, preparare una soluzione di polisorbato-20/Tween-20 allo 0,1% in 1x soluzione salina tamponata tris)
Micropiastra a 96 pozzetti in polistirene trasparente a fondo piatto trattato TC, sterileCorning3595In vitro test funzionale
Bolt Bis-Tris Plus Mini Gel Proteico, 4-12%, 1,0 mm, formato WedgeWellInvitrogenCaratterizzazione di celle/EV
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichCodice A9647-100GCaratterizzazione di celle/EV
Anticorpo CalnexinaSegnalazione cellulare2433SCaratterizzazione di celle/EV
Celle CAR-NK/TProMab BiotecnologieVariaIl dominio di legame del ligando extracellulare CAR dipende dal bersaglio preferito sulle cellule riceventi
CellTiter 96 AQueous One Solution Saggio di proliferazione cellulare (MTS)PromegaG3580In vitro test funzionale
Cocktail di inibitori della proteasi cOmplete, Mini, senza EDTARoche11836170001Lisi cellulare
Reagente per la rilevazione di Western blotting ECLAmershamRPN2232Caratterizzazione di celle/EV
Tampone di eluizioneINOVIQArricchimento/isolamento EV
Tampone di equilibraturaINOVIQArricchimento/isolamento EV
Colonna EXO-ACE IEXINOVIQArricchimento/isolamento di EV per saggi funzionali a valle
ID brevetto AU2024901931
Perle di cattura pan-esosomiale EXO-NETINOVIQIsolamento EV per la caratterizzazione a valle
ID brevetto WO/2014/011673
Anticorpo Granzyme BSegnalazione cellulare4275Caratterizzazione di celle/EV
IL-2 Umano IS, grado premiumMiltenyi Biotec130-097-744Coltura xeno-free di cellule T/NK
iBlot 2 pile di trasferimento, PVDFInvitrogenCaratterizzazione di celle/EV
ImmunoCult-XF (cGMP)Tecnologie delle cellule staminali100-0956Coltura xeno-free di cellule T/NK
K-562ATCCCCL-243In vitro test funzionale
MCF-7ATCCHTB-22In vitro test funzionale
Unità filtro siringa Millex-GP, 0,22 & micro; mMerck MilliporeSLGPR33RSFiltrazione terminale
Tampone di rigenerazioneINOVIQArricchimento/isolamento EV
Tampone RIPA (10X)Tecnologia di segnalazione cellulare9806Lisi cellulare
Soluzione di blu di tripano, 0,4%Gibco15250061Valutazione della vitalità e della densità cellulare
Tampone di lavaggioINOVIQArricchimento/isolamento EV
Equipaggiamento
Contatore di celle automatizzatoInvitrogenContessa II FLValutazione della vitalità e della densità cellulare
Strumento di estrazione automatizzato da bancoInvitrogenSistema Apex KingFisherSistema di purificazione automatizzato ad alta produttività
Vedere il link per i dettagli del protocollo: https://www.inoviq.com/site/technology/resources
Microscopio a fluorescenzaZeissAxio Observer 7Coltura cellulare
Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA)Particle Metrix GmbHZetaview PMX-130Analisi delle particelle
Lettore di lastreBMG LabtechSPECTROstar NanoIn vitro test funzionale
Centrifuga refrigerata da bancoBeckman CoulterAvanti J-15RColture cellulari & Elaborazione dell'arricchimento EV
SDS-PAGE mini serbatoio di gelInvitrogenCodice A25977Caratterizzazione di celle/EV
Sistema di trasferimento Western blotInvitrogeniBlot 2Caratterizzazione di celle/EV

Riferimenti

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