Articolo metodologico

Uso della microperfusione cerebrale a flusso aperto per la raccolta longitudinale di liquido interstiziale in un modello animale di glioblastoma

DOI:

10.3791/68748

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23 dicembre 2025

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1Department of Neurological Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo, le comunicazioni intercellulari alla base di molte malattie del sistema nervoso centrale, come il glioblastoma (GBM), sono notoriamente difficili da misurare e caratterizzare. Qui descriviamo procedure di microperfusione cerebrale a flusso aperto (cOFM) che possono essere impiegate per campionare componenti del liquido interstiziale in un modello animale longitudinale della GBM.

Abstract

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Le malattie del sistema nervoso centrale (SNC) si manifestano attraverso una rete complessa e dinamica di comunicazione intercellulare. Il glioblastoma (GBM), il tumore cerebrale primario più comune e aggressivo, è emblematico di questa complessità, con la sua rapida progressione e la prognosi pessima misurata in mesi piuttosto che in anni. La biologia del GBM è guidata da intricati scambi di molecole di segnalazione tra cellule neoplastiche e stromali, che sostengono la progressione aggressiva della malattia. Qui descriviamo un protocollo dettagliato di microperfusione cerebrale a flusso aperto (cOFM) nei modelli murini GBM, che consente il monitoraggio longitudinale in tempo reale della dinamica del microambiente tumorale all'interno del fluido interstiziale (ISF). Il nostro approccio descrive l'impianto di montaggi durativi per la cannula guida, il loro utilizzo per l'intrazione intracerebrale del glioma direttamente attraverso la guida e la raccolta di campioni di cOFM ad alta fedeltà per analisi metabolomiche e proteomiche LC-MS. Fondamentalmente, cOFM supera i limiti di dimensione molecolare della microdialisi tradizionale. Oltre al GBM, la metodologia cOFM promette approfondimenti trasformativi su uno spettro di disturbi del SNC, inclusi condizioni neurodegenerative, epilettiche e neuropsichiatriche, grazie alla sua capacità di fornire biomarcatori eziologici e sensibili al trattamento all'interno dei rispettivi modelli animali.

Introduzione

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Indagare sulle malattie del sistema nervoso centrale (SNC) è notoriamente impegnativo a causa della complessissa segnalazione intercellulare multimodale mediata dal liquido interstiziale (ISF)1,2,3,4. Questa complessità è particolarmente marcata nei tumori cerebrali, come il glioblastoma (GBM), dove segnali intercellulari vengono trasmessi sia tra cellule neoplastiche chestromali 5,6,7,8,9. In molti casi, lo scambio aberrante di biomolecole diverse, inclusi metaboliti e messaggeri proteici, contribuisce all'eziologia sottostante delle patologie del SNC. Questa sfida investigativa è aggravata, in particolare nella GBM, dal fatto che la composizione molecolare dell'ISF è temporalmente dinamica ed evolve durante la progressione della malattia così come in risposta ai trattamentiinterventistici 10,11.

I metodi tradizionali di indagine preclinica per la GBM includono studi in vitro e modelli animali a punto di partenza singola. La natura di questi approcci limita la loro più ampia applicabilità clinica a causa della loro incapacità di catturare sia le caratteristiche del microambiente tumorale sia i cambiamenti temporali longitudinali. I progressi compiuti nei primi anni '80 superarono queste limitazioni contestuali con lo sviluppo della microdialisi intracerebrale (cMD)12,13,14,15. Dalla sua fondazione 45 anni fa, la cMD si è affermata come il metodo standard per il campionamento longitudinale del liquido interstiziale (ISF) all'interno del cervellovivente 16. Ciò avviene tramite la libera diffusione e convezione di soluti ISF ad alta concentrazione attraverso una membrana semipermeabile in un liquido cerebrospinale (aCSF)17, a flusso continuo e a bassa concentrazione di soluti, tipicamente artificiale. Queste membrane semipermeabili sono composte da vari polimeri biocompatibili con tagli comuni di dimensione dei pori a peso molecolare che vanno da 20 kDa a 3MDa 18. Questa procedura minimamente invasiva consente la raccolta longitudinale in situ di una vasta gamma di analiti, che vanno da piccole molecole, come metaboliti o neurotrasmettitori, fino a grandi proteine, come gli anticorpi. Tuttavia, la porosità strutturale delle membrane cMD, unita alla natura adsorbtiva dei loro polimeri composizionali, può influenzare significativamente il recupero relativo degli analiti con particolari caratteristiche biochimiche o dimensionali, come lipidi o anticorpi,rispettivamente 19,20.

I progressi per superare questa limitazione delle membrane cMD sono iniziati nei primi anni 2010 con lo sviluppo della microperfusione cerebrale a flusso aperto (cOFM)21. Funzionando secondo principi generali simili a quelli del cMD, il cOFM elimina le limitazioni biochimiche imposte dalle membrane semipermeabili sostituendole con una sonda a reticolo plastico con aperture macroscopiche a bassa adsorbzione di circa 100 μm didimensione 20. Numerosi rapporti hanno dimostrato la maggiore utilità della cOFM rispetto alla cMD attraverso la raccolta di componenti rilevabili dell'ISF, inclusi ormoni peptidici, nanocorpi/anticorpi, piccole terapie lipofile e liposomiPEGilati 19,22,23,24,25. Rapporti precedenti che esaminano la reazione fisiologica del tessuto all'impianto della sonda guida cOFM mostrano che l'integrità della barriera emato-encefalica viene ristabilita entro 15 giorni dall'impianto e che non si formano cicatrici gliali fino a 30 giorni dopol'impianto 26. Grazie alla sostituzione delle membrane di microdialisi con aperture macroscopiche, i ricercatori hanno anche dimostrato la capacità innovativa delle sonde guida cOFM di facilitare l'iniezione di cellule glioma xenoinnestate nel cervello di ratti immunodeficienti, in modo che l'ingrazione e la crescita tumorale atraumatiche avvengono direttamente intorno all'area di campionamento27 di cOFM.

Le considerazioni nell'uso della cOFM nello studio delle patologie del SNC devono comunque riconoscere i suoi limiti metodologici. A causa della sua dipendenza dalla diffusione passiva e convezione degli analiti ISF in un perfuso fluente, queste limitazioni ruotano attorno alla concentrazione dell'analita e al volumedel campione 18. I componenti campionati di ISF saranno diluiti all'interno del perfuso raccolto di cOFM rispetto ai livelli endogeni, portando molte indagini a confrontare i rapporti relativi degli analiti tra condizionisperimentali 28. Le portate tipiche variano da 0,1 μL/min a 1,0 μL/min, equivalenti a soli 6 μL/h fino a 60 μL/h. Considerando i tempi di liberazione dello spazio morto dei tubi, bisogna considerare anche la durata totale del campionamento. Questo è particolarmente importante quando si esegue raccolte cOFM su animali anestetizzati, dove le preoccupazioni per il benessere animale devono essere affrontate con attenzione. Una descrizione più dettagliata di queste e altre considerazioni è disponibile in un precedente rapporto sui metodi del team di sviluppo dicOFM 29.

In questo manoscritto, forniamo un protocollo aggiornato per l'impiego del campionamento longitudinale di cOFM nello studio delle malattie neurologiche, con un focus sulla GBM. Il protocollo include passaggi per l'impianto di cannula guida cOFM, l'iniezione di cellule tumorali e l'ingertamento tramite la guida cOFM, oltre a due configurazioni di campionamento cOFM in animali svegli e in libera mobilità. Presentiamo dati rappresentativi che dimostrano gli effetti del trattamento sui componenti metabolomici e proteomici dell'ISF misurati tramite cOFM, l'impatto della configurazione del campionamento sulle concentrazioni degli analiti e l'efficacia dell'impianto di cellule tumorali guidate da cOFM.

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Protocollo

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Tutte le procedure animali all'interno di questo protocollo sono approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Northwestern University (ID protocollo: IS00021383) e seguono le linee guida del National Institutes of Health (NIH). Questo protocollo è stato sviluppato per l'uso su topi C57BL/6J, sia maschi che femmine, con un'età minima di 8-10 settimane. La linea cellulare del glioma murino utilizzata in questo protocollo, CT2A, è stata fornita dal Seyfried Lab della Boston University ed è stata coltivata e preparata dopo condizioni di coltura tissutale sterile.

1. Pianificazione e preparazione chirurgica

  1. Informazioni sugli animali: Per gli esperimenti cOFM, usa topi di almeno 8-10 settimane per consentire una crescita e uno sviluppo completi. Gli impianti cranici in posizione fissa possono spostarsi o compromettere la corretta crescita del cranio e/o del cervello ancora in fase di sviluppo.
  2. Selezione delle coordinate chirurgiche: Utilizzare un atlante cerebrale animale per localizzare le coordinate ortogonali della regione di interesse rispetto al Bregma. Ad esempio, le impiantole di cellule gliomache vengono tipicamente eseguite nello striato per replicare al meglio i microambienti nativi del GBM e massimizzare l'efficacia dello sviluppo tumorale successivo. Le coordinate guida di impiantamento del cOFM utilizzate in questo protocollo sono mediolaterali (ML) = 2,5 mm, anteroposteriori (AP) = 0 mm e dorsoventrali (DV) = 3,5 mm.
    NOTA: Le coordinate stereotiche possono variare tra ceppi di topo ed età. Si prega di utilizzare le coordinate atlante specifiche per specie e ceppi per garantire la disposizione desiderata della guida cOFM.
  3. Selezione delle configurazioni di componenti cOFM appropriate: Ordinare i componenti per configurazioni cOFM appropriate in lunghezze totali specifiche da 2 mm a 22 mm, con lunghezze di superficie aperta da 1 mm a 2 mm.
    NOTA: Gli animali possono spostare le teste guida cOFM impiantate in modo improprio durante i comportamenti di toelettatura. Per minimizzare la leva meccanica sulla montatura della testa durante questa attività, raccomandiamo di utilizzare guide non più lunghe di 2-3 mm rispetto alla distanza di coordinate DV prevista.
  4. Pianificazione dei punti temporali delle procedure chirurgiche e di campionamento per obiettivi sperimentali: a seconda della malattia di interesse e delle caratteristiche del modello, pianifica attentamente il tempismo e l'ordine delle procedure correlate alla cOFM per indagare al meglio la biologia sottostante in questione.
    1. Se si indagano differenze composizionali ISF tra microambienti cerebrali sani e tumorali, eseguire procedure di campionamento cOFM prima e dopo l'impianto del tumore nello stesso animale.
    2. Se si studiano gli effetti degli interventi clinici sulle patologie del SNC, eseguire procedure di campionamento cOFM prima e dopo la somministrazione in coorti animali parallele che ricevono trattamento di controllo o sperimentale.

2. chirurgia di posizionamento guida cOFM

  1. Assemblare strumenti chirurgici per la cOFM, guidare la chirurgia di posizionamento ( Tabella dei materiali) e sterilizzarli tramite autoclave se necessario.
  2. Preparazione al centro di lavoro chirurgico:
    1. Disinfetta l'armadietto di biosicurezza: Esegui le procedure chirurgiche all'interno di un armadietto di biosicurezza correttamente disinfettato. Attiva il flusso d'aria dell'armadietto di biosicurezza e pulisci le superfici interne con un metodo di disinfettante e pulizia approvato istituzionalmente. Fodere la superficie inferiore dell'armadietto con tende sterili.
    2. Prepara strumenti stereotattici: pulisci il telaio stereotassico con un disinfettante e mettilo nell'armadietto di bio-sicurezza. Allo stesso modo, pulire e disinfettare il trapano e il portaguide montati su stereotasso e metterli nell'armadietto di biosicurezza.
    3. Tappetino riscaldante in fase chirurgica: Utilizzare un cuscinetto riscaldante nella fase chirurgica stereotassica per fornire calore supplementare mentre l'animale è anestetizzato. Pulisci e disinfetta la superficie della borsa riscaldante e posizionala sulla struttura stereotattica dove si troverà l'animale. Accendi la borsa riscaldante a bassa temperatura e posiziona 1-2 tende sterili sopra.
    4. Posiziona strumenti chirurgici aggiuntivi e attrezzature: Posiziona asepticamente attrezzature sterilizzate aggiuntive nell'armadietto di bio-sicurezza.
    5. Configurazione della gabbia di recupero: Posizionare una gabbia pulita su una borsa riscaldante impostata alla temperatura più bassa possibile. Ogni animale dovrà essere inserito in una gabbia di recupero individuale fino a quando non sarà completamente guarito, quindi il numero totale di gabbie di recupero dipenderà dalle prestazioni e dai tempi di recupero dell'intervento.
  3. Preparazioni animali pre-chirurgiche (riassunte nella Figura 1A):
    1. Anestesia: somministrare composti e dosi anestetiche approvate istituzionalmente per raggiungere la profondità anestetica adeguata, utilizzando il test del riflesso del pizzicamento della zampa e la profondità/frequenza respiratoria per garantire un'anestesia adeguata. Ad esempio, l'iniezione intraperitoneale di cocktail ketamina-xilazina (100 mg/kg - 10 mg/kg, in soluzione salina) è sufficiente per raggiungere la profondità anestetica adeguata per topi C57BL/6J.
    2. Analgesia: somministrare composti analgesici approvati istituzionalmente per aiutare nella gestione del dolore peri- e post-operatorio. Ad esempio, l'iniezione sottocutanea di meloxicam (20 mg/kg, in soluzione salina) è appropriata per la gestione del dolore perioperatorio.
    3. Depilazione (rasatura, crema depilatoria): rimuovere i peli dal sito chirurgico previsto sulla parte superiore del cranio utilizzando un rasoio elettrico e/o una crema depilatoria. Se usi la crema depilatoria, assicurati che non rimanga troppo a lungo sulla pelle per evitare irritazioni.
    4. Pomata oftalmica: Utilizzare un applicatore sterile con punta di cotone per applicare delicatamente unguenti oftalmici su entrambi gli occhi e prevenire la secchezza corneale durante l'intervento.
    5. Collocamento dell'animale nel quadro stereotattico: Posizionare correttamente l'animale nel quadro stereotassico inserendo incisivi nel blocco di morso, inserendo le barre per le orecchie con fermezza ma delicatezza nei canali auricolari e fissando la pinza nasale sull'osso nasale dell'animale ( Figura 1B). Se posizionato correttamente, il cranio dell'animale dovrebbe essere fissato saldamente senza alcun movimento.
    6. Preparazioni per il sito chirurgico asettico: Pulire la pelle intorno all'area chirurgica con tre tamponi alternati di alcol (etil- o isopropil-) e povidone iodio per disinfettare asepticamente l'area da incisione.
  4. Preparazione dell'incisione e della superficie cranica:
    NOTA: Tutti i seguenti passaggi devono essere eseguiti nel modo più aseptico possibile. A tal fine, il chirurgo veterinario principale dovrebbe indossare guanti chirurgici sterili invece di guanti standard da laboratorio prima di proseguire verso l'incisione.
    1. Posizione e lunghezza dell'incisione: Utilizzare un bisturi sterile per eseguire un'incisione sagittale in linea mediana lungo la superficie del cranio che inizia tra gli occhi e si estende caudalmente per 8-10 mm ( Figura 1C).
    2. Retrazione della pelle: Usa pinze sterili, applicatori con punta di cotone e/o una lama di bisturi per ritrarre lateralmente la pelle dall'incisione mediana. Assicurati che sia Bregma che Lambda siano visibili e altrimenti estendi l'incisione.
    3. Incisione del periostio: Utilizzare un bisturi sterile per effettuare un'incisione nel periosto e ritraire lateralmente il tessuto con la pinza.
    4. Tampone di perossido di idrogeno: Pulire la superficie del cranio con perossido di idrogeno diluito all'1%-3% applicato con un applicatore sterile con punta di cotone ( Figura 1D). Questo aiuta anche nell'identificazione di Bregma e Lambda attraverso le suture craniche sagittali, coronali e lambdoide.
    5. Adesivo dentale autoincisibile: Utilizzare una siringa di insulina da 0,3 mL a 1,0 mL per applicare uniformemente 20-40 μL di adesivo dentale autoincisibile sulla superficie del cranio ( Figura 1D). Applica una lampada per l'incisione. Una volta stagionato, usa applicatori sterili con punte di cotone e soluzione salina per rimuovere l'adesivo in eccesso.
      ATTENZIONE: Gli adesivi dentali autoincisivi, come Bond Force, sono sostanze potenzialmente pericolose: pericolo infiammabile (GHS02: H225), pericolo per la salute (GHS07 e GHS08: H315, H319, H317, H361fd, H336) e pericolo ambientale (GHS09: H412). Si prega di seguire le linee guida locali e istituzionali per uno smaltimento corretto.
  5. Localizzare e forare i fori delle bave:
    1. Inserire una punta sterilizzata da 0,7 mm nel microtrapano e installare il trapano nel telaio stereotassico con il supporto appropriato.
    2. Individua il Bregma all'incrocio tra le suture sagittale e coronale e usa micromanipolatori stereotattici per posizionare lì la punta del trapano.
    3. Riposizionare la punta di trapano alla coordinata guida cOFM (ML = 2,5, AP = 0,0), innestare il trapano a 15.000 giri/min e forare con cura un foro di bava regolando la quadrante micromanipolatrice DV (Figura 1E). Osserva frequentemente lo spessore del cranio durante la perforazione per prevenire danni al cervello sottostante. Usa soluzione fisiologica fisiologica durante la perforazione per eliminare i detriti ossei e ridurre il calore tra la punta e il cranio.
    4. Ripeti la procedura di perforazione per ogni coordinata di viti di ancoraggio (Figura 1E). Le posizioni raccomandate per le viti di ancoraggio sono ML = 2,5, AP = -2,5 e ML = -2,5, AP = -2,5.
    5. Dopo aver praticato i fori per le bave, stacca il microtrapano e il portatrapano dal telaio stereotattico.
    6. Usa un ago da 30 G per perforare delicatamente la dura mater sotto il foro della bava guida cOFM.
  6. Installa viti di ancoraggio usando una pinza sterile e un cacciavite sterile di dimensioni appropriate (Figura 1F). A seconda del passo della filettatura della vite, l'ancoraggio è sufficiente quando la vite è inserita a una o due lunghezze di filettatura. Fai attenzione a non affondare troppo le viti di ancoraggio per evitare danni alla corteccia.
  7. Installa la guida cOFM e l'assemblaggio fittizio cOFM nel portaguida e nel supporto del supporto al telaio stereotattico. Posizionare la punta guida cOFM sopra il foro della bava (ML = 2,5 mm, AP = 0,0 mm) a un'altezza DV pari a quella del Bregma, e scendere lentamente la guida cOFM attraverso il foro della bava fino alla profondità predefinita appropriata a una velocità di 1 mm/min ( Figura 1F). Ad esempio, la profondità di posizionamento della guida cOFM con l'impianto successivo previsto di cellule tumorali è DV = -3,5 mm.
  8. Applicare l'agente cementante sulla superficie del cranio, assicurandosi che copra le aree sotto e intorno sia alle viti guida e di ancoraggio cOFM in uno strato sottile e uniforme. Usa una lampada di polimerizzazione per indurire ogni strato di agente cementante prima di applicare gli strati successivi ( Figura 1G). Continuare ad applicare l'agente cementante finché la superficie del cranio tra ciascun componente non sarà coperta, le viti di ancoraggio non saranno completamente coperte e l'area sotto la guida cOFM fino a e intorno alla scanalatura non sarà coperta. Fai attenzione a non mettere l'agente cementante sopra o vicino al cuneo di bloccaggio.
    ATTENZIONE: Gli agenti cementanti, come Tetric EvoFlow, sono sostanze potenzialmente pericolose: pericolo per la salute (GHS07: H317, H319, H335, H360). Si prega di seguire le linee guida locali e istituzionali per uno smaltimento corretto.
  9. Scollega il portaguida dalla guida cOFM e solleva lentamente il portaguida con la manopola di regolazione DV del micromanipolatore. Rimuovi il micromanipolatore dal quadro stereotattico.
  10. Distoglie l'animale dal telaio stereotassico allentando e rimuovendo prima le cuffie, allentando e ritirando la pinza nasale, poi sollevando gli incisivi dell'animale dal blocco di morso.
  11. La pelle della sutura si chiuse sopra l'agente cementante dentale, assicurando che il corpo guida del cOFM rimanga esposto. Si raccomandano suture assorbibili 4-0, come l'acido poliglicolico (PGA) o la poliglattina (Vicryl), (Figura 1H).
  12. Applica una pomata antibiotica tripla sull'area cutanea adiacente all'incisione originale.
  13. Recupero e supporto degli animali:
    1. Trasferire l'animale in una gabbia di recupero isolata (un animale per gabbia) e fornire calore supplementare tramite una borsa riscaldante impostata a bassa temperatura.
    2. Opzionale: Fornire all'animale un agente di inversione anestetica per accelerare il recupero. Ad esempio, le iniezioni sottocutanee di atipamezolo (1 mg/kg, in soluzione fisiologica salina) accelerano i tempi di recupero anestetico da circa 1 ora a circa 20 minuti.
    3. Fornire osservazione e supporto continui finché l'animale non ha recuperato abbastanza conoscenza e la posizione stronale. Non lasciare gli animali incustoditi finché non si sono completamente ripresi dall'intervento chirurgico e dall'anestesia.
    4. Una volta che l'animale si è completamente ripreso, può essere riportato in gabbie di alloggio comune insieme ad altri animali.
    5. Un giorno dopo l'intervento, fornire ulteriore supporto analgesico somministrando un analgesico approvato istituzionalmente, come il meloxicam (vedi passo 2.3.2).
  14. Consentire un tempo di recupero di 14 giorni dopo l'intervento di impianto cOFM per consentire la completa guarigione della barriera emato-encefalica prima di eseguire ulteriori procedure sugli animali.

3. Impianto di cellule tumorali intracraniche tramite guida cOFM

  1. Coltura cellulare e preparazione:
    1. Coltivare ed espandere le cellule secondo protocolli specifici per tipo cellulare. Ad esempio, cellule di glioma sintegico del topo come CT2A possono essere coltivate in piastre da 10 cm o in fiaschette T-75 contenenti DMEM con integratori al 10% di siero bovino fetale (FBS) e integratori di penicillina/streptomicina all'1%.
    2. Preparare le cellule coltivate per l'impianto secondo protocolli specifici per tipo cellulare.
      1. Ad esempio, con cellule glioma CT2A sintegeniche, rimuovere il materiale di crescita, lavare brevemente con PBS e incubare le cellule per 5 minuti in tripsina allo 0,05% (con 0,53 mM EDTA) a 37 °C.
      2. Neutralizza la tripsina con un volume uguale di DMEM contenente FBS all'1%, trasferisci le cellule in un tubo conico da 15 mL e centrifuga a 300 x g per 5 minuti a 4 °C alle celle del pellet.
      3. Rimuovere il soprantantante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS (o soluzione fisiologica). Determina il numero totale di cellule per mL con un emocitometro manuale o automatico. Centrifugare nuovamente la sospensione della cella a 300 x g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatant e risospendere in un volume appropriato di PBS (o soluzione salina) per raggiungere 50.000 celle per μL. Mettere la sospensione delle celle sul ghiaccio fino a quando non è pronta per l'impianto (passo 3.5.2).
  2. Assemblare strumenti chirurgici per la chirurgia di impianto delle cellule del tumore intracranico (Tabella dei materiali) e sterilizzare tramite autoclave se necessario.
  3. Preparazione dello spazio di lavoro chirurgico
    1. Disinfettare l'armadietto di biosicurezza: vedi il passo 2.2.1.
    2. Prepara strumenti stereotattici: pulisci il telaio stereotassico con disinfettanti e mettilo nell'armadietto di biosicurezza. Allo stesso modo, pulire e disinfettare il portasiringa montato sullo stereotasso e fissarlo al telaio stereotattico.
    3. Esegui i passaggi 2.2.3.-2.2.5. per i restanti passaggi preparatori.
  4. Preparazioni animali pre-chirurgiche:
    1. Eseguire i passaggi 2.3.1., 2.3.2., 2.3.4 e 2.3.5. per la preparazione degli animali.
  5. Impianto di cellule tumorali:
    1. Assemblaggio della siringa e dell'inserto per infusione (riassunto nella Figura 2)
      1. Immergi i connettori dei tubi con flangia nel 70% di etanolo per almeno 5 minuti.
      2. Inserire la punta di una siringa di vetro ermetica sterilizzata da 10 μL o 25 μL in un'estremità di un connettore a tubo con flange.
      3. Inserire l'ingresso di un inserto per infusione cOFM all'estremità opposta del connettore del tubo.
      4. Fissa l'insieme dell'inserto siringa-infusione nel portasiringa montato stereotaticamente.
    2. Caricare l'insieme dell'inserto siringa-infusione con un volume appropriato di sospensione cellulare. Ad esempio, caricare 3 μL di sospensione cellulare a 50.000 cellule per μL per un'iniezione totale di 150.000 cellule per animale.
    3. Sostituire l'inserto fittizio con l'inserto per infusione:
      1. Usa le pinze per rimuovere il cuneo di bloccaggio dalla guida e dall'assemblaggio del fittizio cOFM, poi solleva delicatamente il manichino cOFM dalla guida.
      2. Usa le manopole di regolazione ML e AP sul micromanipolatore per manovrare l'insieme siringa-inserto d'infusione sopra la guida cOFM. Usa la manopola di regolazione DV per abbassare con cura l'inserto d'infusione nella guida cOFM e fissarlo in posizione reinserendo saldamente il cuneo di bloccaggio con la pinza.
    4. Iniettare 3 μL di sospensione cellulare dalla siringa a una velocità di 1 μL/min. Osserva attentamente l'area intorno alla guida cOFM e all'inserto infusione per assicurarti che nessuna cella di sospensione esca dall'assemblaggio. Dopo che l'intero volume è stato iniettato, si attende un ulteriore minuto affinché la pressione intracranica si stabilizzi.
    5. Sostituisci l'inserto per infusione con un inserto fittizio.
      1. Usa le pinze per rimuovere il cuneo di bloccaggio dalla guida cOFM e dall'insieme dell'inserto infusione, poi regola delicatamente la manopola di regolazione DV del micromanipolatore per sollevare l'inserto d'infusione cOFM dalla guida.
      2. Rimetti il manichino cOFM nella guida e fissalo in posizione reinserendo il cuneo di bloccaggio con la pinza.
  6. Distoglie l'animale dal telaio stereotassico allentando e rimuovendo prima le cuffie, allentando e ritirando la pinza nasale, poi sollevando gli incisivi dell'animale dal blocco di morso.
  7. Recupero e supporto degli animali:
    1. Trasferire l'animale in una gabbia di recupero isolata (un animale per gabbia) e fornire calore supplementare tramite una borsa riscaldante impostata a bassa temperatura.
    2. Opzionale: Fornire all'animale un agente di inversione anestetica (come l'atipamezolo) per accelerare la durata del recupero, vedi passo 2.13.2.
    3. Fornire osservazione e supporto continui finché l'animale non ha recuperato abbastanza conoscenza e la posizione stronale. Non lasciare gli animali incustoditi finché non si sono completamente ripresi dall'intervento chirurgico e dall'anestesia.
    4. Una volta che l'animale si è completamente ripreso, può essere riportato in gabbie di alloggio comune insieme ad altri animali.
    5. Il giorno dopo l'intervento, fornire ulteriore supporto analgesico somministrando un analgesico approvato dall'istituzione, come il meloxicam (vedi passo 2.3.2).
      NOTA: Se si utilizzano linee cellulari luciferasi positive, è possibile eseguire imaging bioluminescente (BLI) 1-2 settimane dopo l'impianto cellulare per verificare il successo dell'ingerto tumorale. Sebbene caratteristiche fisiche come il pelo animale o la presenza sulla testa possano ostacolare la luminescenza rilevata, possono comunque essere utilizzate per fare approssimazioni approssimative della presenza o assenza del tumore. In alternativa, la risonanza magnetica può essere eseguita se le viti di ancoraggio utilizzate nel posizionamento della guida cOFM non sono ferromagnetiche e compatibili con la risonanza magnetica.

4. campionamento cOFM del liquido interstiziale cerebrale

NOTA: Data la sua dipendenza dalla diffusione passiva degli analiti, i campioni di cOFM contengono concentrazioni diluite rispetto all'ambiente endogeno ISF. Per questo motivo, sono stati proposti diversi metodi per calibrare le misurazioni del campione in modo da riflettere meglio le concentrazioni in situ 18. Questa sezione descrive due diverse modalità di campionamento. Passo 4.1. descrive la modalità di configurazione raccomandata dal produttore (da qui in poi denominata frazionata) che offre una maggiore sensibilità temporale, ma a scapito della concentrazione dell'analita. Passo 4.2. Dettaglia una modalità alternativa di configurazione che abbiamo sviluppato (da qui chiamata ricircolato) che può raggiungere una maggiore concentrazione dell'analita a scapito di una risoluzione temporale ridotta.

  1. Campionamento frazionato di cOFM (riassunto nella Figura 3A):
    1. Immergi i connettori dei tubi con flange nel 70% di etanolo per almeno 5 minuti per facilitarli l'attacco ai tubi e agli inserti di campionamento.
    2. Carica il sacchetto di perfusa con sufficiente aCSF perfusato. Ad esempio, 680 μL sono minimamente sufficienti sia per un lavaggio in linea di 20 minuti a 10 μL/min sia per un campionamento di 8 ore a 1 μL/min. Tuttavia, si raccomanda un volume minimo di 2 mL per prevenire il collasso e il malfunzionamento della sacca perfusa.
    3. Pre-riempire entrambe le linee dei tubi a spinta e a trazione con un volume appropriato di aCSF utilizzando siringhe di vetro ermetica. Ad esempio, il tubo universale push-pull low-bind ha un diametro interno di 0,25 mm e lunghezze individuali dei tubi di 100 cm. Questo corrisponde a circa 1 μL ogni 2 cm, e quindi circa 55 μL nel tubo di spinta e 100 μL nel tubo di trazione.
    4. Installare correttamente la sezione peristaltica del tubo nella testa della pompa della microperfusione come mostrato nella Figura 3A.
      NOTA: Consulta il manuale di istruzioni BASi per ulteriori istruzioni se necessario.
    5. Collega il sacchetto di perfuso alla sezione di spinta del tubo usando il connettore Luer lock (Figura 3A, componente i).
    6. Collega l'inserto di campionamento alle linee del tubo usando connettori per tubi a flangia. L'ingresso dell'inserto campione (lunghezza dell'albero più lungo) dovrebbe essere collegato all'estremità di uscita del tubo di spinta, di fronte alla linea del tubo del sacchetto in perfusione (Figura 3A, in alto a sinistra). L'uscita dell'inserto campione (albero più corto) dovrebbe essere fissata all'estremità di ingresso del tubo di trazione, parallela alla linea del tubo del sacchetto in perfuso (Figura 3A, in alto a destra). Inserire l'inserto di campionamento collegato in un tubo microcentrifuga sterile contenente 750 μL di aCSF in preparazione al lavaggio del sistema.
    7. Collegare l'ago del collettore di frazioni con un connettore per tubi a flangia alla linea di uscita del tubo di trazione (estremità opposta all'uscita dell'inserto campione).
    8. Esegui un lavaggio del sistema di tubi per 20 minuti a 10 μL/min per rimuovere eventuali bolle di gas intrappolate all'interno del sistema di tubazione.
    9. Configurazione del collettore di frazioni:
      1. Etichettare e pesare i tubi di raccolta delle frazioni, annotando ogni peso per il confronto e la validazione successiva del volume del campione raccolto. Posizionare i tubi nelle corrispondenti fessure della giostra collettore di frazioni.
      2. Attiva il collettore di frazioni e imposta le impostazioni ai valori desiderati. Esempi di impostazioni includono # dei campioni, tempo di campione (m), ritardo (ore), raffreddamento del frigorifero e modalità _cannula.
        NOTA: Lo scarico del volume di fluido nello spazio morto nel tubo di trazione che non ha mai contattato l'ISF ortotopico è approssimato da i) lunghezza e volume del tubo (circa 2 cm/μL per OFM-PP2-100-LB), ii) portata e iii) ritardo (ore). Questi parametri devono essere accuratamente considerati nell'impostazione del sistema di raccolta per garantire una corretta raccolta delle frazioni.
  2. Campionamento ricircolato di cOFM (riassunto nella Figura 3B):
    1. Immergi i connettori dei tubi a flangia al 70% di etanolo per facilitarne l'attacco su tubi e inserti di campionamento.
    2. Pre-riempire la linea del tubo di tiro con un volume appropriato di aCSF utilizzando siringhe di vetro ermete.
    3. Installa correttamente la sezione peristaltica del tubo nella testa della pompa della pompa a microperfusione.
    4. Collega l'inserto di campionamento alle linee del tubo usando connettori per tubi a flangia. L'ingresso dell'inserto di campionamento (lunghezza dell'albero più lungo) deve essere fissato all'estremità di uscita del tubo di trazione. L'uscita dell'inserto di campionamento (albero più corto) dovrebbe essere fissata all'estremità di ingresso del tubo di trazione. Inserire l'inserto di campionamento collegato in un tubo microcentrifuga sterile contenente 750 μL di aCSF in preparazione al lavaggio del sistema.
    5. Esegui un lavaggio del sistema di tubi per 20 minuti a 10 μL/min per rimuovere eventuali bolle di gas intrappolate all'interno del sistema di tubazione.
  3. Configurazione del sistema di gabbia rotante:
    NOTA: I sistemi di gabbie animali rotanti, come il Sistema Raturn, facilitano il campionamento di cOFM degli animali svegli prevenendo l'iper-avvolgimento e l'aggrovigliamento dei tubi di spinta e trazione. Questo può anche aiutare nell'automazione del campionamento cOFM eliminando la necessità di districare manualmente i tubi durante le sessioni di raccolta cOFM in tempo reale.
    1. Posiziona la lettiera pulita della gabbia in modo uniforme sul pavimento rotante e dota la gabbia di fonti di cibo e acqua facilmente accessibili.
    2. Accendi il controller di rotazione della gabbia e testa la sua attività ruotando il cavo sospeso. La gabbia dovrebbe ruotare in contro-rotazione rispetto alla direzione di rotazione trasmessa al cavo. Imposta il controller di rotazione in standby finché l'animale non è attaccato al cavo.
  4. Collegare l'animale al sistema cOFM:
    NOTA: La connessione e il distacco degli animali dal sistema cOFM sono più facilmente eseguiti mentre l'animale è sotto anestesia temporanea isoflurana. Se eseguito correttamente, questo processo non richiede più di 5 minuti per animale; tuttavia, l'uso di unguento oftalmico è fortemente raccomandato.
    1. Anestesia animale: inserire l'animale nella camera di induzione dell'anestesia con isoflurano. Inizia l'anestesia con flusso di ossigeno a 2 L/min e isoflurano impostato al 3%. Osserva l'animale fino a raggiungere un livello adeguato di anestesia (immobilizzato con una frequenza respiratoria di circa 1 respiro/s). Trasferire l'animale dalla camera di induzione alla maschera anestesica impostata a 2 L/min di flusso di ossigeno e isoflurano al 3%.
    2. Copertura animale: Inserire l'animale in una giacca di dimensioni adeguate, facendo passare completamente gli arti anteriori attraverso le ascelle e fissando saldamente la giacca lungo la schiena dell'animale (mostrato nella Figura 3C).
    3. Sostituire l'inserto fittizio con l'inserto di campionamento: Usa una pinza per rimuovere la cuneo di bloccaggio dalla guida e dal fianco e solleva con cura il manichino dalla guida. Installa delicatamente il campione, inseriscilo nella guida, poi reinserisci il cuneo di bloccaggio.
    4. Rimuovi l'animale dall'anestesia e inseriscilo nel sistema di gabbia rotante. Attacca il cavo della gabbia alla giacca degli animali e attiva il sistema di gabbia rotante.
  5. Esecuzione del campionamento cOFM:
    1. Imposta le pompe di microperfusione a 5 μL/min ed esegui un lavaggio di 2 minuti per rimuovere eventuali microbolle che potrebbero essere risultate dall'installazione dell'inserto di campionamento cOFM.
    2. Modifica le impostazioni della pompa a microperfusione alla portata desiderata correttamente per la modalità pompa (ad esempio, 1 μL/min).
    3. Attiva la modalità pompa. Se si eseguono campionamenti cOFM frazionati, si attiva il collettore di frazione.
    4. Durante le fasi iniziali del campionamento cOFM, osserva attentamente il tubo a spinta e trazione per assicurare l'assenza di bolle di gas, poiché queste comprometterebbero il corretto funzionamento della macchina e la raccolta dei campioni e potrebbero mettere in pericolo l'animale. Se si osservano bolle di gas, fermare i componenti del sistema, staccare l'animale dal sistema cOFM e rimuovere le bolle di gas tramite il lavaggio con aCSF attraverso il tubo.
    5. Durante tutta la durata del processo di campionamento cOFM, effettuare osservazioni frequenti aggiuntive del tubo cOFM e del comportamento animale. Se il comportamento animale indica cambiamenti improvvisi nella salute, fermare immediatamente i componenti del sistema e affrontare la preoccupazione per la salute animale. Consulta il personale veterinario dell'istituto se necessario.
  6. Distacco di un animale dal sistema cOFM:
    1. Disattiva il sistema della gabbia rotante e stacca il legame dalla giacca animale.
    2. Trasferire l'animale nella camera di induzione dell'anestesia isoflurana, con l'inserto di campionamento e il tubo cOFM ancora attaccati. Inizia l'anestesia con flusso di ossigeno a 2 L/min e isoflurano impostato al 3%. Osserva l'animale fino a raggiungere un livello adeguato di anestesia (immobilizzato con una frequenza respiratoria di circa 1 respiro/s). Trasferire l'animale dalla camera di induzione alla maschera anestesica impostata a 2 L/min di flusso di ossigeno e isoflurano al 3%.
    3. Sostituisci l'inserto di campionamento con un inserto fittizio: Usa una coppia di pinze per rimuovere il cuneo di bloccaggio dall'assemblaggio guida e dell'inserto di campionamento, e solleva con attenzione l'inserto di campionamento dalla guida. Reinstalla delicatamente l'inserto finto nella guida, poi reinserisci il cuneo di bloccaggio.
    4. Togliere la giacca: Stacca le chiusure dal retro della giacca dell'animale e togli delicatamente la giacca dall'animale.
    5. Recupero e osservazione dell'animale: Rimuovere l'animale dall'anestesia isoflurana e metterlo in una gabbia di recupero pulita, fornendo un'osservazione continua finché l'animale non riprende completamente conoscenza e la reclinazione sternale. Rialloggia in una gabbia domestica una volta che l'animale si è completamente ripreso.
  7. Raccolta e conservazione dei campioni:
    1. Campionamento frazionato:
      1. Rimuovere i tubi di raccolta delle frazioni dal collettore e posizionarli sul ghiaccio per il trasporto a breve termine.
      2. Pesa ogni tubo di raccolta e confronta con il peso pre-raccolta per verificare il volume del campione.
      3. Procedere con analisi a valle dei campioni di cOFM o collocarli in un congelatore a -80 °C per conservazione a lungo termine.
    2. Campionamento ricircolato:
      1. Lasciando il tubo di estrazione collegato all'uscita dell'inserto di campionamento cOFM (albero più corto), stacca dal resto dell'impianto e metti il tubo e l'inserto di campionamento in un nuovo tubo microcentrifuga pulito.
      2. Attacca un ago sterile da 18G a una siringa sterile da 1 mL a 5 mL e riempi di aria.
      3. Inserisci con attenzione l'ago nel connettore del tubo a flange all'estremità di ingresso del tubo di trazione.
      4. Assicurandosi che l'inserto campione di cOFM rimanga nel tubo della microcentrifuga, premere sullo stantuffo della siringa per espellere il volume del campione di cOFM ricircolato dal tubo di ritiro con aria. Assicurati che l'intero campione di cOFM venga espulso dal tubo di estrazione e inserito nel tubo della microcentrifuga, staccando la siringa e riempiendo di nuovo con aria se necessario.
      5. Posizionare il campione di cOFM ricircolato sul ghiaccio per il trasporto a breve termine.
      6. Procedi con analisi a valle o mettili in un congelatore a -80 °C per conservazione a lungo termine.
  8. Conservazione delle forniture di cOFM se si ripete il campionamento di cOFM nello stesso animale:
    NOTA: Il riutilizzo di materiali usa e getta cOFM, come inserti di campionamento e tubi di ingresso/uscita, non è raccomandato dal produttore.
    1. Risciacquare il tubo push-pull cOFM con circa 500 μL di aCSF sterile o soluzione salina a una velocità non superiore a 10 μL/min. Segui con un lavaggio simile di 1-2 mL di etanolo al 70%. Infine, usa una siringa da 5 o 10 mL dotata di ago da 18G e connettore per tubi a flangia per liberare il tubo con aria.
    2. Risciacquo i tubi di ingresso e uscita dell'inserto campione cOFM con 50 μL di aCSF sterile o soluzione salina utilizzando una siringa di vetro ermetica dotata di un connettore per tubi a flangia. Segui con 50 μL di etanolo al 70%. Distoglie l'inserto di campionamento cOFM dal connettore del tubo e conservalo in una fiala piena di etanolo al 70% fino a quando non sarà pronto per il riutilizzo.

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Risultati

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Varie misure valutative per determinare il successo sperimentale possono verificarsi in stadi sperimentali intermedi o culminanti, a seconda della natura specifica della patologia sottostante e del modello animale investigativo. Per gli esami sulla biologia del GBM, l'imaging bioluminescente (BLI) può essere utilizzato come misura valutativa intermedia per l'efficacia dell'ingrazione cellulare tumorale mediata dalla guida cOFM (Figura 4A). Tuttavia, questo v...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le procedure cOFM descritte in questo protocollo hanno il potenziale di rivoluzionare lo studio delle malattie del SNC grazie alla loro capacità di campionare longitudinalmente componenti endogene dell'ISF del tessuto patologico. Tuttavia, il successo investigativo dell'applicazione di questa metodologia dipende dalla corretta esecuzione di diversi passaggi critici. Tra questi, la collocazione corretta e sicura della cannula guida cOFM è una delle più importanti. Procedure chirurgiche in...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 1R01NS096376 del National Institute of Neurological Disorders and Stroke 1R01NS096376, 1R01NS112856 e P50CA221747 SPORE for Translational Approaches to Brain Cancer (A.U.A.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Punta da trapano da 0,7 mmStrumenti scientifici di qualità19008-07Foratura a foratura a bava
Siringa da 1 a 5 mLBD#309646Riciclo di perfuso per campioni
Ago da 18 GBD#305195Riciclo di perfuso per campioni
Ago da 30GBD Ultra-Fine328438Punzione della dura
Suture vicryl 4-0Dynarex9130Chiusura chirurgica
Salviette alcoliciFisherBrand22-363-750Disinfezione cutanea del sito chirurgico
Viti di ancoraggioBASiMD-1310Posizionamento della testa del cOFM
Liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)BASi (Joanneum)MD-2400Campionamento ISF
inserto fittizio cOFMBASi (Joanneum)cOFM-D- #Posizionamento della testa del cOFM
Guida cOFMBASi (Joanneum)cOFM-GD-#- #Posizionamento della testa del cOFM
portaguida cOFMBASi (Joanneum)OFM-STM-1Posizionamento della testa del cOFM
Inserto per infusione cOFMBASi (Joanneum)cOFM-I- #Iniezione cellulare
Cunei di bloccaggio cOFMBASi (Joanneum)cOFM-LOCKPosizionamento della testa del cOFM
inserto di campionamento cOFMBASi (Joanneum)cOFM-S-XCampionamento ISF
Applicatori con punta di cotoneFisherBrane22363160Assorbimento del fluido, applicazione di perossido di idrogeno
Linea cellulare di glioma topino CT2ASeyfried Lab - Università di BostonNACellule tumorali innestate
Agente cementante dentaleIvoClar595953USPosizionamento della testa del cOFM
Luce per la polimerizzazione dentaleHenry Schein5700253Posizionamento della testa del cOFM
Crema depilatoriaVeet3116875Depilazione del sito chirurgico
Rasoio elettricoWahl Clipper Corp. 8841Depilazione del sito chirurgico
Pinza a punta fineStrumenti scientifici di qualità5SFIncisione, posizionamento della vite di ancoraggio
Connettori per tubi a flangiaBASi (Joanneum)MD-1510Iniezione cellulare
Fiale di raccolta delle frazioniBASi (Joanneum)MF-5281Memorizzazione frazionata dei campioni
Siringa di vetro ermetica (25 & mu; L)Hamilton80465Iniezione cellulare
Perossido di idrogeno (1-3%)WalgreensNDC: 0363-0268-32Pulizia della superficie del cranio
Siringhe per insulina (0,3-1,0 mL) con aghi da 31GBD Ultra-Fine328438Somministrazione di anestetici e analgesici
Tubi microcentrifugheBasix02-682-002Riciclo di perfuso per campioni
Microtrapano e portaoggetti stereotaticiApparato di Harvard75-1874Foratura a foratura a bava
Giacca topoLomirMJ 02Collegamento animale con il sistema di gabbie rotanti
Tubi a basso legame OFMBASi (Joanneum)OFM-PP2-100-LBCampionamento ISF
OFM-Pump - Pompa per microperfusioneBASi (Joanneum)MPP102-PCCampionamento ISF
Unguento oftalmicoDechra211-38Lubrificazione oculare peri-sugricale
Ago di campionamento di metallo passivatoBASi (Joanneum)MW-2310Memorizzazione frazionata dei campioni
Sacchetto di perfusioneBASi (Joanneum)OFM-BAGCampionamento ISF
Soluzione fisiologica salinaMedicina in terapia intensiva & nbsp;0990-7983-03Pulizia della superficie del cranio, aiuto nella perforazione del foro delle bave
Tamponi povidone-iodoPDI HealthcareSKU B40600Disinfezione cutanea del sito chirurgico
PortasondeStoelting51633
Collettore di frazioni refrigeratoBASi (Joanneum)MD-1201Memorizzazione frazionata dei campioni
Sistema di gabbia rotanteBASi (Joanneum)AMD-R RaturnHousing automatizzato per il campionamento cOFM sveglio
Lame e manici per bisturiFisher Scientific 22079693Incisione
CacciavitePosizionamento della testa del cOFM
Adesivo dentale autoincisivo  TokuyamaPrimering della superficie cranica per agente cementante
Tappo di silicone per fiale di raccoltaBASi (Joanneum)MF-5283Memorizzazione frazionata dei campioni
Telaio sterotatticoStoelting51725

Riferimenti

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